Introduction
צמחים נמצאים בשימוש נרחב כדי לייצר סחורות מזון כגון מיצי פרות, אבל הם יכולים גם להיות מפותחים כמו פלטפורמות לייצור מוצרי הביו-פרמצבטיקה בעלי ערך גבוה יותר 1-3. בשני המקרים, עיבוד במורד הזרם (DSP) לעתים קרובות מתחיל עם החילוץ של נוזלים מרקמות כגון עלים או פירות, ואחריו ההבהרה של תמציות-לאדן החלקיקים 4,5. לייצור תרופות ביולוגיים, העלויות של DSP יכולות להסביר עד 80% מעלויות הייצור הכוללים 6,7 וזאת חלק משקפת את ההווה נטל חלקיקים גבוהים תמציות הוכנו בשיטות משבשות כגון המגון להב מבוסס 8,9 . למרות הבחירה הרציונלית של שכבות מסננות כדי להתאים את התפלגות גודל חלקיקים בתמצית יכולה להגדיל את הקיבולת מסננת ולהפחית עלויות 10,11, השיפור לא יכול לחרוג מתקרת הקיבולת המוחלטת המוגדרת במספר החלקיקים חייבים להישמר לכליחידת שטח מסנן להשיג הבהרה.
התקרה ניתן להרים אם פחות חלקיקים מגיעים לפני השטח של מסנני משובחי הרכבת הסינון, זו יכולה להיות מושגת אם חלקיקים מפוזרים הם מעורבבים עם פולימרים המכונים flocculants המקדמים צבירה להקים flocs הגדול 12. flocs כזה ניתן להיעזר הזרם עוד יותר על ידי מסנני שק גס ופחות יקר, הפחתת הנטל חלקיק שהגיע עדינה ומסננים עומק יקר יותר. חייבים להיות פולימרי פרופילי בטיחות מתאימים ליישומים שלהם, למשל עבור הביופרמצבטיקה הם צריכים להיות תואמים ייצור נאות (GMP), ובדרך כלל הם חייבים להיות מסה טוחנת> 100 kDa והוא יכול גם להיות ניטראלי או טעון 13. בעוד flocculants הניטראלי פועל בדרך כלל על ידי cross-linking חלקיקים מפוזרים גרימת הצבירה שלהם ויצירת flocs בקטרים> 1 מ"מ 11, פולימרים טעונים לנטרל את המטען של דחלקיקי ispersed, הפחתת המסיסות שלהם ובכך גרמו ממטרים 14.
הפתתה ניתן לשפר על ידי התאמת פרמטרים כגון חיץ pH או מוליכות, ואת סוג הפולימר או ריכוז, כדי להתאים את המאפיינים של תמצית 15,16. תמציות טבק pretreated עם 0.5-5.0 גרם ל -1 polyethylenimine (PEI), גדול יותר מאשר גידול פי 2 ב קיבולת עומק מסנן נמסר בתהליך 100-L טייס מידה. עלות פולימר זה פחות מ -10 € קילו -1 כך החדרתו תהליך הביאה לחיסכון בעלויות של כ -6,000 € עבור מסננים מתכלה לכל תצווה 16 או אפילו יותר כאשר הוא משולב עם עזרי מסנן מבוסס תאי 17. אף על פי כן, מודלים חזויים נדרשים להעריך את ההטבות כלכליות אפריורי של flocculants כי הכללה יכול לדרוש צעדי אחיזה של 15-30 דקות 16,18, וכתוצאה מכך עלויות השקעה נוספות לאחסוןטנקים. עם זאת, אין כיום מודלים מכניסטית זמינים שיכול לחזות את התוצאה של ניסויים כאלה בשל האופי המורכב של הפתתה. לכן, מתאים יותר עיצוב של ניסויים (DOE) הגישה 19 פותחה כמתואר במאמר זה. פרוטוקול עבור הליך האיילה הכללי לאחרונה פורסם 20.
מכשירים בקנה מידה קטנה זמינים כעת עבור הקרנת התפוקה הגבוהה של תנאים הפתתה 21. עם זאת, מכשירים אלה לא יכולים לדמות תנאים מציאותיים במהלך הפתתה של תמציות צמחים כי ממד כלי התגובה (~ 7 מ"מ עבור בארות על צלחת 96-היטב) ואת החלקיקים או flocs יכול להיות פחות מ בסדר גודל זה מזה. הדבר עלול להשפיע על ערבוב דפוסים ובכך כוח הניבוי של המודל. יתר על כן, זה יכול להיות קשה כדי להקטין תהליכים מעורבים ממטרים עקב שינויים שאינו ליניארי בהתנהגות ערבוב STA המשקעbility 22. לכן, במאמר זה מתאר מערכת הקרנת ספסל העליונה בקנה מידה עם תפוקה של 50-75 דגימות ליום, מניב תוצאות שאינן מדרגים מכרך התגובה הראשוני 20 מיליליטר לתהליך 100 L טייס מידת 16. בשילוב עם גישת איילה, זה מאפשר מודלים המנבאים לשמש אופטימיזציה תהליך ותיעוד כחלק מושג איכות-ידי עיצוב.
השיטה המתוארת להלן עשויה גם להיות מותאמת ל תרופות ביולוגיות מיוצרות בתא תהליכי התרבות מבוססת, שבו flocculants גם נבחנים ככלי לחיסכון בעלויות 23. זה יכול גם לשמש מודל המשקע של חלבוני היעד מ תמצית גולמית כחלק מאסטרטגית טיהור, כפי שמודגם עבור β-glucuronidase מיוצר קנולה, תירס וסויה 24,25. תיאור מפורט של תכונות flocculant ניתן למצוא במקום אחר 16,26 וזה חשוב לוודא כי concentr הפולימרations הם או רעיל או מתחת לרמות מזיקות במוצר הסופי 11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. לפתח אסטרטגיה ניסויית הולמת
- זהה את הפרמטרים הסביבתיים תהליך שרלוונטיים עבור ההליך הפתתה שיוקם או אופטימיזציה, כלומר אילו גורמים יש את ההשפעה החזקה ביותר על הפתתה. בדרך כלל, ישנם מספר פרמטרים כגון כך גישת DOE כמתוארת לאחרונה 20 הכרחיים בשל העדר מודלים מכניסטית.
- פרמטרים בחרו (גורמים) מבוססים על נתונים בספרות 12, ידע מוקדם וניסיון עם המערכת. גורמים אופייניים כוללים pH חיץ, מוליכות חיץ, זמן דגירה וטמפרטורה וכן סוג פולימר וריכוז 15,16,27.
- השתמש תזכור אותו (ראה סעיף 1.1) כדי להגדיר טווחים משמעות עבור כל אחד גורם ורמות מספריות עבור גורמי קטגורים.
- הגדר את תוצאות הניסוי (תגובות) להיות פיקוח להשתמש כדי להעריך את היעילות של הפתתה. בהתאם למערכת, זויכול להיות עכירות תסנין או supernatant, מהירויות שיקוע, גודל מצטבר או היכולת של מסנן עוקב 16,23,28-30.
- ודא המבחנים המשמשים למדידת התגובות הם כמותית, חזקים דיר / לשחזור כך שנתונים באיכות גבוהה וכתוצאה מכך ניתן augmented עם ניסויים שבוצעו מאוחר יותר או על ידי מפעיל אחר.
- בחר סוג DOE אריג מספר הגורמים להיחקר ואת מידת הידע צבר כבר על המערכת. השתמש בספרות זמינה לזהות סוג DOE מתאים 20.
- בחר עיצוב הקרנה אם יש מעט מידע על מערכת הפתתה להיחקר, מספר רב של פרמטרים חייב להיות מוקרן או מעט מאוד ידוע על טווח משמעותי עבור הפרמטרים. עיצובי הקרנה אופייניים הם עיצובי עצרת מלאים שבר. כלול נקודות מרכז בעיצוב אם הפרמטרים צפויים להיות להם השפעה שאינה ליניארי, למשל 19.
- בחר מתודולוגיה משטח תגובה (RSM), עיצוב מורכב המרכזי למשל (CCD) 31 או 32,33 אופטימלי, אם רק כמה גורמים עם טווח ידוע צריכים להתאפיין בדיוק.
- הגדר את האיילה עם תוכנה מתאימה, הבטיחה איכות קריטריונים אפריורי כמו השבריר של מרחב תכנון הם נפגשו 20.
2. מכינים את הניסויים הפתתה
איור 1: עבודת הפתתה תמצית צמח: סולם תהליך (משמאל) בקנה מידה מעבדתי (מימין). לאחר מיצוי חלבון עם מאגרים מימיים, חלקיקי נדחי פסולת תא ייצברו לפי התוספת של flocculants. המצרפים הוסרו מכן על ידי מפל של סינון תיק ועומק ואת היכולת של אלהמסננים יחד עם turbidities תסנין ניתן להשתמש ישירות למדוד את היעילות של הפתתה.
- לפתח נחל עבודה ניסויית כללי (איור 1).
- השתמש מערכת לפינוי שתוצאתו החלוקה באותו גודל החלקיקים הצפויה (או כבר ציינו) בקנה מידת היישום הסופי, למשל homogenizer מיוחד. במידת האפשר, לעצב דגם מוקטן למטה של חולץ כמתואר עבור המגון של עלי טבק 10.
- הגדר את כרכים לחלץ בשימוש במהלך הניסויים הפתתה (פה 20 מ"ל). בחר נפח המאפשר מספר חלקיקים נציג להיות נוכח כלי התגובה, ניסויים הפתתה למשל aliquots 20 מיליליטר ניב תוצאות לשחזור וניתן להרחבה עבור תמציות טבק המכילים ~ 7% [w / v] מוצק 34 וגדלי חלקיקים של ~ 0.5 מיקרומטר ~ 3 מ"מ 16.
- עיצוב כל פעולות ניטור-הפתתה הפוסט כך הEY מייצג את היקף היישום הסופי, מסננים בחרו למשל עם אותה התנהגות כושר הסינון כמו אלה המשמשים את היקף הייצור.
- ולטפח את הצמחים שמהם התמציות תיגזרנה.
- השתמש באותו קו הצמח, כאן Nicotiana tabacum cv. Petit הוואנה SR1, ותנאי טיפוח אשר ישמשו במהלך ייצור כפי שתוארו לעיל 33.
- אם מניות להאכיל אחרים תעובדנה, להכין מלאי מזון אלה, כך שהם מייצגים את היקף היישום הסופי, למשל להשתמש מאגרים אותנטיים, לקחת בחשבון את כל שלבי דילול במהלך התהליך ולדבוק ה- pH ומוליכות הצפויות, כאן pH 7.5 ו 30 MS מוליכות -1 ס"מ.
- כן Utilities הסינון, ומכשירי ניטור-עכירות וכלי דגימה.
- חותכים את חומרי סינון על הגדלים הנדרשים, כאן 15 x 15 ס"מ 2, אם הם לא מוכנים לנולומד e. ודא כי כל מכשירי הניטור והניתוח הם פונקציונליים ואת כל תווית דוגמיות.
- למרות אלה הם משימות פשוטות, להכין פריטים אלה בזמן כדי לוודא שהם לא יגרמו הפרעות במהלך הניסויים הפתתה בפועל. למנוע עיכובים כי הם יכולים להפריע את התוצאות נתונות הפתתה כי היא תהליך תלוי-זמן.
- הכינו פתרונות המניות flocculant. זהירות: בציוד מגן אישי מתאים בעת טיפול flocculants, כפפות למשל. החומרים יכולים להיות מסוכנים (תוויות מפגע על פי לאירופה UE 67/548 / CEE, 1999/45 / CE כוללים N, Xi או Xn). הימנע אבק עיין גיליונות נתוני בטיחות חומרים. עבודה מתחת למכסה המנוע קטר.
- בחר ריכוז המניות לכל flocculant, כאן 80.0 גרם ל -1 לשני flocculants PEI ששימשו. ריכוזים בחרו גבוהים ככל האפשר, כדי למנוע דילול מדגם בעת הוספת flocculant, אשר יפחית Concentra החלקיקיםtion ובכך להשפיע יעילות הפתתה.
- חשבון עבור כל דילול מראש המשקף את הניסוח של היצרן של הפולימר, למשל אם הפולימר מסופק כבר בתור 50% מימיים [w / v] פתרון. פתרונות המניות flocculant של 4-8% [w / v] נמצאו להיות המתאים ביותר עד כה.
- בהתחשב הנקודות שנדונו לעיל, לוודא את ריכוז flocculant אינו יוצר פתרון צמיג מאוד מעכב pipetting, דבר עלול לגרום טעויות מפני ריכוז flocculant הסופי אינו מותאם כראוי.
- השתמש באותו ריכוז המניות לכל flocculants אם אפשר כי זה יקל על ההתקנה של ערכת pipetting (2.5) ובכך להקטין את הסיכוי לטעויות.
- התאם את ה- pH ומוליכות של כל פתרון המניות flocculant כדי להתאים את התנאים של תמציות, כאן MS pH 4-10 ומוליכות 15-55 ס"מ -1. הכן מניות בודדות במשך flocculant יחיד אם מ 'עפרות מערכה אחת של תנאי pH ו / או מוליכות נבחנת הפולימר.
- הכינו פתרונות המניות flocculant טרי, לא יותר מ 48 שעות לפני השימוש. למרות הפתתה יכול להיגרם עם מניות פולימר מאוחסנות במשך יותר מ 4 שבועות, את היעילות עלולה לרדת בשל הידרוליזה פולימר בערכי pH גבוהים מדי או נמוכים מדי. עיין בתיעוד של היצרן לפרטים נוספים.
- ודא כי הפרמטרים שנבחרו עבור האיילה יכולים להיות מותאמים בדיוק עבור כל דגימה במהלך הניסוי, למשל להבטיח יש אמבטיות חימום / קירור לרשות להתאים לטמפרטורות דגירה, כאן 4 ° C, 20 ° C ו- 37 ° C. אם ערבוב במהלך הפתתה הוא במסגרת הניסוי, וודא שההתקן ערבוב הוא נציג של הסקאלה היישום הסופי מבחינת פרמטרים קריטיים כגון תשומות כוח.
- המרה בתוספת DOE לתוך תכנית Pipetting.
- המרת ריכוזי flocculant השונים להיות tesטד לתוך כרכים של פתרון המניות כי יתווספו דגימות התמצית: לחלק את ריכוזי flocculant הסופיים על ידי ריכוז המניות ולהתרבות על פי היקף המדגם המשמש בניסויים הפתתה. זהה את נפח סופי וכתוצאה הגדול, למשל אם 20 מ"ל של מדגם מעורבב עם מקסימום של 2 מ"ל פתרון המניות flocculant זה יהיה 22 מ"ל.
- חישוב כמויות של כרית ההון הנדרשת כדי לשמור על אותו נפח סופי בכל aliquots הפתתה מבוסס על הנפח הגדול ביותר של המניה flocculant להתווסף, למשל אם 0.75 מ"ל של המניה flocculant יש להוסיף מדגם מכן 1.25 מ"ל של חיץ נדרש לשמור על נפח דגימה הסופי של 22 מ"ל (2.5.1).
- לסכם את הכרכים של פתרון מניות flocculant עבור כל תנאי פולימר הפתתה לחשב את הכמויות המוחלטות של פתרון מניות דרושים האיילה.
- עלי טבק קציר ולהכין את חלץ.
- הסר את לאה שישה העליונהves (או רב ככל שעולים בהוראות התהליך) מצמח טבק של גיל מתאים, למשל 6 שבועות, ולהעביר מערכת לפינוי מתאימה כגון homogenizer או בורג בעיתונות.
- הוספת שלושה כרכים של חיץ החילוץ לכל ביומסה גרם, למשל 300 מ"ל ל -100 גרם, ומערבלים במשך 8 דקות.
- הכן תמציות פרט עם המאגרים המתאימים אם נבדקות pH ו / או מוליכות שונות. הנה, זה כרוך שמאחד את החומר הצמחי עבור 3 x 30 שניות בבלנדר או מסחטה 34.
- לחלופין, להכין את התמצית באופן מייצג את התהליך תחת חקירה.
- Aliquot לחלץ ואת מוסיף את ההצפה.
- ידני וביסודיות לבחוש תמצית במהלך ההליך כולו כדי להבטיח הדגימות הן הומוגניות עם חלוקה שווה של חלקיקים.
- דווקא לחלק את התמצית בקרב צינורות התגובה מראש שכותרתו באמצעות אחסון,20 מ"ל כאן בכל כלי. עצמי עומד 50 מ"ל צינורות לפשט טיפול והם אידיאליים עבור 20 דגימות מיליליטר.
- מוסיף את עוצמת הקול של כל חיץ חילוץ נדרש בכדי לשמור על נפח סופי הקבוע עבור כל צינור תגובה בודד באמצעות פיפטה מתאימה.
3. Flocculate הצמח מחלץ עם פולימרים שונים
- פיפטה נפח נדרש פתרון מניות flocculant, כאן 0.1-2.0 מיליליטר, על הדגימות ברצף כפי שצוין על ידי סדר ההפעלה האקראית של האיילה. לערבב ביסודיות כל דגימה מיד לאחר תוספת של flocculant ידי מדריך אינטנסיבי רעד במשך בדיוק 20 שניות.
- במידת הצורך, להתאים את זמן הרעד במשך מניות להאכיל אחרים, כדי להבטיח ערבוב יסודי, אבל בהחלט להבטיח פעמי ערבוב עקביות עבור כל הדגימות. יש לזכור כי ממושכת ערבוב עלול לגרום לשיבוש בלתי הפיך של flocs ויישומי כוח עקבית במהלך רועד יכול לעוות את תוצאות הפתתה.
- אופציונלי: שנה את ההליך המתואר לעיל עבור יישום בו זמני של שניים או יותר flocculants.
- אפשרות 1: במקום פולימר יחיד להוסיף תערובת של שניים או יותר flocculants, כאן PEI ו chitosan. השתמש שילובי flocculant שהוגדרו Doe. לשלב את היחס וריכוזים המוחלטים של הפולימרים כפרמטרים בודדים במהלך התקנת האיילה (1.1).
- אפשרות 2: הוסף שניים או יותר פולימרים ברצף כדי לחלץ.
- השתמש ריכוזי פולימר היחידים, הסוג שלהם, ואת זמן הדגירה בין כל בנוסף לחלץ, כמו גורמים נוספים במהלך התקנת Doe.
- גם להשתמש בגישה זו כדי לבדוק אם החיבור החוזר של פולימר יחיד יכול לשפר הפתתה. השתמש תוספת בשלבים לדמות התוספת האיטית של flocculant, למשל ארבעה שלבים, כל מנית 0.25 מיליליטר 80 גרמו ל -1 flocculant הוספת סרטון דק 20 מיליליטר נפח מעל 4 יכולה לחקות התוספת של flocculant עםקצב הזרימה של -1 דקות 0.25 מ"ל.
- בכל המקרים, לזהות נפח דגימה סופי מרבי חדש עבור התקנה זו על ידי הוספת הכמויות המרביות של כל flocculants אל נפח הדגימה, כאן עדיין 22 מיליליטר, ולחשב את הכמויות נדרשות פתרונות מאגרי מניות flocculant עבור התאמת עוצמת קול במידת צורך.
- דגירה דגימות עבור פעמים שהוגדרו Doe, בדרך כלל 3-30 דקות, כדי לאפשר היווצרות floc. ודא שכל תנאי הדגירה אחרים, טמפרטורה למשל, נקבעת על פי DOE.
- להתבונן היווצרות floc המסמך. רשום את ההתקדמות של היווצרות floc כנדרש, למשל כמו מ"מ של floc ליישוב לדקה ידי מדידת גובה של מוצקים התיישבו. במידת הצורך, להאריך הפתתה עבור תקופת זמן ממושכת כגון לילה.
- סנן את חלץ Flocculated.
- השתמש חומרי סינון הכין קודם לכן (2.3) כדי להבהיר את תמצית flocculated לאחר המתאיםזמן דגירה באמצעות אחסון דגימות flocculated דרך החומר המסנן לתוך צינור כלי שיט או תגובה נקיה.
- אין מחדש להשעות את flocs התיישבו לפני סינון ולהחיל את תמצית עם בקצב של ~ 300 מ"ל דקות -1 עד הפילטר, המקביל ל 3-4 שניות למדגם 20 מ"ל.
- אשר את הביצועים של צעד הסינון אם חומר שונה משמש ניסויי ספסל העליונים לעומת בתהליך הסופי מבחינת כושר סינון, למשל על ידי מדידת התפלגות גודל החלקיקים בשני סוגי מדגם 11.
- לנתח את התסנין מבחינת עכירות ו / או התפלגות גודל חלקיקים כפי תקנים המתאימים באמצעות נדרש, למשל turbidimeter.
- אופציונלי: לחזור על ניתוח לאחר פעמים דגירה ממושכת, למשל 12-24 שעות, כדי לחקור את היווצרות או יצירה מחדש של flocs יציב.
- השתמש חומרי סינון הכין קודם לכן (2.3) כדי להבהיר את תמצית flocculated לאחר המתאיםזמן דגירה באמצעות אחסון דגימות flocculated דרך החומר המסנן לתוך צינור כלי שיט או תגובה נקיה.
- ניתוח הדגימות בהתאם לתחומי Prתגובות דואר מוגדרת (1.1.3).
- קח דגימות מן filtrates ולנתח אותם פרמטרים בתגובה נוספים, כגון ריכוזי חלבונים יעד שונים או מוצרים יקרי ערך.
- אופציונלי: נתח את retentate (בעיקר מוצקים) עבור אותם פרמטרים כדי לסגור את מאזן מסה של התהליך. בפרט, לכמת את השפעת flocculants על התאוששות נוזלית על ידי השוואת מוצקי משקל הנותר לאחר דגימות מטופלים או שלא טופלו flocculant.
- אשר את איכות הנתונים ולהעביר את התוצאות לתוכנת Doe.
- חפש ערכים חריגים בנתוני התגובה שנאספו, ערכים גבוהים למשל במפתיע.
- ודא כי כל הנתונים בתגובה מיושרים כראוי עם תנאי הניסוי המתאימים להם.
- מעביר את התוצאות לתוך תוכנת DOE ולוודא הציווי בטווח הסטנדרטי אקראי אינם מתערבב.
4. הערכההאיילה
- השתמש בכלים לניתוח נתונים המובנים של תוכנת משרד האנרגיה לפתח מודל לים כפי שתואר לעיל 20.
- בחר מצב שינוי נתונים ראוי אם נדרש כדי להקל בניית מודל, כאן להיכנס 10. יחס גדול מ -10 עבור ערך בתגובה קטן מול גדול מציין כי שינוי נתונים ייתכן שיידרש. זהה את השינוי המתאים ביותר תוך שימוש בכלים סטטיסטיים המתאימים, למשל מגרש Box-Cox 35.
- בחר מודל בסיס (i) מתאים למשרד החינוך הפדרלי הנבחר (1.2) ו- (ii) מסכים עם ידע קודם על המערכת תחת חקירה מבוססת על הניתוח השונה (ANOVA) כלים של תוכנת האיילה, למשל פולינום מסדר שני לעתים קרובות מתאים יותר אל האפקט שנצפה זמן דגירה מ פולינום מסדר ראשון.
- הסר גורמים מודל מבוטל, עמ 'למשל> 0.05, או אינטראקציות גורם איטרטיבי על ידי ביטול הבחירה אותם,reby הפחתת המורכבות של מודלים והגדלת כוח הניבוי שלה.
- אשר את איכות המודל על ידי השוואת R 2, מותאם R 2 וחזה R 2 יחד עם עלילת ההסתברות הנורמלית של שאריות studentized, שאריות-vs-ריצה, חזה-vs-בפועל Box-קוקס מגרש 36. כל ערכי R 2 צריכים להיות בטווח של 0.2.
- ודא כי המודל הסופי מסכים עם הנחות היסוד של הפיזיקה התרמודינמיקה, למשל אין ריכוזים שלילי הם חזו.
- להשתמש במודל כדי לחזות תנאים נוחים ביותר עבור המערכת תחת חקירה, כאן עכירות נמוכה.
- בחר את התגובות החשובות ביותר והמדינות המועדפות עליהם, למשל עכירות מינימאלית. מערבב את הבחירות האלה על ידי מקסום פונקציה כדאית או כלים דומים, אשר תכונות מובנות של חבילות תוכנת מספר איילת 36.
- בהתאם o ביישום המיועדf המודל, אישור בחר פועל כדי לוודא את התנאים האופטימליים ו / או כוח הניבוי של המודל באופן כללי, למשל אם התנאים צפויים להיות טוב ביותר לא היה חלק האיילה הראשונית לבחור בם ניסויים ומעקב.
5. לשפר את הדגם ולבדיקת כוח הניבוי
- לצמצם את מרחב תכנון הראשוני לתנאי הפעולה הרצויים ביותר, עכירות נמוכה למשל בטווח 0-1,000 יחידות עכירות nephelometric (NTU), המבוססת על תחזיות המודל (4.2).
- הגדרת איילה חדשה בטווח מחירים זה, כולל רק גורמים אלה זוהו משמעותיים או רלוונטיים (4.1.2)).
הערה: גורם יכול להיות משמעותי מבחינת ניתוח מודל אבל לא רלוונטי לתהליך, כלומר השפעתו על תגובה היא <1% בהשוואה לזו של גורמים אחרים. - חזור על שלבים 1-5.2 עד איכות של תחזיות המודל תואם את requirements, למשל סטיית התקן של המודל כפי שצוין על ידי התוכנה מספקת ליישום המיועד. שנה את האסטרטגיה ניסיון אם נדרש חזרות אלה, למשל להשתמש רק flocculant אחד העידון.
- העבר ולאשר את התוצאות מהמודל בקנה המידה עד מידת הטייס או היקף ייצור סופי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הפתתה של תמצית טבק עם פולימרים שונים
השיטה המתוארת לעיל שמשה בהצלחה לפתח תהליך של הפתתה של תמציות טבק במהלך הייצור של נוגדנים חד שבטיים (HIV-נטרול נוגדני 2G12) לבין חלבון פלואורסצנטי (DsRed) (איור 1) 16, ומאז הועברה לחלבונים אחרים כולל לקטינים, מועמדים חיסון למלריה חלבונים היתוך (נתונים שלא פורסמו). בדרך כלל, היישום של flocculants הפחית את העכירות של תמצית צמח-מסוננים שקית מ ~ 6,000 NTU (10,000 NTU לאחר מיצוי) ל ~ 1,000 NTU. בניסוי סינון ראשוני, עיצוב IV-אופטימלי 91 וברח שמש כדי לבדוק 18 פולימרים שונים בשלושה ריכוזים שונים (כי גורם זה משפיע על יעילות הפתתה 13,27) וצופה הפתתה על perio דגירה ~ 12 שעותד (איור 2 א 'וב'). תקופת הדגירה הארוכה יכולה להיות חשובה לזהות מסגרות זמן משמעותיות עבור התהליך הפתתה. כמו כן ערכי ה- pH של 4-8 נבדקו כי אלה עשויים להיות רלוונטיים בתהליכים בעתיד בשל המאפיינים של חלבוני יעד מבוקשים 13,25,27,37. בין 18 הפולימרים נבדק, שישה נמצאו לצמצם עכירות תמצית לאחר סינון שקית בתמציות טיפוסי עם מוליכות של 25 ס"מ MS -1.
המודל היה מעודן על ידי למעט כל פולימרים יעיל בשתי חזרות ולאחר מכן כולל פרמטרים נוספים בתהליך, כגון מוליכות ב 15-45 ms -1 ס"מ טווח, זמן דגירה של 5-75 דקות וטמפרטורות של C ° 4-30, כדי ליצור מודלים מתאימים למגוון רחב יותר של תנאי תהליך. כוח הניבוי של המודל עלה לאחר כל איטרציה, וכתוצאה מכך (איור 3 א) מודל אמין מאוד. >
אחרי ארבע חזרות, את קטיוני מאוד הטעון והפולימר מסועף PEI נמצא היעיל ביותר עבור הצבירה של חלקיקים התפזרו תמציות טבק. עם זאת, את היעילות של פולימר זה ירד עם מוליכות תמצית גוברות. המאפיינים גודל המולקולה, פריצה, מבנה (קנים או ליניארי), צפיפות המטען ואת מידת התחליפיות אמין (ראשוני, שניוני, שלישוני או הרביעון) נבדקו כגורמים איילה שני הפרמטרים האחרונים היתה ההשפעה הגדולה ביותר. הפרטים דווחו במקומות אחרים 16. בהתבסס על הידע הזה של תכונות פולימר מתוצאות Doe, חמישה פולימרים אחרים נבחרו בעלי מאפיינים מולקולריים דומים PEI (צפיפות מטען> g mEq -1 ו אמין הרביעון). אחת מחמש פולימרים אלו הפגינו יעילות הפתתה גדולה יותר מוליכות גבוהה (איור 3) 11.
NT. "FO: keep-together.within-page =" 1 "> במסגרת הגישה איילה, הוא אישר כי אף אחד PEIs מושפע התאוששות המוצר תחת אחד מהתנאים נבדק אכן קיבולת של מסנני עומק משמש לאחר מכן להסיר הנותרים מוצקים התפזרו גדל בפקטור של 3.2-5.7 והגיע ~ 110 L מ -2 בהתאם לסוג המסנן. תוצאות אלו אושרו גם בתהליך בקנה מידה טייס 100 L, ב עבורו היישום של flocculants מופחת ההבהרה עלויות הייצור -related ידי> 50% ואת עלויות הייצור הכולל על ידי ~ 20%.
איור 2: יעילות של flocculants השונה בתנאי תהליך מגוונים (א). דגימות חלץ ישירות לאחר הפתתה סינון התיק עדיין יכול להופיע עכור. (ב) לאחר שהתיישב במשך כמה שעות, העכירות שלניתן להפחית דגימות אותו באופן משמעותי. עם זאת, ערכי עכירות מתקבלים מייד לאחר הסינון הם בדרך כלל עדיפים משום פעמים בהמתנה מורחבות אינן אפשריות בתהליכי ייצור בקנה מידה גדולה. (C) הפתתה הוא גם יעיל כאשר מוחלים על תמציות צמחים שנוצרו עם עיתונות בורג במקום בבלנדר כפי שצוין על ידי הנוזל האדום הברור בתחתית של 50 מ"ל הצינורות (הצבע האדום הוא בשל נוכחותם של חלבון פלואורסצנטי DsRed ). (ד) תערובות של flocculants השונה גם יכולות לגרום הפתתה.
איור 3:. דוגמנות הפתתה באמצעות גישה איילה (א) הדיוק של מודל תחזיות גדל ככל שגדל מספר פולימרים במודל הופחת מ הסינון הראשוני לעידון למרות מספר פרמטרים תהליך עלה מ tוו חמש. (ב) החלפת סוג הפולימר (כאן מאחד PEI למשנהו) כפועל יוצא של שינוי פרמטרים תהליך (כאן מוליכות) שומרת הפתתה החלקיקים יעיל המקביל עכירות תסנין נמוך בהשוואה תמצית שליטה שאינם מטופלים (קו אדום מוצק). ברי שגיאה ב A ו- B עולים סטיית התקן של תחזיות מודל. קווים אדומים המקווקווים מציינים את סטיית התקן של התמצית שאינה מטופלים (n = 10). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הפתתה של טבק תמציות מוכנה עם עיתונות בורג
התוצאות הפתתה גם הועברו מתמציות טבק מוכנים עם homogenizer עם סיכומים עם בורג-עיתונות, מחוללת התפזרו חלקיקים פחות בטווח גודל מ"מ אבל יותרחלקיקים בטווח גודל מיקרומטר. בעיצוב IV-אופטימלי 29-ריצה, הודגם כי PEI הוא יעיל גם עבור סוג זה של תמצית במגוון ריכוז דומה וכי ההתאוששות של חלבוני היעד אינה מושפעת (איור 2 ג). זה מראה (i) כי התנאים הפתתה מזוהה עבור סוג אחד של מלאי להאכיל יכול להיות במידה מסוימת הועברו מניות להאכיל אחרים, תוך חיסכון בזמן במהלך תהליך הפיתוח, וכן (ii) כי האסטרטגיה DOE ניתן להשתמש כדי לאשר עבירות זה לא רק עבור תנאי תהליך פרט אלא על מרחב העיצוב כולו.
ניסויים הפתתה עם תערובות flocculant
שילובים של flocculants יכולים להיות יעילים יותר מאשר פולימרים יחידים, למשל עקב גישור משופר יותר בין חלקיקי 12. לכן, השיטה המתוארת לעיל הותאם כדי להכיל תוספת של שני פולימרים (3.2) 26. שלושה פולימרים שאינם סינטטיים נבדקו לבד, בשילוב עם אחד את השני או בשילוב עם PEI. הפתתה היעיל ביותר של תמציות טבק הושג עם PEI לבד, אלא שילוב של PEI ו chitosan או polyphosphates יכול להפחית את ריכוז PEI הנדרש. יתר על כן, גישת DOE אפשרה לנו לזהות את שילובי פולימר היעילים ביותר כאשר השמטת PEI (עם או בלי chitosan ו polyphosphates), ובכך עוזר להגדיר תנאים הפתתה אופטימליים בתהליכים שבם PEI אינו עולה בקנה אחד עם חלבון המטרה, למשל בשל משקעים, כמו ודווח 24,25 βglucuronidase. יתר על כן, האיילה הצליחה לאפיין מרחב תכנון מורכב שלא מתקיים לגביהן מודל מכניסטי היה זמין (איור 2 ד). שימוש בכלי ANOVA של תוכנת DOE ניתן היה להבחין בין מודלים המנבאים האמינים עמיתיהם גרועי הערכה (איור 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
ההיבט החשוב ביותר שיש להביא בחשבון בעת הגדרת איילה לאפיין הפתתה חלקיקים הוא שהתכנון חייב עקרונית להיות מסוגל לזהות ולתאר את ההשפעות הצפויות או אפשריות 36,38, למשל השפעת pH, סוג הפולימר וריכוז פולימר 16. לכן, חשוב להעריך את החלק היחסי של מרחב תכנון (FDS) לפני תחילת הניסויים בפועל. FDS הוא השבריר של מרחב הניסיוני הרב-ממדי (מכוסה על ידי גורמי העיצוב, pH למשל), אשר במסגרתו ניתן לזהות הבדלים מוגדרים מראש בין שתי תוצאות ניסוי נתונות מערכת של השתנות ידועה, למשל גילוי הבדל העכירות של 250 NTU נתון השתנות של 125 NTU. FDS יכול להיות מוגברת על ידי משלים את העיצוב עם ריצות נוספות וצריך ≥0.95 עיצובים שנועדו להנחות תהליך הבקרה 36. יתר על כן, אם מספר ריצות אינו מתיר tהוא הניסוי כולו להתבצע ביום אחד, בלוקים צריכים להיות מוגדרים מראש של האיילה לתת דין וחשבון על תצווה ל-תצווה ויום-יומי השתנות. כשעובד עם חומר צמחי, הכללת ההפניה פועלת כל בלוק (למשל שאינו מטופלים שולטים) עוזרת כדי לפצות על השתנות, המאפשרת השוואה של נתונים מכמה ריצות כל מנורמל בטווח הפנייה המקביל שלהם. בהקשר זה, הגדלת מספר הריצות לשכפל DOE היא גם שימושית.
כאשר מספר גדול של פולימרים מוקרנים, רצוי להשתמש את המאפיינים הספציפיים של flocculants, צפיפות למשל מטען חשמלי ובעלי מסה מולקולרית, כגורמים מספרי דיסקרטית ולא פולימרים עצמם גורמים הקטגורי כמו. פעולה זו מפחיתה את מספר ניסויים בגלל עיצובים ניסיוניים לעתים קרובות צריך להיות משוכפל גורמים הקטגורי, בעוד רמות נוספות של גורמים מספריים רק צריך מספר קטן של ריצות נוספות. טכ המידעאוהל של הניסוי גם מעלה ומאפשר זיהוי של תכונות פולימר משפרים הפתתה, למשל צפיפות מטען גבוהה כפי שנמצאו בניסויים שתוארו כאן. העיצובים ניסיוניים CCD ו- RSM שימושיים להקים דגמים עם יכולת ניבוי גבוהה, מה שמאפשר לזהות תנאי עיבוד חזקים (בקרת תהליכים למשל להנחות) ובדרך כלל משמשים מעקב עיצובי הקרנה. אם מספר רמות גורמים וגורם תחת תוצאות חקירת האיילה עם יותר מ -400 ניסויים בודדים, זה עשוי להיות כדאי לצמצם את מספר רמות גורם או לעבור סוגי עיצוב אחרים משום שמספר המדגם כי ניתן לטפל בקלות עם הטכניקה מוצג כאן מוגבל ~ 100 ליום.
מבחינה ניסויית מבט, פולימרים חייבים להישאר יציבים תחת תנאי ניסוי שנבחרו, למשל הם אסור depolymerize ב- pH הנמוך. הכנה קפדנית של flocculantמניות במונחים של ריכוז זה נחוץ גם כדי להשיג תוצאות לשחזור דגמים באיכות גבוהה. בהקשר זה, flocculant ייתכן שיהיה צורך pretreated, כגון נפיחות פעמים או התאמת pH עבור כיטין, כדי להבטיח solubilization שלם, ובכך להשיג פתרון הומוגני. מאוד מניות צמיגות יש להימנע כי זה יכול לגרום לשגיאות pipetting בעת העברת הפולימר לחלץ. פולימרים רבים יכולים להיות השפעת חציצה חזקה המניות יש ערכי ה- pH קיצוניים, pH למשל ~ 9.5 עבור 8% [w / v] PEI. הדבר עלול להשפיע על ה- pH של התמצית אם המניות אינן מראש מותאמות יהיה לעוות את תוצאות הניסוי. לדוגמא, אם הפתתה הוא יעיל יותר ב- pH הגבוהה מתואם הלא pH מניות PEI משמש אז איילה מעלה שערה כי ריכוזי PEI גבוהים יעילים יותר. עם זאת, השפעה זו שתיגרם על ידי ה- pH הגבוה נגרם על ידי הנפח הגדול יותר של מניות שנוסף, ולא על ידי PE ריכוז הפולימר גדלr se. ריכוזי המניות בשימוש צריך גם דומה לאלה המשמשים ליישומים בקנה מידה גדולה כדי להימנע שוני תופעות דילול בין הסולמות שיכולים להשפיע על ריכוז חלקיקים וכך הפתתה. חלק flocculants מבוסס חימר כגון קאולין מכיל מספר רב של חלקיקים עצמם אשר יכולים להסוות את ההשפעה הפתתה, הפחתת עכירות למשל לאחר סינון ראשוני, ותגובות אחרות יש לבחור כדי להעריך את היעילות של חומרים אלו, קיבולת מסנן במורד למשל.
לניתוח נתונים חשוב להעריך את התוצאות שנאספו במונחים של ערכים קיצוניים, misalignments ועקביות כללית, כגון ערכים קיצוניים יכולים להצביע על שגיאה העתק-הדבק, שינוי הנקודה העשרונית או תקלה של מכשירי ציוד / אנליטי. ניתוח מעמיק יבטיח שנתונים באיכות גבוהה רק משמשים לבניית מודל. במהלך בניית מודל חשוב להעריך כל הזמן הדואר מערך רחב של אינדיקטורים איכותיים הניתנים על ידי תוכנת איילה. הקריטריונים הבסיסיים ביותר הם R 2, מותאם R 2 וחזה R 2 ערכים, אבל שאריות נורמליות, שאריות-vs-לרוץ בפועל-vs-חזה מגרשים (איור 4) הם אפילו יותר חשובים, כי הם מספקים מידע על כל סיבוב ב ניסוי ולא פרמטר סכום. יתר על כן, את העקביות של המודל הסופי ואת תחזיותיה עם המנגנונים הידועים של הפתתה צריכה להיחקר תמיד. פערים גדולים בין תחזיות וציפיות מדעיות עלולים להתרחש בגלל מודלי Doe הם רק תיאורים ולא מכניסטית, מודלים למשל יכולים לחזות ערכים קיצוניים בשוליים מרחב עיצוב המשקף את השימוש באלגוריתמים הולמים פולינום.
איור 4:. מדדי איכות של מודלי DOE לאrmal חלקת שאריות studentized צריכה להידמות בקו ישר ככל (א) האפשרי עם סטיות קלות בלבד (חצים ירוקים) מקובל מודלים באיכות גבוהה. הופעה מעוגלת (C) עם סטיות חזקות (חצים אדומים) מקו האידיאלי (אדום) מצביעה על מודל עני, למשל עקב חסרי גורמים משמעותיים. בסופו של דבר, חזה ניסיוני (בפועל) ערכים צריכים להתאים (ב ') שוב אחרי קו ישר. סטיות מקו האידיאלי (העיגול אדום הקו מקווקו) מצביעות תחזיות מודל עלובות (ד '). נא ללחוץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
הגישה DOE יכול לעזור לאפיין הפתתה במניות להאכיל מורכבים כגון תמציות צמחים, גם אם אין נתונים קיימים. הפתתה של תמציות טבק הייתה מותאמת עם עומס עבודה של 2 אנחנוEKS ועלויות המתכלות של ~ 500 €. זה הפחית את מספר מסנני עומק נדרשים לאפיית טייס בקנה מידה יחידה המעורבת ~ 800 ליטר של תמצית צמח ב -60%, אשר השיגו ירידה המקבילה עלויות מתכלה.
Flocculants גם יושמו תמציות צמחים שונים כדי homogenates תרבית תאים. למרות באותו flocculant היה יעיל עבור כל מניות להאכיל אלה, ריכוז הפולימר צריך להיות מותאם על מנת להתאים את הריכוזים השונים של חלקיקים התפזרו. בנוסף, פעם פולימר יעיל זוהה, שלבי הסינון ו / או צנטריפוגה ייתכן שיהיו צורך מותאם כדי להתאים את התפלגות גודל חלקיקים השונים 11.
השיטה המתוארת כאן ניתן להתאים בקלות מניות להאכיל אחרים ולכן הוא רלוונטי גם עבור מדענים ומהנדסים פיתוח אסטרטגיות הבהרה עבור בתרביות תאים יונקים ותהליכי ייצור המזון / להאכיל. Espצמחיית ecially תהליכים ייהנו כרכי מדגם הביניים הציע כאן כי תמציות צמחים יכולות להכיל חלקיקים עד 1 מ"מ הקוטר אשר אינם עולה בקנה אחד עם פורמטי microplate 21, למשל בגלל דינמיקת הערבוב שונה בשל קוטר חלקיקי יחס קוטר כלי שיט לא הוא נציג של הסקאלה התהליך.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
יש המחבר אין ניגודי אינטרסים לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
