The design-of-experiments procedure presented here allows the evaluation of different flocculants in terms of their ability to aggregate dispersed particles in plant extracts, thus reducing turbidity and the costs of downstream processing.
Plants are important to humans not only because they provide commodities such as food, feed and raw materials, but increasingly because they can be used as manufacturing platforms for added-value products such as biopharmaceuticals. In both cases, liquid plant extracts may need to be clarified to remove particulates. Optimal clarification reduces the costs of filtration and centrifugation by increasing capacity and longevity. This can be achieved by introducing charged polymers known as flocculants, which cross-link dispersed particles to facilitate solid-liquid separation. There are no mechanistic flocculation models for complex mixtures such as plant extracts so empirical models are used instead. Here a design-of-experiments procedure is described that allows the rapid screening of different flocculants, optimizing the clarification of plant extracts and significantly reducing turbidity. The resulting predictive models allow the identification of robust process conditions and sets of polymers with complementary properties, e.g. effective flocculation in extracts with specific conductivities. The results presented for tobacco leaf extracts can easily be adapted to other plant species or tissues and will thus facilitate the development of more cost-effective downstream processes for commodities and plant-derived pharmaceuticals.
植物は、広くそのようなフルーツジュースのような食料品を製造するために使用されるが、それらはまた、より高い値のバイオ医薬品製品1-3の製造のためのプラットフォームとして開発することができます。両方の場合において、下流処理(DSP)は、多くの場合、粒子を含んだ抽出物4,5の明確化に続いて、このような葉や果実などの組織からの液体の抽出から始まります。バイオ医薬品の製造のために、DSPのコストが全体的な製造コスト6,7の最大80%を占めることができ、これは、部分的には、ブレードベースの均質8,9として破壊の方法で調製した抽出物中に存在する高い粒子負荷を反映しています。抽出物中の粒度分布に合わせてフィルタ層の合理的な選択は、フィルタ容量を増加し、コスト10,11を削減することができるが、改善がごとに保持されなければならない粒子の数によって定義される絶対的な容量の上限を超えることはできません明確化を達成するためのフィルタ領域の単位。
より少ない粒子が濾過列における最高のフィルタの表面に到達した場合天井に持ち上げることができる、分散粒子が大きなフロック12を形成するために凝集を促進する凝集剤として知られているポリマーと混合される場合、これを達成することができます。このようなフロックの微細化と、より高価なデプスフィルターに到達する粒子の負担を軽減し、より粗い及びより安価なバッグフィルターによってさらに上流に保持することができます。ポリマーは、適正製造基準(GMP)に準拠している必要があり、そして典型的にはモル質量> 100 kDaのを持っている必要がありますし、中立的であるか、または13を帯電したことができますいずれかのバイオ医薬品などのため、それらの用途に適した安全性プロファイルを、持っている必要があります。中立凝集剤は、一般に、それらの凝集および径のフロックを形成させる分散粒子を架橋することによって作用するのに対し、1ミリメートル11、荷電ポリマーがdの電荷を中和します>ispersed粒子は、その溶解性を低下させ、従って、沈殿14を引き起こします。
凝集は、抽出物15,16の特性と一致するように、このような緩衝液のpHまたは導電率、及びポリマーの種類や濃度などのパラメータを調整することによって改善することができます。 0.5〜5.0のG L -1ポリエチレンイミン(PEI)で前処理したタバコ抽出物については、デプスフィルタ容量の2倍以上の増加が100-Lパイロット規模のプロセスで報告されました。セルロース系濾過助剤17と組み合わせた場合、このポリマーのコスト未満€10キロ-1プロセスにため、その導入は、フィルタ、さらにバッチ16またはあたりの消耗品のため、約€6,000コスト削減をもたらしています。たとえそうであっても、予測モデルは、それらの含有は15〜30分間16,18のホールドステップを必要とすることができるため、ストレージのための更なる投資コストで、その結果、凝集剤の先験的経済的利益を評価するために必要とされますタンク。しかし、凝集の複雑な性質のために、このような実験の結果を予測することができます利用可能なメカニズムのモデルは現在ありません。そのため、より適切な設計・オブ・実験(DOE)アプローチ19本資料に記載されているよう開発されました。一般のDOE手順のためのプロトコルは、最近20を出版されました。
小規模な装置は現在、凝集条件21のハイスループットスクリーニングのために利用可能です。しかしながら、これらのデバイスは、現実的に、植物の凝集中に条件をシミュレートしないことがあり、反応容器(96ウェルプレートのウェルについて約7 mm)の寸法ために抽出した粒子またはフロックは離れて一桁未満であることができます。これは、混合パターンため、モデルの予測力に影響を与えることができます。また、原因混合挙動の非線形変化の沈殿を含む方法を縮小し、STAを沈殿させることは困難です性22。そこで、この記事では、100Lのパイロットスケールプロセス16への最初の20ミリリットルの反応ボリュームからスケーラブルな結果をもたらす、一日あたり50から75のサンプルのスループットを持つベンチトップ規模スクリーニングシステムの概要を説明します。エネルギー省のアプローチと組み合わせると、これは予測モデルは、品質・バイ・デザインコンセプトの一環として、プロセスの最適化やドキュメントのために使用することができます。
以下に記載される方法はまた、凝集剤はまた、コスト削減ツール23として検討されている細胞培養ベースのプロセスで製造バイオ医薬品に適合させることができます。また、キャノーラ、トウモロコシおよび大豆24,25で生産βグルクロニダーゼのために示されているように、精製戦略の一部として、粗抽出物から標的タンパク質の沈殿をモデル化するために使用することができます。凝集剤の特性の詳細な説明は、16,26の他の場所見つけることができ、そのポリマーconcentrを確保することが重要ですationsは、非毒性または最終製品11中の有害レベル以下のいずれかです。
粒子の凝集を特徴付けるためにエネルギー省を設定する際に考慮すべき最も重要な側面は、デザインは、原則的に例えば 、pH、ポリマーの種類とポリマー濃度16の影響を予想または考えられる影響36,38を検出し、記述することができなければならないということです。したがって、実際の実験を開始する前に、設計空間(FDS)の割合を評価することが重要です。 FDSは、 …
The authors have nothing to disclose.
I would like to acknowledge Dr. Thomas Rademacher for providing the transgenic tobacco seeds and Ibrahim Al Amedi for cultivating the tobacco plants. I wish to thank Dr. Richard M Twyman for editorial assistance and Prof. Dr. Rainer Fischer for fruitful discussions. This work was funded in part by the European Research Council Advanced Grant ”Future-Pharma”, proposal number 269110, the Fraunhofer-Zukunftsstiftung (Fraunhofer Future Foundation) and the Fraunhofer-Gesellschaft Internal Programs under Grant No. Attract 125-600164.
2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
Centrifuge tube 15 mL | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
Centrifuge tube 50 mL self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
Grodan Rockwool Cubes 10x10cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |