Abstract
Aqui, descrevemos um procedimento detalhado de forma eficiente e entregar diretamente Haemophilus influenzae pelas vias respiratórias inferiores de ratos. Nós demonstramos o procedimento para a preparação H. influenzae inóculo, instilação intra-traqueal de H. influenzae para o pulmão, acúmulo de líquido bronco-alveolar lavagem (LBA), análise de células imunes no LBA, e isolamento de RNA para análise de expressão diferencial de genes. Este procedimento pode ser utilizado para estudar a resposta inflamatória do pulmão para qualquer bactérias, vírus ou fungos. A instilação traqueal directa é mais preferido mais de procedimentos de inalação de aerossóis intranasais ou porque mais eficiente proporciona o inoculo bacteriano para o tracto respiratório inferior com menos ambiguidade.
Introduction
A inflamação é um mecanismo de defesa imunitário fundamental da contra agentes infecciosos. Ela promove a erradicação do patógeno e reparação de tecidos danificados. Além disso, facilita a recuperação para um estado normal e saudável 1. No entanto, a inflamação desregulado muitas vezes leva a doenças inflamatórias crónicas 2. Inflamação das vias respiratórias é um gatilho inicial para diferentes doenças pulmonares tais como doença pulmonar obstrutiva crónica (DPOC), asma e fibrose pulmonar 3.
A influenzae não tipificável (não encapsulado) Haemophilus (NTHi) é associada com doenças inflamatórias superiores e inferiores do pulmão crónicas 4,5. É a espécie dominante isolados das vias aéreas inferiores de crianças e adultos com 4,6,7 doença pulmonar obstrutiva crónica. A resposta inflamatória após a infecção NTHi é caracterizado pela regulação positiva de citocinas pró-inflamatórias (tais como TNF e IL-1β), e é mediada by mitogen activated protein kinase (MAPK) e fator nuclear-kB (NF-kB) através de receptores toll-like (TLR) 8.
modelos de rato são ferramentas muito úteis para analisar a patologia subjacente de doença inflamatória do pulmão, devido à disponibilidade de linhas diferentes de genes deficientes. Vários métodos têm sido utilizados para inocular / bactérias vivas atenuadas e produtos bacterianos, incluindo a instilação intranasal e 9,10 inalação na forma de aerossol. Aqui, nós demonstramos a instilação intra-traqueal. Embora seja utilizada menos frequentemente, esta abordagem é mais eficiente e altamente reprodutível devido à entrega directa do inoculo para o tracto respiratório inferior.
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Protocol
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as diretrizes da Comissão Institucional animal Cuidado e Uso (IACUC) do Instituto de Pesquisa Baylor.
1. A cultura não tipificável de Haemophilus influenzae (NTHi) e preparar o inóculo
- Placa de NTHi numa placa de agar de chocolate e manter a placa invertida numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2. No dia seguinte, a cultura das bactérias em caldo de infusão cérebro coração. Em seguida, adicionar 1 ml de caldo num tubo esterilizado de 1,5 mL.
- Centrifugar a 4.000 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Em seguida, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de solução estéril de PBS 1x. Repita este passo uma vez.
- Transferir 100 ul da solução de re-suspensa em 900 ul de 1x PBS e medir a absorvência da cultura diluída a 600 nm comprimento de onda num espectrofotómetro.
- Determinar a unidade de viabilidade e de formação de colóniass (CFUs) do inoculo de cultura de diluições em série 1:10 em placas de agar de chocolate e incubando durante a noite a 37 ° C e 5% de CO 2.
- Com base na viabilidade e CFU determinada a partir da etapa anterior, ajustar o inóculo até uma concentração final de 20 x 10 6 CFU / mL.
2. Intra-traqueal (IT) A instilação
- Injetar o mouse por via intraperitoneal (ip) com 0,1 ml / 10 g de peso corporal do rato com um + 20 mg solução de 150 mg / ml de cetamina / ml de xilazina. O procedimento deve ser feito na capa com uma fonte de luz para manter o animal aquecido.
- Comprima o espaço interdigital do mouse para verificar se o mouse está devidamente anestesiados.
- Posicione o mouse sobre as suas costas. Raspar a área ventral do pescoço e desinfectar com clorexidina e álcool etílico a 70%.
- Levantar a pele da parte ventral superior do pescoço de ratos usando uma pinça dente. Fazer uma pequena incisão (0,5-1,0 cm) acima do timo utilizando um bisturie dissecar cuidadosamente o músculo para expor a traqueia.
- Usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 27 G, injectar lentamente 0,05 ml de ar, seguido por 0,05 ml de NTHi obtidos a partir de uma secção ou solução salina como controlo, seguida por outra de ar de 0,05 ml. Manter animais vertical por cerca de 1 min.
- Fechar a incisão com cola cirúrgica. Mantenha o mouse lateralmente reclinada e quente por cerca de 10 min.
3. Coleção LBA
- Sacrificar o mouse por cervical deslocamento de 24 horas após a infecção.
- Abrir a cavidade abdominal do rato com uma tesoura anatômicas e cortou a aorta ventral a sangrar. Expor a parte ventral do pulmão.
- Expor a traquéia e entubar com um cateter de calibre 20. Instilar 0,8 ml de tampão LBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml de heparina) e recolher a lavagem por aspiração suave. Repita este procedimento três vezes.
- Contar o número total de células em 100 ul de suspensão de LBA utilizando um hemocytometros em 10x com Trypan Blue coloração.
- Preparar lâminas para coloração Giemsa modificado. Alíquota de 100 uL de BALF nos poços apropriados da Cytospin e centrifugar a 500 xg durante 5 min. Secam-se as lâminas durante 10 minutos e corar as células com corante de Giemsa modificado de acordo com os protocolos do fabricante.
- Use as restantes células para posterior análise, tal como células de fluorescência activada (FACS), microscopia confocal, a expressão do gene e western blot 11-13.
4. Preparação Histopatologia
- Para análise histopatológica, infectar ratos com NTHi como descrito no passo 2.4. Após 24 horas de infecção, sacrificar os animais por deslocação cervical. Cortar abrir a cavidade torácica, com uma tesoura anatômicas para expor os pulmões e a traqueia, como mencionado antes. Em seguida, insira o cateter calibre 20 na traqueia.
- Encha os pulmões com 2% de solução de agarose quente preparado em formalina a 4%. Uma vez opulmões são totalmente inflado, gelo lugar no topo dos pulmões para solidificar a solução de agarose.
- Em seguida, retire cuidadosamente a ficha torácica e colocá-lo em uma solução de 50 ml de formalina a 4% em 1x PBS até que seja processada para (H & E) seções hematoxilina e eosina.
5. FACS coloração de células no LBA
- Colocar 1 x 10 5 células do fluido de LBA numa placa de micro titulação de fundo em V de 96 poços.
- Lavar as células com 300 uL de PBS frio 1x e centrifugação a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
- Corar as células com solução de coloração de células em 100 ul de PBS 1x (1: 1000 de diluição) e manter à temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar as células com 300 uL de frio 1x PBS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
- Manter as células em 100 ul de tampão de lavagem de FACS [tampão de lavagem (1x PBS, 2% de FBS, 1 mM de EDTA, 0,1% de azida de sódio] contendo 1: 100 diluído Fc-bloco durante 15 min a 4 ° C.
- células centrifugar a 4000 xg por 3 min e descartar supernatant.
- As células são coradas com 100 ul de coquetel de coloração da superfície (diluição 1: 100) em tampão de lavagem de FACS durante 30 min a 4 ° C.
- Lave as células três vezes com 300 ul de tampão de lavagem FACS a 4000 xg durante 3 minutos a 4 ° C.
- Fixar as células em 100 uL de paraformaldeído a 4% durante 15 min à temperatura ambiente.
- Lavar as células duas vezes com 300 ul de 1x PBS a 400 xg durante 3 min a 4 ° C e re-suspensão em 300 ul de tampão de lavagem de FACS.
- Tornar os controlos de coloração de cor única, utilizando citometria de fluxo esferas.
- Adicionar uma gota de grânulos para a placa de microlitro de 96 poços de fundo em V e lava-se com 200 ul de PBS 1x.
- Adicionar 1 ml de anticorpo de coloração a 100 ul de PBS 1x e grânulos e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
- Lavar as pérolas duas vezes com 300 ul de PBS 1x.
- Analisar controles e células isoladas coradas por citometria de fluxo 14.
6. A homogeneização de tecido pulmonar para isolar RNA
- Após a infecção, recolhe um pequeno pedaço de pulmão (20-40 mg) e mantê-lo em RNA estabilizador reagente a 4 ° C durante a noite. Em seguida, armazená-lo a -80 ° C até ao passo seguinte.
- Lavar os tecidos do pulmão em frio 1x PBS para se livrar do reagente de estabilização RNA.
- Colocar o tecido em um tubo de 1,5 ml de centrífuga contendo tampão de lise (1 mL de tampão de lise + 10 ul β-mercaptoetanol).
- Pique o tecido em pequenos pedaços com uma tesoura de pontas e homogeneizar utilizando um pilão pelota do motor sem fio para 20-40 seg.
- Manter o lisado em gelo durante 5 minutos e continue com a etapa 7.1.
7. RNA isolamento do pulmão
- Centrifuga-se o lisado a 18.000 xg durante 3 min. Remover o sobrenadante por pipetagem e transferir cuidadosamente para um novo tubo de 1,5 mL.
- Adicionar 1 volume de etanol a 70% ao lisado. Misturar imediatamente por pipetagem e esperar por 2-4 min.
- Transferir para 700 ul de lisado a uma coluna de rotação colocadoem um tubo de recolha de 2 ml.
- Centrifugar a 9.600 xg durante 15 seg e descartar o fluxo de passagem.
- Adicionar 350 ul de tampão de lavagem rigorosa e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem.
- Adicionar 80 ul de ADNase I directamente para a membrana da coluna de spin e mantê-lo à temperatura ambiente durante 15 min.
- Adicionar 350 mL de buffer rigorosas de lavagem para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 xg por 15 s. Descartar o fluxo de passagem.
- Adicionar 500 ul de tampão de lavagem de ARN e centrifugar a 9600 xg durante 15 seg. Descartar o fluxo de passagem.
- Adicionar 500 mL de tampão de lavagem RNA e girar a 9.600 g durante 2 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Colocar a coluna de centrifugação em um novo tubo de recolha de 2 ml e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. Descartar o fluxo de passagem.
- Adicionar 30-50 mL água livre de ARNase directamente para a coluna de centrifugação e centrifugar a 9600 x g durante 1 min. ARN armazenar a -80 ° C.
- Realizar a análise de RNA-Seq 14.
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Representative Results
Instilação intra-traqueal resultou num marcadamente aumentada número de leucócitos no LBA (Figura 1A, painel esquerdo) do que a instalação com solução salina. A análise da contagem diferencial dos leucócitos mostrou claramente aumentou a infiltração de neutrófilos (Figura 1, painel da direita). A análise FACS das células no LBA confirmou ainda mais o aumento do número de neutrófilos (Figura 1B). A análise histológica de secções de H @ E-manchadas do tecido pulmonar mostraram aumento da inflamação das vias respiratórias (Figura 1C). Estes dados sugerem que a instilação colectivamente intra-traqueal induz a inflamação das vias respiratórias em ratinhos. Para suportar o uso desta abordagem para o estudo de vias de sinalização que regulam a patogênese das vias aéreas, foram utilizados ratinhos que são deficientes para a ubiquitina-ligase E3 comichão. Itch é conhecido por estar envolvido na regulação da sinalização inflamatória vias 15. Nós inoculadosidade e tipo selvagem pareados por sexo C57BL / 6 controle e Itch - / - ratos com NTHi. Isolámos ARN a partir dos tecidos pulmonares de controlo WT e comichão - / - ratos e realizados toda transcriptoma sequenciação para identificar os genes inflamatórios que são expressos diferencialmente. Como mostrado na Figura 2, a deficiência de coceira resultou na expressão diferencial de vários genes. Isto sugere que a instilação intra-traqueal podem ser utilizados para investigar a inflamação do pulmão, os perfis de expressão de gene e vias de sinalização.
Figura 1: inoculação intra-traqueal de NTHi induz inflamação pulmonar em ratinhos Os ratinhos foram inoculados com NTHi (10 6 CFU / murganho) ou um controlo de solução salina.. 24 horas após a inoculação, os ratinhos foram sacrificados (A) BALF foi recolhido. Determinaram-se os números totais de leucócitos, monócitos e neutrófilos. Os dados são apresentadoscomo médias ± SEM. n = 4 ratinhos / grupo. * Indica p <0,05 em comparação com ratinhos tratados com solução salina. (B) As células no BALF foram coradas com anticorpo anti-Gr1 e analisadas por FACS. (C) H & secções de pulmão mostrando infiltração de leucócitos e inflamação E-manchada. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Expressão diferencial de genes nos pulmões de WT e comichão - / - ratos seguintes intra-traqueal NTHi inoculação 24 h após NTHi inoculação, o RNA foi isolado a partir dos pulmões de dois WT (1, 2) e dois Itch - / -. (1, 2) ratinhos. (A) A qualidade do RNA foi analisado usando um Bioanalyzer. (B) mapa de calor mostrando Z-scores (interpretado como uma medida de sd longe deda média) para a contagem log 2 por milhão (log 2 CPM) de 172 genes diferencialmente expressos identificados usando Edger na Itch - / -. comparação com ratinhos WT Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Aqui, nós descrevemos um procedimento único e minimamente invasivo para inocular os pulmões de ratinhos com um agente patogénico bacteriano pulmão. Nós demonstramos que este procedimento pode ser utilizado para estudar a função de genes diferentes que utilizam ratinhos que são deficientes em genes de vias de sinalização inflamatórias. Este procedimento também pode ser usado para estudar as respostas inflamatória a infecções pulmonares virais e fúngicas. As vantagens deste processo em relação aos outros métodos, tais como intranasal ou por inalação de aerossol são (1) neste procedimento, o inoculo patogénico está directamente instilada no tracto respiratório inferior; (2) a capacidade para controlar o tamanho do inoculo; e (3) redução do risco de exposição bacteriana para o manipulador.
Exposição da traquéia cirurgicamente para incutir bactérias é um passo crucial onde os cuidados devem ser tomados para evitar causar danos aos tecidos circundantes, especialmente os vasos sanguíneos.
A instilação de bactérias na traqueia SHould ser feito com cuidado para evitar a possibilidade da morte dos ratos por asfixia. Sugere-se que o inoculo (cerca de 50 uL) ser libertada lentamente e o ar ser injectado antes e depois do inoculo. Mantendo o mouse vertical, após a instilação por um tempo e mantê-los lateralmente recumbent facilita a recuperação mais rápida. A desvantagem principal deste procedimento é que as exposições múltiplas dentro de um curto período de tempo não são possíveis devido à necessidade da cirurgia. Um problema potencial é que, se o cateter está colocado demasiado profunda no brônquio, a contagem de células BALF será menor. Este problema pode ser resolvido, puxando o tubo ligeiramente para cima.
Uma vez que a incidência de doenças das vias respiratórias inflamatória estão a aumentar em todo o mundo 3,16, o entendimento da fisiopatologia dessas doenças é de primordial importância. As tecnologias descritas neste estudo poderia ajudar a identificar vias reguladoras chave e poderia facilitar o desenvolvimentode novas modalidades de tratamento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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