Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

intra-trakeal İdaresi Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53964
Automatic Translation
1, 1, 1
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Abstract

Burada, verimli ayrıntılı bir prosedür tanımlamak ve doğrudan Haemophilus influenzae teslim farelerin alt solunum yollarına. Biz H. hazırlanması için prosedür göstermek influenza aşı, H. içi trakeal damlatma akciğere influenzae, farklı gen ekspresyon analizi için bronko-alveolar lavaj sıvısı (BALF), BAL sıvısında bağışıklık hücrelerinin analizi ve RNA izolasyonu toplanması. Bu prosedür, bir bakteri, virüs ya da mantar akciğer enflamatuar yanıtı çalışma için kullanılabilir. daha az belirsizlik ile daha verimli alt solunum yollarına bakteriyel inokulum sunar, çünkü doğrudan trakea damlatma çoğunlukla burun veya aerosol inhalasyon prosedürleri tercih edilir.

Introduction

Enflamasyon enfeksiyöz ajanlara karşı savunma temel bir bağışıklık mekanizmadır. Bu patojen ortadan kaldırılması ve hasarlı doku onarımını teşvik eder. Aynı zamanda normal sağlıklı durumuna 1'e kurtarma kolaylaştırır. Ancak, düzensiz inflamasyon sıklıkla kronik enflamatuar hastalıklar 2 yol açar. Hava yolu inflamasyonu, kronik obstrüktif akciğer hastalığı (COPD), astım ve pulmonar fibrosis 3 farklı akciğer hastalıkları için bir başlangıç ​​tetikleyicidir.

Tiplendirilemeyen (kapsüllenmemiş), Haemophilus influenzae (NTHi) kronik üst ve alt akciğer enflamatuar hastalıklar 4,5 ile ilişkilidir. Kronik obstrüktif akciğer hastalığı 4,6,7 çocuk ve yetişkinlerin alt solunum yolları izole baskın türdür. NTHi enfeksiyon sonrası inflamatuar yanıtı (örneğin, TNF ve IL-1 gibi) proenflamatuar sitokinlerin regülasyonu ile karakterize edilir ve b aracılıky mitojen aktive protein kinaz (MAPK) ve toll benzeri reseptörler aracılığıyla nükleer faktör-KB (NF-KB) (TLR) 8.

Fare modelleri nedeniyle farklı gen eksikliği hatlarının durumu akciğer inflamatuar hastalığın altında yatan patolojiyi analiz etmek için çok yararlı araçlardır. Çeşitli metotlar, intranazal uygulaması ve aerosol haline getirilmiş inhalasyon 9,10 dahil olmak üzere, canlı / zayıflatılmış bakterileri ve bakteriyel ürünler, aşılamak için kullanılmıştır. Burada, içi trakeal instilasyon göstermektedir. daha az sıklıkta kullanılmasına rağmen, bu yaklaşım daha verimli ve çünkü daha düşük solunum sistemine inokulum doğrudan teslimat yüksek tekrarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler Baylor Araştırma Enstitüsü Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) yönergelerine uygun olarak yapıldı.

1. Kültürleme tipi belirsiz Haemophilus influenzae (NTHi) ve aşı hazırlama

  1. Bir çikolata agar plakası üzerinde Plaka NTHi ve 37 ° C'de ve% 5 CO2 seviyesinde bir gece boyunca nemlendirilmiş bir CO2 kuluçka makinesi içinde başaşağı plaka tutun. Ertesi gün, kültür beyin kalp infüzyon suyu bakteri. Daha sonra, steril 1.5 ml'lik tüp içine suyu 1 ml.
  2. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 4000 x g'de santrifüjleyin. Sonra, süpernatantı atmak ve steril 1x PBS 1 ml pelet yeniden askıya. kez bu adımı yineleyin.
  3. Bir spektrofotometrede 600 nm dalga boyunda seyreltilmiş kültür absorbansı 1x PBS 900 ul içinde yeniden süspansiyon haline çözeltisi 100 ul aktarın ve ölçün.
  4. canlılık ve koloni oluşturan birim belirleyinçukulata agar plakaları üzerinde 1:10 seri dilüsyonları kültürlenmesi ve CO2 37 ° C'de gece boyunca inkübe ve% 5 inokulum S (CFU).
  5. Önceki aşamada belirlenen canlılık ve CFU göre, 20 x 10 6 CFU / ml'lik bir son konsantrasyona inokulum ayarlayın.

2. İçi trakea (o) damlatma

  1. 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml ksilizin çözeltisi ile fare, 0.1 ml / 10 g vücut ağırlığına sahip intraperitonal fare (ip) enjekte edilir. prosedür hayvan sıcak tutmak için bir ışık kaynağı ile kaputu yapılmalıdır.
  2. Fare yeterli anestezi olduğunu doğrulamak için fare birlisme alan sıkıştırın.
  3. Sırtında fare yerleştirin. boyun ventral alan tıraş ve klorheksidin ve% 70 etil alkol ile dezenfekte edin.
  4. Sıçan diş forseps kullanarak boyun üst karın kısmının cilt kaldırın. Bir neşter kullanılarak timus üzerinde küçük bir kesi (0.5-1.0 cm) yapmakve dikkatle trakea maruz kas teşrih.
    1. 27 G iğne ile 1 ml hava ile yavaş yavaş başka bir 0.05 ml hava ve ardından, bir kontrol olarak, Bölüm 1 veya tuz elde edilen 0.05 mi NTHi, ardından 0.05 mi hava, enjekte edilir. yaklaşık 1 dakika boyunca dikey hayvan tutun.
  5. cerrahi yapıştırıcı ile kesi kapatın. yaklaşık 10 dakika yanal yaslanmış ve sıcak fare tutmak.

3. BALS Koleksiyonu

  1. enfeksiyondan sonra servikal dislokasyon 24 saat ile fare Kurban.
  2. anatomik makas ile fare karın boşluğuna açın ve kanamaya ventral aort kesti. Akciğerin ventral kısmını Açığa.
  3. trakea Açığa ve 20 gauge kateter ile entübe. BALF tamponu 0.8 ml (1 x PBS,% 0.1 dekstroz, 10 U / ml heparin) aşılamak ve yumuşak aspirasyon ile lavaj toplanır. Bu işlemi üç kez tekrarlayın.
  4. Bir hemocyto kullanılarak BALF süspansiyon 100 ul toplam hücre sayısınıTripan Mavisi boyama ile 10X büyütme altında ölçer.
  5. modifiye Giemsa boyama için slaytlar hazırlayın. 5 dakika boyunca 500 xg'de Sitospin ve santrifüj uygun oyuklarına BAL'da alikosu 100 ul. 10 dakika için slaytlar kurutun ve üretici protokollerine göre modifiye Giemsa kullanarak hücreleri leke.
  6. Bu floresans (FACS) aktive hücre, konfokal mikroskopi, gen ifadesi ve western blot 11-13 kadar bir sonraki analiz için geri kalan hücreler, kullanın.

4. Histopatolojisi Hazırlık

  1. Adım 2.4 açıklandığı gibi histopatoloji analizi için, NTHi ile fareleri enfekte. enfeksiyonun 24 saat sonra, servikal dislokasyon ile hayvanlar kurban. akciğerler ve daha önce de belirtildiği gibi trakea maruz anatomik makas ile göğüs boşluğu açmak kesin. Sonra, trakea içine 20 gauge kateter yerleştirin.
  2. % 4 formalin içinde hazırlanan% 2 sıcak agaroz çözeltisi ile akciğer doldurun. Bir kereAkciğerler tam agaroz çözüm katılaşmaya akciğerlere üstüne yeri buz, şişirilmiş.
  3. Sonra, dikkatle göğüs fişi çıkarın ve hematoksilen ve eozin (H & E) bölümleri için işlenir kadar 1x PBS içinde% 4 formalin 50 ml çözelti koydu.

BAL'da Hücreleri Boyama 5. FACS

  1. 96 oyuklu V-tabanlı mikro titre plaka BALS sıvısından 1 x 10 5 hücre koyun.
  2. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de 300 soğuk 1 x PBS ul ve spin hücreleri yıkayın.
  3. (1: 1000 seyreltme) 100 ul 1x PBS hücre leke çözeltisi ile hücreleri leke ve 15 dakika boyunca oda sıcaklığında tutulması.
  4. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de soğuk 1 x PBS, 300 ul hücre yıkayın.
  5. 1 içeren FACS yıkama tamponu [Yıkama tamponu (1 x PBS,% 2 FBS, 1 mM EDTA,% 0.1 sodyum azid] 100 ul hücre edin: 100 seyreltilmiş Fc Block, 4 ° C'de 15 dakika karıştırıldı.
  6. 4.000 xg'de Santrifüj hücreleri 3 dakika ve sup atınernatant.
  7. 4 ° C'de 30 dakika boyunca bir FACS yıkama tamponu (100 seyreltme 1) 100 ul yüzey boyama kokteyli ile Leke hücreleri.
  8. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 4000 x g'de FACS yıkama tamponu 300 ul ile üç kez hücreleri yıkayın.
  9. Oda sıcaklığında 15 dakika süreyle% 4 paraformaldehid, 100 ul hücre düzeltildi.
  10. 4 ° C'de 3 dakika boyunca 400 x g'de PBS 1X 300 ul hücreler iki kez yıkanır ve FACS yıkama tamponu 300 ul içinde yeniden askıya.
  11. boncuk flow sitometri kullanılarak tek renkli boyama kontrolleri yapın.
    1. 96 oyuklu V-tabanlı mikrotiter plakası içine tanelerin bir damla ekleme ve PBS 1X 200 ul ile yıkayın.
    2. PBS ve boncuk 1x 100 ul lekeleme antikorun 1 ul ilave edin ve 5 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edilir.
    3. PBS 1X 300 ul iki kez boncuk yıkayın.
  12. 14 flow sitometri tek lekeli kontrolleri ve hücreleri analiz edin.

RNA izole etmek Akciğer Doku 6. Homojenizasyon

  1. Enfeksiyondan sonra, akciğer (20-40 mg), küçük bir parça toplamak ve gece boyunca 4 ° C 'de reaktif stabilize edici RNA tutun. Daha sonra, bir sonraki aşamada kadar -80 ° C'de saklayın.
  2. RNA stabilizasyonu ayıracı kurtulmak için soğuk 1x PBS akciğer dokuları yıkayın.
  3. 1.5 ml santrifüj tüpü ihtiva eden liziz tamponu (1 mi liziz tamponu, 10 ul β-merkaptoetanol) halinde doku yerleştirin.
  4. sivri makas kullanarak küçük parçalar halinde doku doğrayın ve 20-40 saniye boyunca bir kablosuz motorlu pelet havaneli kullanarak homojenize.
  5. 5 dakika boyunca buz üzerinde lizat tutun ve adım 7.1 ile devam edin.

Akciğer 7. RNA İzolasyon

  1. 3 dakika boyunca 18.000 x g'de lizat santrifüjleyin. pipetle ile süpernatantı ve dikkatle yeni bir 1.5 ml tüp aktarın.
  2. lizat% 70 etanol içinde 1 hacim. Pipetleme tarafından hemen karıştırın ve 2-4 dakika bekleyin.
  3. yerleştirilmiş bir döndürme kolonuna lizat 700 ul kadar transfer2 ml'lik bir toplama tüpü içinde.
  4. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de Santrifüj ve flow-through atın.
  5. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de 350 mcL sıkı yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın.
  6. Doğrudan spin kolon zarına 80 ul DNaz eklenir ve 15 dakika için oda sıcaklığında saklayın.
  7. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de spin kolon ve santrifüj 350 ul sıkı yıkama tamponu ekleyin. flow-through atın.
  8. 15 saniye boyunca 9.600 xg'de 500 ul RNA yıkama tamponu ve santrifüj ekleyin. flow-through atın.
  9. 2 dakika süreyle 9600 xg'de 500 ul RNA yıkama tamponu ve spin ekleyin. flow-through atın.
  10. 1 dakika boyunca 9.600 xg'de yeni 2 ml toplama tüpü ve santrifüj spin kolon yerleştirin. flow-through atın.
  11. 1 dakika boyunca 9.600 x g'de spin kolon ve santrifüj doğrudan 30-50 mL RNaz içermeyen su ilave edilir. -80 ° C'de saklayın RNA.
  12. RNAseq analizi 14 gerçekleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intra-trakeal instilasyon tuzlu su ile yükleme daha BALS (Şekil 1A, sol panel) lökositlerin belirgin artan sayıda sonuçlandı. Lökositlerin diferansiyel sayısı analizi açık bir şekilde artmış nötrofil infiltrasyon (Şekil 1, sağ panel) göstermiştir. BAL sıvısında hücrelerinin FACS analizi daha da nötrofillerin sayısını (Şekil 1B) doğruladı. Akciğer dokusunda H & E-boyanan kesitler histolojik analiz havayolu inflamasyonu (Şekil 1C) artış gösterdi. Bu veriler topluca içi trakeal damlatma farelerde havayolu inflamasyonu uyardığını göstermektedir. havayolu patogenezi düzenleyen sinyal gönderme yollarını inceleyerek, bu yaklaşımın kullanımını desteklemek için, biz E3 ubikitin ligaz Itch için eksiktir fareler kullanıldı. Kaşınma 15 geçiş yolu enflamatuar sinyal regülasyonunda yer aldığı görülmüştür bilinmektedir. Biz aşılananyaş ve cinsiyet uyumlu yabani tip C57BL / 6 kontrolü ve Kaşıntı - / - NTHi ile fareler. / - - Biz kontrol WT ve Kaşıntı akciğer dokularından RNA izole fareler ve farklı şekilde ifade edilir inflamatuar genleri tanımlamak için tüm transcriptome sıralama yapılır. Şekil 2'de gösterildiği gibi, kaşıntı eksikliği birçok, genlerin farklı sunum ile sonuçlanmıştır. Bu içi trakeal instilasyon, akciğer iltihabı, gen ekspresyon profillerini ve sinyal yolları araştırmak için kullanılabilir olduğunu düşündürmektedir.

Şekil 1
Şekil 1: NTHi intra-trakeal aşı farelerde akciğer iltihabı teşvik Fareler NTHi (10 6 CFU / fare) ya da salin kontrolü ile aşılanmıştır.. 24 saat aşılamadan sonra, fareler (A) BALF toplandı kurban edilmiştir. total lökosit, monosit ve nötrofil sayıları belirlendi. Veriler sunulmuşturolarak ortalama ± SEM. n = / grup 4 fare. * Tuzlu su ile tedavi edilen farelere kıyasla p <0.05 gösterir. (B) BAL sıvısında bulunan hücreler, anti-Gr1 antikoru ile boyandı ve FACS ile analiz edilir. (C) H & lökosit süzülmesini ve inflamasyonu gösteren akciğer bölümleri e-lekeli. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.

şekil 2
Şekil 2: WT ve kaşıntı akciğerlerinde diferansiyel gen ekspresyonu - / - içi trakeal NTHi aşılama NTHi aşılanmasmdan 24 saat sonra, RNA, iki WT akciğerinden izole edilmiştir farelerde (1, 2) ve iki kaşıntı - / -. (1, 2) fare. (A) RNA kalitesi Bioanalyzer kullanılarak analiz edilmiştir. (B) Isı haritası uzak sd bir ölçüsü olarak yorumlanır (Z-skorları gösterenmilyonda Günlük 2 saymak için ortalama) (Itch içinde edger kullanılarak tanımlanır 172 farklı ifade genlerin 2 CPM) log - / -. WT farelere kıyasla bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bu yazıda, bakteriyel akciğer patojen ile farelerin akciğerleri aşılamak için eşsiz ve minimal invaziv prosedürü açıklar. Bu prosedür, inflamatuar sinyal yollarının genleri eksik olan fareler kullanılarak, farklı genlerin fonksiyonunu incelemek için kullanılabileceğini göstermektedir. Bu prosedür, aynı zamanda, viral ve mantar akciğer enfeksiyonu enflamatuvar yanıtları incelemek için kullanılabilir. Böyle intranazal veya aerosol inhalasyon gibi diğer yöntemlere göre bu prosedürün avantajları (1) Bu prosedürde, patojenik inokulum doğrudan alt solunum yolu telkin edilir edilir; (2) aşı boyutunu kontrol etme yeteneği; ve (3) işleyicisi bakteriyel maruz kalma riskini azaltmıştır.

cerrahi bakterileri aşılamak için trakea maruz kalma bakımı çevre dokulara, özellikle kan damarları zarar görmesini engellemek için alınması gereken çok önemli bir adımdır.

trakea sh içine bakterilerin damlatmanedeniyle boğulma farelerin ölüm olasılığını önlemek için dikkatli yapılmalıdır ould. Inokulum (yaklaşık 50 ul) yavaş yavaş serbest bırakılmasını ve hava öncesi ve inokulum sonra enjekte edilmesi önerilmektedir. Bir süre instillasyonu aşağıdaki fare dikey tutulması ve onları yanal sırt üstü yatar tutarak hızlı iyileşme kolaylaştırır. Bu prosedürün büyük dezavantajı, zaman, kısa bir süre içinde birden fazla maruz nedeniyle ameliyat gereği mümkün olmamasıdır. Olası bir sorun kateter bronşunda çok derin yerleştirildiğinde, BALS hücre sayımı düşük olmasıdır. Bu sorunu biraz yukarı tüp çekerek çözülebilir.

Hava yolu inflamatuar hastalıkların sıklığı bu hastalıkların patofizyoloji anlamak, dünya çapında 3,16 artmaktadır beri birinci derecede öneme sahiptir. Bu çalışmada açıklanan teknolojiler kilit düzenleyici yolları belirlemek için yardımcı olabilir ve gelişimini kolaylaştırabiliryeni tedavi yöntemlerinin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

Tags

İmmünoloji Sayı 109 Enflamasyon, solunum patojen gen ekspresyonu hücre sinyal
intra-trakeal İdaresi<em&gt; Haemophilus influenza</em&gt; Fare Modelleri Havayolu inflamasyonu Eğitim için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venuprasad, K., Theivanthiran, B.,… More

Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter