Abstract
在这里，我们有效地描述的详细步骤和直接递送流感嗜血杆菌 到小鼠的下呼吸道。我们演示程序编制H.接种流感 ，H的内气管滴入流感进入肺，支气管肺泡灌洗液（BALF），BALF中的免疫细胞的分析，和RNA隔离差异基因表达分析的汇编。此过程可用于研究的任何细菌，病毒或真菌的肺部炎症反应。直接气管滴入被过度鼻内或气溶胶吸入程序大多优选的，因为它更有效地以较少的歧义开细菌接种到下呼吸道。
Introduction
炎症是针对传染剂的防御的基本免疫机制。它促进了消灭病原体和受损组织的修复。它还有助于恢复到正常的健康状态1。然而，失调炎症常常导致慢性炎症性疾病2。气道炎症是对于不同的肺部疾病，如慢性阻塞性肺疾病（COPD），哮喘和肺纤维化3的初始触发。
的不可分型（未包囊） 流感嗜血杆菌 （NTHi的）与慢性上下肺部炎性疾病4,5相关联。它是儿童和成人的下呼吸道分离慢性阻塞性肺疾病4,6,7的主导品种。的NTHi感染后的炎症反应的特征在于促炎性细胞因子（如TNF和IL-1β）的上调，并且它介导bý丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通过toll样受体（TLR）8。
小鼠模型是用于分析的，因为不同的基因缺陷线的可用性肺部炎性疾病的潜在病理非常有用的工具。几种方法已被用于接种活的/减毒的细菌和细菌产物，包括鼻内滴注和雾化吸入9,10。在这里，我们表现出内气管滴入。虽然不经常使用的，这种方法是更有效的和高重现性的，因为到下呼吸道的直接递送接种物的。
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Protocol
所有实验均按照贝勒研究院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的指导方针进行。
1.培养不可分型流感嗜血杆菌 （NTHi的），并准备接种
- 在巧克力琼脂平板板的NTHi和在37℃和5％CO 2在加湿的 CO 2培养箱中保持板倒置过夜。翌日，培养在脑心脏浸液肉汤的细菌。然后，加入1毫升肉汤进入无菌1.5毫升管。
- 离心以4,000 xg离心在室温下5分钟。然后，弃去上清液并在1ml无菌1×PBS中重新悬浮沉淀。重复此步骤一次。
- 在分光光度计转移100微升的再悬浮溶液注入900微升1×PBS中的与测量稀释的培养的吸光度在600nm处的波长。
- 确定的生存能力和集落形成单位秒（CFU的）接种的通过培养在巧克力琼脂平板上1点10系列稀释，并在37℃下温育过夜，5％ 的 CO 2。
- 基于从前面的步骤确定的生存能力和的CFUs，调整接种物，以20×10 6 CFU / ml的终浓度。
2.气管内（IT）滴注
- 用一个150毫克/毫升氯胺酮+ 20毫克/毫升甲苯噻嗪液取0.1毫升/ 10克体重小鼠注入小鼠腹腔内（IP）。该过程应在通风橱中进行与光源保持动物保暖。
- 捏住鼠标的叉指空间，以验证该鼠标充分麻醉。
- 将在它的后面鼠标。剃颈部腹侧区域，并与氯己定和70％的乙醇消毒。
- 解除用鼠齿钳的颈部的上部腹侧部分的皮肤上。做一个小切口（0.5〜1.0厘米）胸腺上面用手术刀然后小心地解剖肌肉以暴露气管。
- 用1ml注射器用27克针，缓缓注入0.05毫升空气，接着从第1或盐水作为对照获得0.05毫升的NTHi，接着另一0.05毫升空气。保持动物的垂直约1分钟。
- 关闭与手术胶水切口。按住鼠标横向躺着和温暖约10分钟。
3.收集肺泡灌洗液
- 牺牲颈椎脱位24小时小鼠感染后。
- 打开解剖剪鼠标的腹腔和切腹主动脉流血。揭露肺的腹一部分。
- 暴露气管并用20号的导管插管它。灌输0.8毫升BALF缓冲液（1×PBS中，0.1％葡萄糖，10 U / ml肝素），并收集轻轻吸出灌洗。重复此步骤三次。
- 算在100μlBALF悬浮液用血细胞的细胞的总数在放大10倍与台盼蓝染色米。
- 准备修改姬姆萨染色幻灯片。等份加入100μlBALF进入细胞离心涂片和离心机在500×g离心5分钟的适当的孔中。干燥10分钟的幻灯片，并根据制造商的协议使用改性Giemsa染色细胞染色。
- 使用剩余的细胞用于随后的分析，例如荧光激活细胞分选（FACS），共焦显微镜，基因表达和蛋白质印迹11-13。
4.组织病理学准备
- 对于组织病理学分析，感染与NTHi的小鼠如在步骤2.4中描述。感染后的24小时，通过颈脱位牺牲动物。切断与解剖剪刀以暴露肺和如前所述气管打开胸腔。然后，将20号导管插入气管。
- 填充在4％福尔马林制备2％温暖琼脂糖溶液的肺部。一旦肺完全膨胀，地方冰对肺部的顶部，以巩固琼脂糖溶液。
- 然后，小心地取出胸插头，把它在1X PBS 4％福尔马林50毫升的解决方案，直到它被用于苏木精伊红（H＆E）的部分进行处理。
5. FACS BALF中染色的细胞
- 把从BALF流体1×10 5个细胞在96孔V形底微量滴定板。
- 在4℃下洗涤细胞用冷的1×PBS中的300微升和自旋在4000 xg离心3分钟。
- 染色与细胞染色液细胞在100μl1×PBS中（1：1000稀释度），并保持在室温下15分钟。
- 在4℃下洗涤细胞用300μl冷1×PBS中的在4000 xg离心3分钟。
- 保持细胞在100μl含有1 FACS洗涤缓冲液[洗涤缓冲液（1×PBS，2％FBS，1mM EDTA中，0.1％叠氮化钠]的：100稀释的Fc块在4℃下15分钟。
- 离心细胞以4000×g离心3分钟，并弃去SUPernatant。
- 染色的细胞用100μl表面染色鸡尾酒（1：100稀释）在FACS洗涤缓冲液在4℃，30分钟。
- 在4℃以4000 xg离心用300μlFACS洗涤缓冲液中洗涤细胞三次3分钟。
- 固定的细胞在100μl的4％多聚甲醛在室温下15分钟。
- 在4℃下用300μl1×PBS中洗涤细胞两次，在400×g离心3分钟，并在300微升的FACS洗涤缓冲液中重新悬浮。
- 请使用流式细胞仪珠单色染色控制。
- 添加珠粒一滴到96孔V形底微量滴定板并用200μl1×PBS洗涤。
- 加入1μl染色抗体与100μl的1×PBS中并珠和在室温下孵育5分钟。
- 用300μl1X PBS洗两次珠。
- 通过流式细胞仪分析14单染色控制和细胞。
6.均质肺组织来隔离RNA
- 感染后，收集一小块肺（20-40毫克），并保持它的RNA在4℃稳定试剂过夜。然后，在-80℃储存，直到下一个步骤。
- 用冷1X PBS肺组织摆脱RNA稳定试剂。
- 放置组织到1.5毫升离心管中含有裂解缓冲液（1毫升的裂解缓冲液+10μl的β巯基乙醇）。
- 使用尖剪刀切碎的组织切成小块并采用无绳马达粒料杵20-40秒均质。
- 保持在冰上裂解5分钟，并与步骤7.1进行。
7.从肺RNA分离
- 离心溶胞产物18000 xg离心3分钟。通过移液除去上清液，并仔细转移到一个新的1.5毫升管。
- 1体积的70％乙醇加入到裂解物。吹打立即混匀，等待2-4分钟。
- 转移到700微升裂解物以置于旋转柱在2 ml收集管。
- 离心机以9,600×g离心15秒，弃去流过。
- 加入350微升严格的洗涤液，离心9,600 XG为15秒。丢弃的流量通过。
- 80微升DNA酶添加我直接向旋转柱膜并保持在室温下15分钟。
- 添加350微升严格洗涤缓冲液到旋转柱和离心机以9,600×g离心15秒。丢弃的流量通过。
- 以9,600 XG加入500μlRNA洗涤液，离心15秒。丢弃的流量通过。
- 以9,600 XG加入500μlRNA洗涤液和旋转2分钟。丢弃的流量通过。
- 放置在新的2ml收集管中，离心旋转柱以9,600 xg离心1分钟。丢弃的流量通过。
- 直接以9,600 xg离心添加30-50微升不含RNA酶的水，以旋转柱，离心1分钟。在-80°C储存RNA。
- 执行RNA测序分析14。
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Representative Results
气管内滴注导致BALF中（ 图1A，左面板）比安装用盐水一个白血球数显着增加。白细胞的分类计数分析清楚地显示增加的中性粒细胞浸润（ 图1，右图）。在BALF中的细胞的FACS分析进一步证实嗜中性粒细胞数量的增加（ 图1B）。肺组织的H＆E染色的切片的组织学分析显示增加的气道炎症（ 图1C）。这些数据共同表明，气管内滴注在小鼠中诱导的气道炎症。支持使用这种方法的用于研究调节气道病信号途径，我们使用是缺陷的E3泛素连接酶痒的小鼠。痒已知参与调节炎症信号传导途径15。我们接种年龄和性别匹配的野生型C57BL / 6控制和痒 - / - 小鼠的NTHi。我们分离的RNA从控制WT和瘙痒的肺组织 - / - 小鼠和进行全转录组测序，以确定差异表达的炎症基因。 如图2中所示，痒不足导致的几个基因的差异表达。这表明，气管内滴注可用于调查肺部炎症，基因表达谱和信号通路。
图1：的NTHi的气管内接种在小鼠中诱导的肺部炎症小鼠用的NTHi（10 6 CFU /鼠）或盐水对照接种。在接种后24小时，处死小鼠，收集（A）的BALF。总白细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞数进行了测定。数据表示平均值±SEM。 N = 4只/组。 *表示相对于盐水处理的小鼠P <0.05。 （B）在BALF中的细胞用抗Gr1的抗体染色，并通过FACS分析。 （C）H＆E染色的肺切片显示白细胞浸润和炎症。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：在WT和瘙痒的肺部基因表达差异- / -小鼠以下气管内的NTHi接种的NTHi接种24小时后，RNA的从两个WT的肺中分离（1,2）和两个痒- / - 。 （1，2）的小鼠。 （A）的RNA的质量用生物分析仪进行分析。 （B）热图显示Z值（从解释为SD衡量远平均）为每百万日志2计数（日志172痒痒使用磨边机鉴定差异表达基因2 CPM） - / -相比于WT小鼠，请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
在此，我们描述了一个独特和微创手术用细菌肺病原体接种的小鼠的肺。我们证明，这个过程可用于研究是否可使用那些在炎症信号传导途径的基因缺陷小鼠不同基因的功能。这个过程也可以用来研究病毒和真菌的肺部感染的炎症反应。此过程在其他方法，例如鼻内或气溶胶吸入的优点是：（1）在此过程中，致病性接种物被直接滴注至下呼吸道; （2）来控制接种物大小的能力;和（3）减少细菌暴露于处理程序的风险。
手术灌输细菌气管暴露是至关重要的一步，其中必须小心，以免造成损伤周围组织，尤其是血管。
菌的滴注进气管的sh乌尔德仔细进行，以避免因窒息老鼠的死亡的可能性。有人建议，该接种物（约50微升）缓慢释放和前和接种后的空气被注入。按住鼠标垂直滴入了一段时间之后，保证它们的横向躺着有利于更快的恢复。这个过程的主要缺点是，很短的时间周期内多次曝光是不可能的，因为该手术的要求。一个潜在的问题是，如果在导管放置太深在支气管中，BALF细胞计数会更低。这个问题可以通过拉动管略微向上来解决。
由于气道炎症性疾病的发病率在世界范围内不断增加3.16，了解这些疾病的病理生理机制是最重要的。在这项研究中所描述的技术，可以帮助确定主要调控途径，并能够促进发展新的治疗模式。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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