Introduction
Las plantas son ampliamente utilizados para producir productos alimenticios tales como zumos de frutas, sino que también pueden ser desarrolladas como plataformas para la fabricación de de mayor valor productos biofarmacéuticos 1-3. En ambos casos, el procesamiento aguas abajo (DSP) a menudo comienza con la extracción de los líquidos de los tejidos, tales como hojas o frutos, seguida de la clarificación de los extractos de partículas cargadas de 4,5. Para la fabricación de productos biofarmacéuticos, los costos de DSP pueden representar hasta el 80% de los costes totales de producción 6,7 y esto refleja en parte la elevada carga de partículas presentes en los extractos preparados por métodos disruptivos tales como la homogeneización a base de hoja de 8,9 . Aunque la selección racional de las capas de filtro para que coincida con la distribución del tamaño de partícula en el extracto puede aumentar la capacidad del filtro y reducir los costos de 10,11, la mejora nunca puede exceder el límite máximo de capacidad absoluta definida por el número de partículas que debe ser retenido porunidad de área de filtro para lograr aclaración.
El techo se puede levantar si menos partículas llegan a la superficie de los mejores filtros en el tren de la filtración, y esto se puede conseguir si las partículas dispersas se mezclan con polímeros conocidos como floculantes que promueven la agregación para formar flóculos grandes 12. Tales flóculos se pueden retener más aguas arriba por los filtros de bolsa más gruesas y menos caros, reduciendo la carga de partículas de llegar a la más fina y filtros de profundidad más caros. Los polímeros deben tener un perfil de seguridad adecuadas para sus aplicaciones, por ejemplo para productos biofarmacéuticos que debe ser compatible con las buenas prácticas de fabricación (GMP), y por lo general tienen que tener una masa molecular> 100 kDa y pueden ser o bien neutro o cargado 13. Considerando floculantes neutros actúan generalmente por reticulación de partículas dispersas causar su agregación y la formación de flóculos con diámetros> 1 mm 11, polímeros cargados neutralizan la carga de dpartículas ispersed, reduciendo su solubilidad y por lo tanto causando precipitación 14.
La floculación se puede mejorar mediante el ajuste de parámetros tales como el pH del tampón o la conductividad, y el tipo de polímero o de la concentración, para que coincida con las propiedades del extracto de 15,16. Para extractos de tabaco tratados previamente con 0,5 a 5,0 g L -1 polietilenimina (PEI), un aumento de más de 2 veces en la capacidad de filtro de profundidad se informó en un proceso a escala piloto 100-L. El costo de este polímero es inferior a € 10 kg-1 por lo que su introducción en el proceso resultó en un ahorro de costes de alrededor de € 6.000 para filtros y consumibles por lote 16 o incluso más cuando se combinan con las ayudas de filtro a base de celulosa 17. Aun así, se requieren modelos predictivos para evaluar los beneficios económicos de floculantes a priori debido a que su inclusión puede requerir pasos de retención de 15-30 minutos 16,18, lo que resulta en mayores costos de inversión para el almacenamientotanques. Sin embargo, actualmente no hay disponibles modelos mecánicos que pueden predecir el resultado de tales experimentos debido a la naturaleza compleja de la floculación. Por lo tanto, un enfoque de diseño de experimentos-de-más apropiadas (DoE) 19 fue desarrollado como se describe en este artículo. Un protocolo para el procedimiento general del Departamento de Energía ha sido recientemente publicada el 20.
Dispositivos de pequeña escala están ahora disponibles para la selección de alto rendimiento de las condiciones de floculación 21. Sin embargo, estos dispositivos no pueden simular de forma realista las condiciones durante la floculación de extractos de plantas debido a las dimensiones del recipiente de reacción (~ 7 mm para los pozos en una placa de 96 pocillos) y las partículas o flóculos pueden ser de menos de un orden de magnitud de diferencia. Esto puede afectar a los patrones y por lo tanto la capacidad de predicción del modelo de mezcla. Además, puede ser difícil de bajar los procesos que implican precipitación debido a los cambios no lineales en el comportamiento de mezcla y sta precipitadobilidad 22. Por lo tanto, este artículo se describe un sistema de detección de sobremesa escala con un rendimiento de 50-75 muestras por día, produciendo resultados que son escalables a partir del volumen de reacción de 20 ml inicial a un proceso a escala piloto de 100 L 16. Cuando se combina con un enfoque DoE, esto permite que los modelos de predicción que se utilizarán para la optimización de procesos y la documentación como parte de un concepto de calidad a través del diseño.
El método descrito a continuación también puede adaptarse para productos biofarmacéuticos producidos en procesos basados en cultivo celular, donde floculantes también están siendo considerados como una herramienta para disminuir los gastos 23. También puede ser utilizado para modelar la precipitación de proteínas diana de un extracto bruto como parte de una estrategia de purificación, como se ha demostrado para β-glucuronidasa producida en canola, maíz y soja 24,25. Una descripción detallada de las propiedades floculantes se puede encontrar en otras partes 16,26 y es importante para asegurar que el polímero concentrciones son ya sea no tóxico o por debajo de niveles perjudiciales en el producto final 11.
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Protocol
1. Desarrollar una estrategia experimental adecuado
- Identificar los parámetros ambientales y de procesos que son relevantes para el procedimiento de floculación que se constituyan o optimizado, es decir, qué factores tienen el mayor efecto sobre la floculación. Por lo general, hay varios de estos parámetros por lo que un enfoque DoE como se ha descrito recientemente 20 es necesario debido a la falta de modelos mecanicistas.
- Seleccione los parámetros (factores) en base a datos de la literatura 12, el conocimiento previo y la experiencia con el sistema. Los factores típicos incluyen tampón pH, conductividad tampón, tiempo de incubación y temperatura, así como el tipo de polímero y concentración 15,16,27.
- Use las mismas referencias (véase 1.1) para definir los rangos significativos para cada factor numérico y los niveles de factores categóricos.
- Definir los resultados experimentales (respuestas) a controlar y se utilizaron para evaluar la eficiencia de la floculación. Dependiendo del sistema, estapuede ser turbidez del filtrado o sobrenadante, velocidad de sedimentación, el tamaño global o la capacidad de un filtro posterior 16,23,28-30.
- Asegúrese de que los ensayos usados para medir las respuestas son cuantitativos, robusto y repetible / reproducible de modo que los datos de alta calidad resultantes se pueden aumentar con experimentos llevados a cabo más tarde o por otro operador.
- Elija un tipo DoE satisfaciendo el número de factores a ser investigado y el grado de conocimiento que ya acumula sobre el sistema. Utilice la literatura disponible para identificar una adecuada DoE tipo 20.
- Seleccionar un diseño de detección si hay poca información sobre el sistema de floculación que ser investigado, un gran número de parámetros debe estar apantallado o si se sabe poco acerca de los rangos significativas para los parámetros. diseños de cribado típicos son los diseños factoriales completos y fraccionales. Incluir puntos centrales en el diseño si se espera que los parámetros a tener un impacto no lineal, por ejemplo, 19.
- Seleccionar una metodología de superficie de respuesta (RSM), por ejemplo, el centro de diseño compuesto (CCD) 31 u óptima 32,33, aunque sólo unos pocos factores con rangos conocidos necesitan una caracterización precisa.
- Creó el Departamento de Energía con el software adecuado, asegurando un criterio de calidad a priori, tales como la fracción del espacio de diseño se cumplen 20.
2. Preparar los experimentos de floculación
Figura 1: El extracto de la planta de floculación flujo de trabajo: Escala de proceso (izquierda) y la escala de sobremesa (derecha). Después de la extracción de proteína con tampones acuosos, las partículas dispersas de los desechos celulares se agregan mediante la adición de floculantes. Los agregados se eliminan a continuación por una cascada de bolsa y la profundidad de filtración y la capacidad de estosfiltros junto con las turbiedades de filtrado se pueden utilizar directamente para medir la eficiencia de la floculación.
- Desarrollar un flujo de trabajo experimental general (Figura 1).
- Utilice un dispositivo de extracción que resulta en la misma distribución de tamaño de partícula esperado (o ya se ha observado) en la escala de la aplicación final, por ejemplo, un homogeneizador especializada. Si es posible, el diseño de un modelo de la escala extractor hacia abajo como se describe para la homogeneización de las hojas de tabaco 10.
- Definir los volúmenes de extracto utilizado durante los experimentos de floculación (aquí 20 ml). Seleccione un volumen que permite un número representativo de partículas de estar presente en el recipiente de reacción, por ejemplo, experimentos de floculación en alícuotas de 20 ml dieron resultados reproducibles y escalables para extractos de tabaco que contienen ~ 7% de sólidos 34 y tamaños de partícula de ~ 0,5 [v / w] ma ~ 3 mm 16.
- Diseñar todas las operaciones de vigilancia y post-floculación de manera que THey son representativos de la escala de aplicación final, por ejemplo, filtros de selección con el mismo comportamiento de retención de partículas como los utilizados en la escala de producción.
- Cultivar las plantas de las que los extractos se derivarán.
- Utilizar la misma línea de la planta, aquí Nicotiana tabacum cv. Petit Havana SR1, y condiciones de cultivo que se utilizarán durante la producción como se ha descrito previamente 33.
- Si se procesarán otros materiales de alimentación, la preparación de estos materiales de alimentación de manera que sean representativas de la escala aplicación final, por ejemplo, usan tampones auténticos, tener en cuenta todas las etapas de dilución durante el proceso y se adhieren a el pH esperado y la conductividad, aquí pH 7,5 y conductividad de 30 mS cm-1.
- Preparar filtración Utilidades, dispositivos de turbidez-Monitoreo y vasos de muestreo.
- Cortar los materiales de filtro a los tamaños requeridos, aquí 15 x 15 cm 2, si no están listos para nosotrosmódulos e. Asegúrese de que todos los dispositivos de control y análisis son funcionales y etiquetar todos los tubos de muestra.
- A pesar de que estas son tareas sencillas, preparar estos artículos a tiempo para asegurarse de que no van a causar interrupciones durante los experimentos reales de floculación. Evitar retrasos, ya que pueden interferir con los resultados dados que la floculación es un proceso dependiente del tiempo.
- Preparar floculante archivo Solutions. PRECAUCIÓN: Use equipo de protección personal apropiado para el manejo de floculantes, por ejemplo, guantes. Los materiales pueden ser peligrosos (etiquetas de peligro de acuerdo con la Europa del UE 67/548 / CEE y 1999/45 / CE incluyen N, Xi, Xn). Evitar el polvo y se refieren a las fichas de seguridad. Trabajar bajo una campana de humos.
- Elija una concentración de reserva para cada floculante, aquí 80,0 g L-1 para los dos floculantes PEI que se utilizaron. Seleccione concentraciones tan altas como sea posible para evitar la dilución de la muestra al añadir el floculante, lo que reduciría concentración de partículasción y por lo tanto afectan la eficiencia de la floculación.
- Cuenta para cualquier pre-dilución que refleja la formulación del fabricante del polímero, por ejemplo, si el polímero ya se suministra como una acuoso al 50% [w / v] solución. soluciones madre Floculantes de 4-8% [w / v] se encontró que la más adecuada hasta el momento.
- Teniendo en cuenta los puntos mencionados anteriormente, asegúrese de que la concentración de floculante no genera una solución altamente viscosa que inhibe la pipeta, que puede causar errores debido a la concentración de floculante final no se ajusta correctamente.
- Usar la misma concentración de stock para todos los floculantes, si es posible, ya que esto facilitará la configuración de un esquema de pipeteo (2.5) lo que reduce la probabilidad de errores.
- Ajustar el pH y la conductividad de cada solución madre de floculante para que coincida con las condiciones de los extractos, aquí pH 4-10 y la conductividad 15-55 mS cm -1. Preparar las acciones individuales para un solo floculante si más de un conjunto de condiciones de pH y / o conductividad es la prueba de que el polímero.
- Preparar soluciones madre recién floculantes, no más de 48 h antes de su uso. A pesar de que la floculación se puede inducir con las acciones de polímero almacenados durante más de 4 semanas, la eficacia puede disminuir debido a la hidrólisis del polímero a valores altos o bajos de pH. Consulte la documentación del fabricante para obtener más detalles.
- Asegúrese de que los parámetros seleccionados para el Departamento de Energía se pueden ajustar con precisión para cada muestra durante el experimento, por ejemplo, asegurar que no son baños de calefacción / refrigeración disponibles para ajustar las temperaturas de incubación, aquí 4 ° C, 20 ° C y 37 ° C. Si la mezcla durante la floculación es parte del experimento, asegúrese de que el dispositivo de mezcla es representativo de la actividad aplicación final en términos de parámetros críticos como la entrada de alimentación.
- Convertir la Lista DoE en un esquema de pipeteo.
- Convertir las diferentes concentraciones de floculante ser TESTed en volúmenes de solución de reserva que se añadirán a las muestras de extracto: dividir las concentraciones finales de floculante por la concentración de reserva y se multiplica por el volumen de la muestra utilizada en los experimentos de floculación. Identificar el mayor volumen final resultante, por ejemplo, si se mezclan 20 ml de la muestra con un máximo de 2 ml de solución madre floculante este será de 22 ml.
- Calcular los volúmenes de almacenamiento intermedio necesario para mantener el mismo volumen final en todas partes alícuotas de floculación basada en el mayor volumen de floculante social que se añade, por ejemplo, si es de 0,75 ml de Stock floculante debe añadirse a una muestra a continuación 1,25 ml de tampón se requiere para mantener la volumen final de 22 ml de la muestra (2.5.1).
- Resumir los volúmenes de solución de floculante para cada condición de polímero y floculación para calcular los volúmenes absolutos de solución madre que se requieren para el DoE.
- Cosecha de hojas de tabaco y preparar el extracto.
- Retire los seis lea la parte superiorVes (o tanto como lo indica en las instrucciones de proceso) a partir de plantas de tabaco de una edad apropiada, por ejemplo, 6 semanas de edad, y la transferencia a un dispositivo de extracción adecuado, tal como un homogeneizador o tornillo de prensa.
- Añadir tres volúmenes de tampón de extracción por gramo de biomasa, por ejemplo, 300 ml por 100 g, y mezclar durante 8 min.
- Preparar extractos individuales con los tampones apropiados si el pH y / o conductividades diferentes se están probando. Aquí, se trata de homogeneizar el material vegetal durante 3 x 30 segundos en una licuadora o un exprimidor 34.
- Alternativamente, preparar el extracto de una manera que es representativo del proceso bajo investigación.
- Alícuota del extracto y Añade el búfer.
- agitar manualmente y completamente el extracto durante todo el procedimiento para asegurar que las muestras son homogéneas con una distribución uniforme de partículas.
- Precisamente distribuir el extracto entre los tubos de reacción pre-marcados por decantación,aquí 20 ml en cada recipiente. Autoportante de tubos de 50 ml simplifican el manejo y son ideales para muestras de 20 ml.
- Añadir el volumen de cada tampón de extracción requerida para mantener el volumen límite fijada para cada tubo de reacción individual usando una pipeta adecuada.
3. flocular la extractos vegetales con diferentes polímeros
- Pipetear el volumen requerido de solución de floculante, aquí 0,1-2,0 ml, a las muestras de forma secuencial según lo indicado por la orden de ejecución aleatorizado del DoE. Mezclar bien cada muestra inmediatamente después de la adición de floculante por una intensa agitación manual precisamente por 20 seg.
- Si es necesario, ajustar el tiempo de agitación para otros materiales de alimentación para asegurar una buena mezcla, pero estrictamente garantizar tiempos de mezcla consistentes para todas las muestras. Tenga en cuenta que la prolongación de la mezcla puede provocar la interrupción irreversible de flóculos y la fuerza aplicada de manera incompatible durante la agitación puede distorsionar los resultados de floculación.
- Opcional: Modificar el procedimiento descrito anteriormente para la aplicación simultánea de dos o más floculantes.
- Opción 1: En lugar de un único polímero añadir una mezcla de dos o más floculantes, aquí PEI y quitosano. Utilice las combinaciones de floculante definidos en el Departamento de Energía. Incorporar la relación y las concentraciones absolutas de los polímeros como parámetros individuales durante la configuración del Departamento de Energía (1.1).
- Opción 2: Añadir dos o más polímeros secuencialmente al extracto.
- Utilice las concentraciones individuales de polímero, su tipo, y el tiempo de incubación entre cada adición al extracto, como factores adicionales durante la configuración del DoE.
- También utilizar este método para comprobar si la adición repetida de un único polímero puede mejorar la floculación. Utilice una adición paso a paso para simular la adición lenta de un floculante, por ejemplo, cuatro pasos, cada adición de 0.25 ml 80 g L -1 floculante de stock a un volumen de 20 ml durante 4 min puede imitar la adición de floculante conun caudal de 0,25 ml min -1.
- En todos los casos, identificar un nuevo volumen máximo de la muestra final para esta configuración mediante la adición de los volúmenes máximos de todos los floculantes para el volumen de muestra, aquí todavía 22 ml, y volver a calcular los volúmenes requeridos de las soluciones madre de floculante y tampones para ajustar el volumen, si es necesario.
- Se incuban las muestras de los tiempos definidos en el DoE, normalmente 3-30 minutos, para permitir la formación de flóculos. Asegúrese de que todas las demás condiciones de incubación, por ejemplo, temperatura, se establecen de acuerdo con el Departamento de Energía.
- Observe y la formación de flóculos documento. Registrar el progreso de la formación de flóculos según se requiera, por ejemplo, como mm de flóculo de sedimentación por min mediante la medición de la altura de los sólidos sedimentados. Si es necesario, prolongar la floculación por un período de tiempo prolongado, como durante la noche.
- Filtrar el extracto floculada.
- Usa los materiales de filtración preparados anteriormente (2.3) para clarificar el extracto floculada después de la adecuadatiempo de incubación por decantación las muestras floculadas a través del material del filtro y en un tubo de reacción o recipiente limpio.
- No vuelva a suspender los flóculos de resolverse antes de la filtración y aplicar el extracto con a una velocidad de ~ 300 ml min-1 para el filtro, que corresponde a 3-4 seg para una muestra de 20 ml.
- Confirmar el rendimiento de la etapa de filtración si un material diferente se utiliza en los experimentos de sobremesa en comparación con el proceso final en términos de retención de partículas, por ejemplo, midiendo la distribución del tamaño de partícula en ambos tipos de muestras 11.
- Analizar el filtrado en función de la turbidez y / o distribución de tamaño de partícula como el uso de dispositivos apropiados requeridos, por ejemplo, un turbidímetro.
- Opcional: repetir el análisis después de tiempos de incubación prolongados, por ejemplo 12-24 horas, para investigar la formación o reformación de flóculos inestables.
- Usa los materiales de filtración preparados anteriormente (2.3) para clarificar el extracto floculada después de la adecuadatiempo de incubación por decantación las muestras floculadas a través del material del filtro y en un tubo de reacción o recipiente limpio.
- Analizar las muestras en las condiciones de la PrRespuestas de e-definido (1.1.3).
- Tomar muestras de los filtrados y analizarlos para parámetros de respuesta adicionales, por ejemplo, las concentraciones de diferentes proteínas diana o productos valiosos.
- Opcional: Analizar el retenido (en su mayoría de sólidos) para los mismos parámetros para cerrar el balance de masas del proceso. En particular, cuantificar el efecto de los floculantes en la recuperación de líquido mediante la comparación de los sólidos restantes en masa después de muestras se tratan o no tratadas con floculante.
- Confirmar la calidad de los datos y transferir los resultados al software DoE.
- Busque los valores extremos en los datos de respuesta recopilados, por ejemplo, valores inesperadamente altos.
- Asegúrese de que todos los datos de respuesta están correctamente alineados con sus correspondientes condiciones experimentales.
- La transferencia de los resultados en el software DoE y asegurarse de que las órdenes de ejecución estándar y asignados al azar no se mezclan.
4. Evaluarel Departamento de Energía
- Utilice las herramientas de análisis de los datos incorporados en el software de DoE para desarrollar un modelo predictivo que se describió anteriormente 20.
- Seleccionar un modo de transformación de datos adecuado, si es necesario para facilitar la construcción de modelos, aquí log 10. Una proporción mayor que 10 para el mayor valor de respuesta más pequeño vs. indica que una transformación de datos puede ser requerida. Identificar la transformación más adecuada utilizando las herramientas estadísticas apropiadas, por ejemplo, una parcela de Box-Cox 35.
- Eligió un modelo base que (i) se adapta a la EOD elegida (1.2) y (ii) está de acuerdo con los conocimientos previos sobre el sistema bajo investigación basada en el análisis de la varianza (ANOVA) herramientas de software DoE, por ejemplo, un polinomio de segundo orden a menudo se adapta mejor para el efecto observado del tiempo de incubación de un polinomio de primer orden.
- Eliminar los factores insignificantes modelo, por ejemplo, p> 0,05, o interacciones de los factores de forma iterativa anulando su selección, lareby la reducción de la complejidad del modelo y el aumento de su poder predictivo.
- Confirman la calidad del modelo mediante la comparación de R 2, R 2 ajustado y predijo R2 junto con el gráfico de probabilidad normal de los residuos studentizados, residuos-vs-plazo, predijo-vs-real y de Box-Cox parcelas 36. Todos los valores de R 2 deben estar dentro de un rango de 0,2.
- Asegúrese de que el modelo final está de acuerdo con los supuestos básicos de la física y la termodinámica, por ejemplo, están las concentraciones previstas sin negativos.
- Utilizar el modelo para predecir las condiciones más favorables para el sistema bajo investigación, aquí mínima turbidez.
- Seleccione las respuestas más importantes y sus estados preferidos, por ejemplo, la turbidez mínima. Combinar estas selecciones maximizando una función de deseabilidad o herramientas similares, que son características incorporadas de varios paquetes de software del Departamento de energía 36.
- Dependiendo de la aplicación deseada of el modelo, seleccione la confirmación se ejecuta para verificar las condiciones óptimas y / o la capacidad de predicción del modelo en general, por ejemplo, si las condiciones prevé que sea más favorable no eran parte del DoE inicial seleccionarlos como experimentos de seguimiento.
5. Mejorar la Modelo y Verificar el poder predictivo
- Afine el espacio de diseño inicial a las condiciones de operación más deseables, por ejemplo, baja turbidez en el rango de 0-1.000 unidades nefelométricas de turbidez (NTU), basada en las predicciones del modelo (4.2).
- Creó un nuevo Departamento de Energía dentro de estos rangos, incluyendo sólo aquellos factores que han sido identificados como importantes o relevantes (4.1.2)).
NOTA: Un factor puede ser significativo en términos de análisis de modelo pero irrelevante para un proceso, es decir, su efecto sobre una respuesta es <1% en comparación con la de otros factores. - Repita los pasos 1 a 5,2 hasta que la calidad de las predicciones del modelo coincide con los requirements, por ejemplo, la desviación estándar del modelo tal como se indica por el software es suficiente para la aplicación prevista. Modificar la estrategia experimental si se requiere para estas iteraciones, por ejemplo, utilizar un único floculante en el refinamiento.
- Transferir y confirmar los resultados del modelo a escala reducida de la escala escala piloto o de producción final.
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Representative Results
La floculación de extracto de tabaco con diferentes polímeros
El método descrito anteriormente se utilizó con éxito para desarrollar un proceso para la floculación de extractos de tabaco durante la fabricación de un anticuerpo monoclonal (anticuerpo neutralizante de VIH 2G12) y una proteína fluorescente (DsRed) (Figura 1) 16, y desde entonces ha sido transferido a otras proteínas que incluyen lectinas, vacunas contra la malaria y proteínas de fusión (datos no publicados). Normalmente, la aplicación de floculantes reduce la turbidez del extracto de la planta se filtró bolsa de ~ 6000 NTU (10.000 NTU después de la extracción) a ~ 1000 NTU. En un experimento de selección inicial, un diseño 91 de gestión IV-óptimo se utilizó para probar 18 polímeros diferentes en tres concentraciones diferentes (debido a este factor afecta la eficiencia de la floculación 13,27) y se observó la floculación durante un ~ 12 hr de incubación period (Figura 2A y B). El largo período de incubación puede ser importante para identificar los marcos de tiempo significativos para el proceso de floculación. También los valores de pH de 4-8 se probaron ya que estos pueden ser relevantes en procesos futuros debido a las propiedades de las proteínas diana específicas 13,25,27,37. Entre los 18 polímeros ensayados, se encontraron seis a reducir la turbidez extracto después de la bolsa de filtración en extractos típicos con una conductividad de 25 mS cm-1.
El modelo se refinó mediante la exclusión de todos los polímeros ineficaces en dos iteraciones y, a continuación, incluyendo los parámetros de proceso adicionales, tales como la conductividad en los 15-45 mS cm -1 gama, un tiempo de incubación de 5 a 75 min y una temperatura de 4-30 ° C, para generar modelos adecuados para una gama más amplia de condiciones de proceso. El poder predictivo del modelo aumentó después de cada iteración, lo que resulta en un modelo altamente confiable (Figura 3A). >
Después de cuatro iteraciones, se encontró el catiónico altamente cargado y polímero ramificado PEI para ser el más eficiente para la agregación de las partículas dispersas en extractos de tabaco. Sin embargo, la eficiencia de este polímero disminuyó con el aumento de la conductividad extracto. Las propiedades del tamaño de la molécula, de carga, de estructura (lineal o ramificado), densidad de carga y grado de sustitución amina (primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria) fueron probados como factores en una cierva y los dos últimos parámetros tenido el efecto más grande. Los detalles se han reportado en otras partes 16. Sobre la base de este conocimiento de las propiedades del polímero a partir de los resultados del Departamento de Energía, se seleccionaron cinco otros polímeros con características moleculares similares a PEI (densidad de carga> meq g -1 y amina cuaternaria). Uno de estos cinco polímeros demostraron una mayor eficacia de floculación a conductividades más altas (Figura 3B) 11.
nt. "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Como parte del enfoque del Departamento de Energía, se confirmó que ninguno de los PEI afectada la recuperación del producto bajo cualquiera de las condiciones ensayadas De hecho, la capacidad de los filtros de profundidad utilizó posteriormente para eliminar los sólidos dispersos aumento por un factor de 3/2 a 5/7 restante, alcanzando ~ 110 L m -2 dependiendo del tipo de filtro. Estos resultados también se confirmaron en un proceso a escala piloto 100 L, en el que para la aplicación de floculantes reduce la aclaración los costos de producción relacionados con la PI de> 50% y los costes totales de producción de ~ 20%.
Figura 2: Eficacia de diferentes floculantes bajo diversas condiciones de proceso (A). Extraer muestras directamente después de la floculación y filtración bolsa todavía pueden aparecer turbia. (B) Después de instalarse durante varias horas, la turbidez de lamismas muestras se pueden reducir de manera significativa. Sin embargo, los valores de turbidez obtenidos inmediatamente después de la filtración a menudo son preferibles porque los tiempos de retención prolongada pueden no ser posibles en los procesos de fabricación a gran escala. (C) La floculación es también eficaz cuando se aplica a los extractos de plantas generados con una prensa de husillo en lugar de un mezclador tal como se indica por el líquido de color rojo claro en la parte inferior de los tubos de 50 ml (el color rojo es debido a la presencia de la proteína fluorescente DsRed ). (D) mezclas de diferentes floculantes también pueden inducir la floculación.
Figura 3:. Modelado de floculación utilizando un enfoque DoE (A) La precisión del modelo predicciones aumentaron a medida que el número de polímeros en el modelo se redujo de cribado inicial al refinamiento a pesar de que el número de parámetros de proceso aumentó de two a cinco. (B) Cambio del tipo de polímero (en este caso de una PEI a otro), como consecuencia de un cambio en los parámetros del proceso (en este caso la conductividad) mantiene la floculación de partículas eficiente y la correspondiente baja turbidez del filtrado en comparación con el extracto de control no tratado (sólido línea roja). Las barras de error en A y B indican las desviaciones estándar de las predicciones del modelo. Líneas rojas discontinuas indican las desviaciones estándar del extracto no tratado (n = 10). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Floculación de tabaco extractos preparados con una prensa de tornillo
Los resultados de floculación también se transfirieron a partir de extractos de tabaco preparadas con un homogeneizador a las preparadas con una prensa de tornillo, lo que generó un menor número de partículas dispersas en el intervalo de tamaño de mm pero máspartículas en el intervalo de tamaño de micras. En un 29 de gestión de diseño IV-óptima, se demostró que PEI también es eficaz para este tipo de extracto en un intervalo de concentración similar y que la recuperación de proteínas diana no se ve afectada (Figura 2C). Esto demuestra (i) que las condiciones de floculación identificadas para un tipo de material de alimentación puede ser en cierta medida transferidos a otros materiales de alimentación, el ahorro de tiempo durante el desarrollo del proceso, y (ii) que la estrategia DoE se puede utilizar para confirmar esta transferencia no sólo para condiciones de proceso individuales, sino sobre todo el espacio de diseño.
experimentos de floculación con mezclas de floculante
Las combinaciones de los floculantes pueden ser más eficaces que los polímeros individuales, por ejemplo debido a más mejorada de puente entre las partículas 12. Por lo tanto, el método descrito anteriormente fue adaptado para dar cabida a la adición de dos polímeros (3.2) 26. Tres polímeros no sintéticos se ensayaron solos, en combinación entre sí o combinarse con PEI. La floculación más eficaz de extractos de tabaco se logró con PEI solo, pero una combinación de PEI y quitosano o polifosfatos puede reducir la concentración de PEI necesaria. Además, el enfoque DoE nos permitió identificar las combinaciones de polímeros más eficaces cuando se omite PEI (con o sin quitosano y polifosfatos), lo que ayuda a definir las condiciones óptimas de floculación en procesos en los que la PEI es incompatible con la proteína diana, por ejemplo debido a la precipitación, como reportado para βglucuronidase 24,25. Por otra parte, el Departamento de Energía fue capaz de caracterizar un espacio de diseño complejo para la que no existía modelo mecanicista (Figura 2D). El uso de las herramientas ANOVA de software DoE, fue posible distinguir entre modelos predictivos fiables y homólogos evaluados mal (Figura 4).
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Discussion
El aspecto más importante a tener en cuenta al configurar un DoE para caracterizar la floculación de las partículas es que el diseño debe, en principio, ser capaz de detectar y describir los efectos esperados o posibles 36,38, por ejemplo, la influencia del pH, tipo de polímero y concentración de polímero 16. Por lo tanto, es importante para evaluar la fracción de espacio de diseño (FDS) antes de comenzar los experimentos reales. La FDS es la fracción del espacio experimental multidimensional (cubierto por los factores de diseño, por ejemplo, pH) dentro de la cual es posible detectar diferencias pre-definidas entre dos resultados experimentales dados un sistema de variabilidad conocida, por ejemplo la detección de una diferencia en la turbidez de 250 NTU dada una variabilidad de 125 NTU. La FDS se puede aumentar aumentando el diseño con carreras adicionales y debe ser ≥ 0,95 para diseños destinados a guiar el control de procesos 36. Además, si el número de carreras no permite ttodo lo experimento que se llevó a cabo en un solo día, los bloques deben ser pre-definidos en el Departamento de Energía para dar cuenta de lote a lote y la variabilidad día a día. Cuando se trabaja con material vegetal, la inclusión de la referencia se ejecuta en cada bloque (por ejemplo, los controles no tratados) ayuda a compensar la variabilidad, lo que permite la comparación de los datos de varias carreras cada normalizados a su paso por referencia correspondiente. En este contexto, el aumento del número de carreras se replican en el DoE también es útil.
Cuando se seleccionan un gran número de polímeros, es aconsejable el uso de las propiedades individuales de la floculantes, por ejemplo la densidad de carga y la masa molecular, como factores numéricos discretos en lugar de los polímeros mismos factores como categóricas. Esto reduce el número de experimentos porque los diseños experimentales a menudo necesitan ser replicado por factores categóricos, mientras que los niveles adicionales de factores numéricos sólo necesitan un pequeño número de carreras adicionales. El aire acondicionado de la informacióntienda de campaña del experimento también aumenta y permite la identificación de propiedades de los polímeros que mejoran la floculación, por ejemplo, una alta densidad de carga tal como se encuentra en los experimentos descritos aquí. CCD y RSM experimental diseños son útiles para establecer modelos con alto poder predictivo, lo que permite la identificación de las condiciones de elaboración sólidas (por ejemplo, para guiar el control de procesos) y por lo general se utilizan para el seguimiento de los diseños de cribado. Si el número de factores y factores de niveles menores de resultados de la investigación en DoE con más de 400 experimentos individuales, puede ser conveniente reducir el número de niveles de los factores o cambiar a otros tipos de diseño porque el número de muestra que puede ser fácilmente manejado con la técnica que aquí se presenta se limita a ~ 100 por día.
Desde un punto de vista experimental, los polímeros deben permanecer estables en las condiciones experimentales seleccionadas, por ejemplo, no deben despolimerizar a pH bajo. La preparación cuidadosa del floculantestocks en términos de concentración es también necesaria para obtener resultados reproducibles y modelos de alta calidad. En este contexto, es posible que el floculante para ser pretratado, por ejemplo, tiempos o ajuste de pH para la hinchazón quitina, para asegurar la solubilización completa, y por lo tanto para obtener una solución homogénea. Poblaciones altamente viscosas debe evitarse ya que esto puede causar errores de pipeteo al transferir el polímero al extracto. Muchos polímeros pueden tener un fuerte efecto tampón y las poblaciones tienen valores extremos de pH, por ejemplo, pH ~ 9,5 al 8% [w / v] PEI. Esto puede afectar el pH del extracto si no se pre-ajustados los stocks y distorsionar los resultados experimentales. Por ejemplo, si la floculación es más eficaz a pH alto y un no-pH ajustado PEI Stock luego se utiliza un DoE podría sugerir que las altas concentraciones de PEI son más eficaces. Sin embargo, este efecto se debe a la mayor pH causada por el mayor volumen de Stock que se ha añadido, no por el aumento de la concentración de polímero per se. Las concentraciones madre utilizan también debe ser similar a los utilizados en aplicaciones a gran escala para evitar diferentes efectos de dilución entre las escalas que pueden afectar a la concentración de partículas y de este modo la floculación. Algunos floculantes a base de arcilla, tales como caolín contienen un gran número de los propios partículas finas que puede enmascarar el efecto de floculación, por ejemplo, reducción de la turbidez después de la filtración inicial, y otras respuestas deben ser seleccionados para evaluar la eficacia de estas sustancias, por ejemplo, la capacidad del filtro aguas abajo.
Para el análisis de los datos es importante para evaluar los resultados recogidos en términos de valores extremos, desajustes y coherencia en general, por ejemplo, los valores extremos pueden indicar un error de copiar y pegar, un cambio en el lugar decimal o un mal funcionamiento de los dispositivos de análisis de equipos /. Un análisis exhaustivo se asegurará de que sólo los datos de alta calidad se utilizan para la construcción de modelos. Durante la construcción de modelos es importante evaluar constantemente THe amplio conjunto de indicadores de calidad que ofrece el programa del Departamento de Energía. Los criterios más básicos son el R 2, R 2 ajustado y predijo valores de R 2, pero los residuos normales, los residuos-vs-run y real-vs-predichos parcelas (Figura 4) son aún más importantes porque proporcionan información sobre cada ejecución en un experimento en lugar de un parámetro de suma. Por otra parte, la coherencia del modelo final y sus predicciones con los mecanismos conocidos de floculación siempre deben investigarse. Las principales discrepancias entre las predicciones y expectativas científicas pueden ocurrir porque los modelos del Departamento de energía son sólo descriptivos en lugar de mecánica, por ejemplo, los modelos pueden predecir los valores extremos en los bordes de un espacio de diseño que refleja el uso de algoritmos de ajuste de polinomios.
Figura 4:. Los indicadores de calidad de los modelos DoE El ningúnrmal parcela de residuos studentizados debe ser similar a una línea recta lo más cerca posible (A) con sólo ligeras desviaciones respecto (flechas verdes) aceptables para los modelos de alta calidad. Un aspecto curva (C) con desviaciones fuertes (flechas rojas) desde la línea ideal (rojo) indica un mal modelo, por ejemplo, debido a la falta de factores significativos. En última instancia, el predicho y los valores experimentales (reales) debe coincidir con (B) y de nuevo seguir una línea recta. Las desviaciones de la línea ideal (círculo rojo y una línea discontinua) indican malas predicciones del modelo (D). Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
El enfoque del Departamento de Energía puede ayudar a caracterizar la floculación de materiales de alimentación complejas tales como extractos de plantas, incluso si no hay datos existentes. La floculación de extractos de tabaco se ha optimizado con una carga de trabajo de 2 nosEKS y consumibles los costes de ~ 500 €. Esto reduce el número de filtros de profundidad requeridos para un solo lote a escala piloto que involucra ~ 800 l de extracto de la planta en un 60%, lo que consigue una reducción correspondiente en los costos de consumibles.
Los floculantes también se aplicaron a diferentes extractos de plantas y para los homogeneizados de cultivo celular. A pesar de que el mismo floculante fue eficaz para todos estos materiales de alimentación, la concentración de polímero tenía que ser ajustado con el fin de dar cabida a las diferentes concentraciones de partículas dispersas. Además, una vez un polímero eficaz se ha identificado, las etapas de filtración y / o centrifugación pueden necesitar ser ajustada para que coincida con la distribución del tamaño de partícula diferente 11.
El método aquí descrito se puede adaptar fácilmente a otros materiales de alimentación y por lo tanto también es relevante para los científicos e ingenieros de desarrollo de estrategias de aclaración cultivos de células de mamíferos y los procesos de producción de alimentos / piensos. especially procesos basados en plantas se beneficiarán de los volúmenes de las muestras intermedias sugeridos aquí porque extractos de plantas pueden contener partículas de hasta 1 mm de diámetro, que son incompatibles con los formatos de microplacas de 21, por ejemplo, debido a la dinámica de mezcla difieren debido a un diámetro de partícula de proporción vaso de diámetro que no es representativo de la escala de proceso.
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Disclosures
El autor no tiene ningún conflicto de intereses a revelar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2100P Portable Turbidimeter | Hach | 4650000 | Turbidimeter |
| 2G12 antibody | Polymun | AB002 | Reference antibody |
| Biacore T200 | GE Healthcare | 28-9750-01 | SPR device |
| BP-410 | Furh | 2632410001 | Bag filter |
| Catiofast VSH | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| Centrifuge 5415D | Eppendorf | 5424 000.410 | Centrifuge |
| Centrifuge tube 15 ml | Labomedic | 2017106 | Reaction tube |
| Centrifuge tube 50 ml self-standing | Labomedic | 1110504 | Reaction tube |
| Chitosan | Carl Roth GmbH | 5375.1 | Flocculating agent |
| Design-Expert(R) 8 | Stat-Ease, Inc. | n.a. | DoE software |
| Disodium phosphate | Carl Roth GmbH | 4984.3 | Media component |
| Ferty 2 Mega | Kammlott | 5.220072 | Fertilizer |
| Forma -86C ULT freezer | ThermoFisher | 88400 | Freezer |
| Greenhouse | n.a. | n.a. | For plant cultivation |
| Grodan Rockwool Cubes 10 x 10 cm | Grodan | 102446 | Rockwool block |
| HEPES | Carl Roth GmbH | 9105.3 | Media component |
| K700P 60D | Pall | 5302305 | Depth filter layer |
| KS50P 60D | Pall | B12486 | Depth filter layer |
| Miracloth | Labomedic | 475855-1R | Filter cloth |
| MultiLine Multi 3410 IDS | WTW | WTW_2020 | pH meter / conductivity meter |
| Osram cool white 36 W | Osram | 4930440 | Light source |
| Phytotron | Ilka Zell | n.a. | For plant cultivation |
| Polymin P | BASF | 79002360 | Flocculating agent |
| POLYTRON PT 6100 D | Kinematica | 11010110 | Homogenization device with custom blade tool |
| Protein A | Life technologies | 10-1006 | Antibody binding protein |
| Sodium chloride | Carl Roth GmbH | P029.2 | Media component |
| Synergy HT | BioTek | SIAFRT | Fluorescence plate reader |
| TRIS | Carl Roth GmbH | 4855.3 | Media component |
| Tween-20 | Carl Roth GmbH | 9127.3 | Media component |
| VelaPad 60 | Pall | VP60G03KNH4 | Filter housing |
| Zetasizer Nano ZS | Malvern | ZEN3600 | DLS particle size distribution measurement |
References
- Godfray, H. C. J., et al. Food Security: The Challenge of Feeding 9 Billion People. Science. 327, 812-818 (2010).
- Fischer, R., Schillberg, S., Buyel, J. F., Twyman, R. M. Commercial aspects of pharmaceutical protein production in plants. Curr. Pharm. Des. 19, 5471-5477 (2013).
- Pastores, G. M., et al. A Phase 3, multicenter, open-label, switchover trial to assess the safety and efficacy of taliglucerase alfa, a plant cell-expressed recombinant human glucocerebrosidase, in adult and pediatric patients with Gaucher disease previously treated with imiglucerase. Blood Cells Mol. Dis. 53, 253-260 (2014).
- De Paepe, D., et al. A comparative study between spiral-filter press and belt press implemented in a cloudy apple juice production process. Food Chem. 173, 986-996 (2015).
- Buyel, J. F., Twyman, R. M., Fischer, R. Extraction and downstream processing of plant-derived recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 33, 902-913 (2015).
- Wilken, L. R., Nikolov, Z. L. Recovery and purification of plant-made recombinant proteins. Biotechnol. Adv. 30, 419-433 (2012).
- Buyel, J. F. Process development trategies in plant molecular farming. Curr. Pharm. Biotechnol. 16, 966-982 (2015).
- Hassan, S., Keshavarz-Moore, E., Ma, J., Thomas, C. Breakage of transgenic tobacco roots for monoclonal antibody release in an ultra-scale down shearing device. Biotechnol. Bioeng. 111, 196-201 (2014).
- Hassan, S., van Dolleweerd, C. J., Ioakeimidis, F., Keshavarz-Moore, E., Ma, J. K. Considerations for extraction of monoclonal antibodies targeted to different subcellular compartments in transgenic tobacco plants. Plant Biotechnol. J. 6, 733-748 (2008).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Scale-down models to optimize a filter train for the downstream purification of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco leaves. Biotechnol. J. 9, 415-425 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Downstream processing of biopharmaceutical proteins produced in plants: the pros and cons of flocculants. Bioengineered. 5, 138-142 (2014).
- Gregory, J., Barany, S. Adsorption and flocculation by polymers and polymer mixtures. Adv. Colloid Interface Sci. 169, 1-12 (2011).
- Zhou, Y., Franks, G. V. Flocculation mechanism induced by cationic polymers investigated by light scattering. Langmuir. 22, 6775-6786 (2006).
- Runkana, V., Somasundaran, P., Kapur, P. C. Mathematical modeling of polymer-induced flocculation by charge neutralization. J. Colloid Interface Sci. 270, 347-358 (2004).
- Hjorth, M., Jorgensen, B. U. Polymer flocculation mechanism in animal slurry established by charge neutralization. Water Res. 46, 1045-1051 (2012).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Flocculation increases the efficacy of depth filtration during the downstream processing of recombinant pharmaceutical proteins produced in tobacco. Plant Biotechnol. J. 12, 240-252 (2014).
- Buyel, J. F., Opdensteinen, P., Fischer, R. Cellulose-based filter aids increase the capacity of depth filters during the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins. Biotechnol. J. 10, 584-591 (2014).
- Yasarla, L. R., Ramarao, B. V. Dynamics of Flocculation of Lignocellulosic Hydrolyzates by Polymers. Ind. Eng. Chem. Res. 51, 6847-6861 (2012).
- Montgomery, D. C. Design and Analysis of Experiments. , John Wiley & Sons Incorporated. (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Characterization of complex systems using the design of experiments approach: transient protein expression in tobacco as a case study. J. Vis. Exp. , e51216 (2014).
- Espuny Garcia Del Real, G., Davies, J., Bracewell, D. G. Scale-down characterization of post-centrifuge flocculation processes for high-throughput process development. Biotechnol. Bioeng. 111, 2486-2498 (2014).
- Rathore, A. S., Sofer, G. Process Validation in Manufacturing of Biopharmaceuticals, 3rd edn, Vol. 1. , Taylor & Francis. (2012).
- Kang, Y., et al. Development of a Novel and Efficient Cell Culture Flocculation Process Using a Stimulus Responsive Polymer to Streamline Antibody Purification Processes. Biotechnol. Bioeng. 110, 2928-2937 (2013).
- Menkhaus, T. J., Eriksson, S. U., Whitson, P. B., Glatz, C. E. Host selection as a downstream strategy: Polyelectrolyte precipitation of beta-glucuronidase from plant extracts. Biotechnol. Bioeng. 77, 148-154 (2002).
- Holler, C., Vaughan, D., Zhang, C. M. Polyethyleneimine precipitation versus anion exchange chromatography in fractionating recombinant beta-glucuronidase from transgenic tobacco extract. J. Chromatogr. A. 1142, 98-105 (2007).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Synthetic polymers are more effective than natural flocculants for the clarification of tobacco leaf extracts. J. Biotechnol. 195, 37-42 (2014).
- Pearson, C. R., Heng, M., Gebert, M., Glatz, C. E. Zeta potential as a measure of polyelectrolyte flocculation and the effect of polymer dosing conditions on cell removal from fermentation broth. Biotechnol. Bioeng. 87, 54-60 (2004).
- Buyel, J. F., Gruchow, H. M., Boes, A., Fischer, R. Rational design of a host cell protein heat precipitation step simplifies the subsequent purification of recombinant proteins from tobacco. Biochem. Eng. J. 88, 162-170 (2014).
- Wang, S., Liu, C., Li, Q. Impact of polymer flocculants on coagulation-microfiltration of surface water. Water Res. 47, 4538-4546 (2013).
- Menkhaus, T. J., Anderson, J., Lane, S., Waddell, E. Polyelectrolyte flocculation of grain stillage for improved clarification and water recovery within bioethanol production facilities. Bioresour. Technol. 101, 2280-2286 (2010).
- Mune, M. A. M., Minka, S. R., Mbome, I. L. Optimising functional properties during preparation of cowpea protein concentrate. Food Chem. 154, 32-37 (2014).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Predictive models for transient protein expression in tobacco (Nicotiana tabacum L.) can optimize process time, yield, and downstream costs. Biotechnol. Bioeng. 109, 2575-2588 (2012).
- Buyel, J. F., Kaever, T., Buyel, J. J., Fischer, R. Predictive models for the accumulation of a fluorescent marker protein in tobacco leaves according to the promoter/5'UTR combination. Biotechnol. Bioeng. 110, 471-482 (2013).
- Buyel, J. F., Fischer, R. A juice extractor can simplify the downstream processing of plant-derived biopharmaceutical proteins compared to blade-based homogenizers. Process Biochem. 50, 859-866 (2014).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. DOE Simplified: Practical Tools for Effective Experimentation. Vol. 1. 1, Taylor & Francis. (2000).
- Anderson, M. J., Whitcomb, P. J. Response Surface Methods Simplified. , Productivity Press. (2005).
- Buyel, J. F., Fischer, R. Generic chromatography-based purification strategies accelerate the development of downstream processes for biopharmaceutical proteins produced in plants. Biotechnol. J. 9, 566-577 (2014).
- Myers, R. H., Montgomery, D. C., Anderson-Cook, C. M. Response Surface Methodology: Process and Product Optimization Using Designed Experiments. , Wiley. (2009).
