Abstract
هنا، نحن تصف إجراءات تفصيلية لكفاءة وتسليم مباشرة المستدمية النزلية في المجاري التنفسية السفلى من الفئران. ونحن لشرح إجراءات إعداد ه. النزلية اللقاح، تقطير داخل القصبة الهوائية من H. النزلية في الرئة، وجمع السائل النزلة السنخ غسيل (BALF)، وتحليل الخلايا المناعية في BALF، وعزل الحمض النووي الريبي لتحليل التعبير الجيني المغاير. هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة استجابة الرئة الالتهابية إلى أي بكتيريا، أو فيروس الفطريات. ويفضل القصبة الهوائية تقطير المباشر في الغالب على إجراءات الأنف أو استنشاق الهباء الجوي لأنها توفر أكثر كفاءة اللقاح البكتيري في الجهاز التنفسي السفلي مع أقل الغموض.
Introduction
التهاب هو الآلية المناعية الأساسية للدفاع ضد العوامل المعدية. وهي تشجع القضاء على مسببات المرض وإصلاح الأنسجة التالفة. كما أنها تسهل عملية الانتعاش إلى حالة صحية طبيعية 1. ومع ذلك، والتهاب dysregulated غالبا ما يؤدي إلى الأمراض الالتهابية المزمنة 2. التهاب الشعب الهوائية هو السبب المبدئي للأمراض الرئوية مختلفة مثل مرض الانسداد الرئوي المزمن (COPD)، الربو وتليف رئوي 3.
ويرتبط عدم typeable (unencapsulated) المستدمية النزلية (NTHi) مع الأمراض الالتهابية العلوية والسفلية الرئة المزمنة 4،5. ومن الأنواع السائدة معزولة عن الشعب الهوائية أقل من الأطفال والبالغين الذين يعانون من الانسداد 4،6،7 أمراض الرئة المزمنة. وتتميز الاستجابة الالتهابية بعد الإصابة NTHi قبل upregulation من السيتوكينات proinflammatory (مثل TNF و IL-1β)، وتوسط ذلك بذ mitogen البروتين كيناز تفعيلها (MAPK) والنووي عامل كيلوبايت (NF كيلوبايت) من خلال مستقبلات تول مثل (TLRs) 8.
نماذج الماوس أدوات مفيدة جدا لتحليل الأمراض الكامنة وراء مرض التهاب الرئة بسبب توافر خطوط الجينات ناقصة مختلفة. وقد استخدمت عدة طرق لتطعيم البكتيريا الحية / الموهن والمنتجات البكتيرية، بما في ذلك تقطير الأنف ورذاذ 9،10 الاستنشاق. هنا، علينا أن نظهر داخل القصبة الهوائية تقطير. على الرغم من أن أقل استخداما، وهذا النهج هو أكثر كفاءة وتكرار للغاية نظرا للتسليم المباشر من اللقاح في الجهاز التنفسي السفلي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
أجريت جميع التجارب وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة المؤسسي رعاية الحيوان واستخدام (IACUC) من معهد بحوث بايلور.
1. التثقيف غير typeable المستدمية النزلية (NTHi) وإعداد اللقاح
- لوحة NTHi على لوحة أجار الشوكولاته والحفاظ على لوحة رأسا على عقب في ترطيب CO 2 حاضنة بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪. اليوم، ثقافة التالية البكتيريا في مرق الدماغ القلب ضخ. ثم، إضافة 1 مل من مرق في أنبوب 1.5 مل العقيمة.
- أجهزة الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم، تجاهل طاف وإعادة تعليق بيليه في 1 مل العقيمة برنامج تلفزيوني 1X. كرر هذه الخطوة مرة واحدة.
- نقل 100 ميكرولتر من إعادة علقت الحل في 900 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X وقياس الامتصاصية للثقافة المخفف في 600 نانومتر الطول الموجي في معمل.
- تحديد وحدة سلامة وتشكيل مستعمرةالصورة (CFUs) من اللقاح عن طريق زراعة 01:10 التخفيفات المسلسل على لوحات الشوكولاته أجار وتفرخ بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
- وبناء على جدوى وCFUs تحديد من الخطوة السابقة، وضبط اللقاح إلى تركيز النهائي من 20 × 10 6 خلية / مل.
2. الناشبة داخل القصبة الهوائية (عليه) تقطير
- حقن فأر داخل الصفاق (IP) مع 0.1 مل / 10 غرام من وزن الجسم من الفأر مع 150 ملغ / مل الكيتامين + 20 ملغ / مل حل زيلازين. وينبغي أن يتم هذا الإجراء في غطاء محرك السيارة مع مصدر الضوء للحفاظ على الحارة الحيوان.
- قرصة الفضاء بين الأصابع من الفأرة للتحقق من أن الفأر هو تخدير كاف.
- ضع الماوس على ظهرها. حلاقة المنطقة البطنية من الرقبة وتعقيم مع الكلورهيكسيدين و 70٪ الكحول الإيثيلي.
- رفع الجلد من الجزء البطني العلوي من الرقبة باستخدام ملقط الأسنان الفئران. إجراء شق صغير (0،5-1،0 سم) فوق الغدة الصعترية باستخدام مشرطوتشريح بعناية العضلات لفضح القصبة الهوائية.
- باستخدام حقنة 1 مل مع إبرة 27 G، وضخ ببطء 0.05 مل الهواء، تليها 0.05 مل NTHi تم الحصول عليها من القسم 1 أو المالحة كعنصر تحكم، تليها جوية أخرى 0.05 مل. إبقاء الحيوانات الرأسي لحوالي 1 دقيقة.
- إغلاق شق مع الغراء الجراحية. الحفاظ على الماوس راقد أفقيا ودافئة لمدة 10 دقيقة.
3. BALF مجموعة
- التضحية الماوس عن طريق عنق الرحم التفكك 24 ساعة بعد الإصابة.
- فتح تجويف البطن من الفأرة مع مقص التشريحية وقطع الشريان الأورطي البطني ينزف. كشف الجزء البطني من الرئة.
- فضح القصبة الهوائية وتدخله مع قسطرة قياس 20. غرس 0.8 مل من العازلة BALF (برنامج تلفزيوني 1X، 0.1٪ سكر العنب، 10 U / مل الهيبارين) وجمع غسيل من قبل التطلع لطيف. كرر هذا الإجراء ثلاث مرات.
- عد العدد الكلي للخلايا في 100 ميكرولتر من تعليق BALF باستخدام hemocytoمتر تحت التكبير 10X مع تلطيخ التريبان الأزرق.
- إعداد الشرائح لتعديل تلطيخ بالغيمزا. قسامة 100 ميكرولتر من BALF في الآبار الملائمة للcytospin وأجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجفيف الشرائح لمدة 10 دقيقة وصمة عار على الخلايا باستخدام تعديل بالغيمزا صمة عار وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
- استخدام الخلايا المتبقية لتحليلها لاحقا، مثل تنوير خلية تنشيط الفرز (FACS)، الفحص المجهري متحد البؤر، التعبير الجيني وصمة عار الغربية 11-13.
4. إعداد التشريح المرضي
- لتحليل أمراض الأنسجة، ويصيب الفئران مع NTHi كما هو موضح في الخطوة 2.4. بعد 24 ساعة من العدوى، والتضحية الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم. خفض فتح التجويف الصدري مع مقص التشريحية لفضح الرئتين والقصبة الهوائية كما ذكر من قبل. ثم، تضاف قسطرة قياس 20 إلى القصبة الهوائية.
- ملء الرئة مع 2٪ محلول الاغاروز دافئ أعد في 4٪ من الفورمالين. مرة واحدة فيوتضخم الرئتين تماما، مكان الثلج على قمة الرئتين لترسيخ الحل الاغاروز.
- ثم، وإزالة بعناية المكونات الصدري ووضعها في محلول 50 مل من 4٪ من الفورمالين في برنامج تلفزيوني 1X حتى تتم معالجتها لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) أقسام.
5. FACS تلطيخ الخلايا في BALF
- وضع 1 × 10 5 خلايا من السائل BALF في 96-جيدا لوحة عيار الصغيرة-V السفلي.
- غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X وتدور في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- وصمة عار على الخلايا مع حل الخلية وصمة عار في 100 1X ميكرولتر PBS (1: 1000 تمييع) والحفاظ على درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- غسل الخلايا مع 300 ميكرولتر من البرد برنامج تلفزيوني 1X في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إبقاء الخلايا في 100 ميكرولتر من العازلة FACS غسل [غسل العازلة (برنامج تلفزيوني 1X، 2٪ FBS، 1 ملم EDTA، 0.1٪ أزيد الصوديوم] التي تحتوي على 1: 100 المخفف FC-بلوك لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- خلايا الطرد المركزي في 4000 x ج لمدة 3 دقائق وتجاهل سوبernatant.
- خلايا وصمة عار مع 100 ميكرولتر تلطيخ السطح كوكتيل (1: 100 تمييع) في غسل العازلة FACS لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- غسل خلايا ثلاث مرات مع 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS في 4000 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية.
- إصلاح الخلايا في 100 ميكرولتر من بارافورمالدهيد 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
- غسل الخلايا مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X في 400 x ج لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية واعادة تعليق في 300 ميكرولتر من غسل العازلة FACS.
- جعل الضوابط تلطيخ أحادية اللون باستخدام التدفق الخلوي الخرز.
- إضافة قطرة واحدة من الخرز في 96-جيدا لوحة ميكروليتر-V القاع، ويغسل مع 200 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
- إضافة 1 ميكرولتر من الأجسام المضادة تلطيخ إلى 100 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X والخرز واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
- تغسل حبات مرتين مع 300 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
- تحليل الضوابط واحدة الملطخة والخلايا عن طريق التدفق الخلوي 14.
6. التجانس من أنسجة الرئة لعزل الحمض النووي الريبي
- بعد الإصابة، وجمع قطعة صغيرة من الرئة (20-40 ملغ) وابقائه في الحمض النووي الريبي استقرار الكاشف في 4 درجات مئوية خلال الليل. ثم، واحفظها في -80 درجة مئوية حتى الخطوة التالية.
- غسل الأنسجة الرئوية في البرد برنامج تلفزيوني 1X للتخلص من كاشف استقرار الحمض النووي الريبي.
- وضع الأنسجة في 1.5 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على تحلل العازلة (1 مل تحلل عازلة + 10 ميكرولتر β-المركابتويثانول).
- ختم الأنسجة الى قطع صغيرة باستخدام مقص وأشار والتجانس باستخدام اللاسلكية مدقة بيليه السيارات ل20-40 ثانية.
- إبقاء المحللة على الجليد لمدة 5 دقائق والمضي قدما في الخطوة 7.1.
7. عزل الحمض النووي الريبي من الرئة
- الطرد المركزي المحللة في 18000 x ج لمدة 3 دقائق. إزالة طاف قبل pipetting ونقل بعناية لأنبوب 1.5 مل جديد.
- إضافة إلى حجم 1 من 70٪ من الإيثانول لالمحللة. مزيج فورا من قبل pipetting والانتظار لمدة 2-4 دقيقة.
- نقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من المحللة لعمود الدوران وضعتفي أنبوب جمع 2 مل.
- أجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية، وتجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 80 ميكرولتر الدناز أنا مباشرة لغشاء عمود الدوران والاحتفاظ بها في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إضافة 350 ميكرولتر غسل العازلة صرامة لعمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 15 ثانية. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 500 ميكرولتر غسل العازلة RNA وتدور في 9600 x ج لمدة 2 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
- ضع عمود الدوران في أنبوب جديد لجمع 2 مل وأجهزة الطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تجاهل التدفق من خلال.
- إضافة 30-50 المياه خالية من ريبونوكلياز ميكرولتر مباشرة إلى عمود الدوران والطرد المركزي في 9600 x ج لمدة 1 دقيقة. تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.
- لتحليل RNAseq 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
أدى تقطير داخل القصبة الهوائية في العدد المتزايد بشكل ملحوظ من الكريات البيض في BALF (الشكل 1A، غادر لوحة) من تركيب بمحلول ملحي. أظهر تحليل العد التفريقي لكريات الدم البيضاء وبوضوح زيادة تسلل العدلات (الشكل 1، اللوحة اليمنى). تحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية من الخلايا في BALF أكد كذلك زيادة عدد العدلات (الشكل 1B). التحليل النسيجي للأقسام H & E الملون في أنسجة الرئة أظهرت زيادة التهاب الشعب الهوائية (الشكل 1C). وتشير هذه البيانات مجتمعة أن تقطير داخل القصبة الهوائية يدفع التهاب الشعب الهوائية في الفئران. لدعم استخدام هذا النهج لدراسة مسارات إشارات التي تنظم مجرى الهواء المرضية، كنا الفئران التي تعاني من نقص في E3 يغاز اليوبيكويتين حكة. ومن المعروف حكة أن تشارك في تنظيم الإشارات التهاب الممرات 15. نحن تلقيحالعمر والنوع البري المطابقة الجنس C57BL / 6 السيطرة وحكة - / - الفئران مع NTHi. نحن عزل الحمض النووي الريبي من أنسجة الرئة من WT السيطرة وحكة - / - الفئران ويقوم كله Transcriptome على التسلسل للتعرف على الجينات الالتهابية التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف. كما هو مبين في الشكل 2، أدى نقص حكة في التعبير التفاضلية من عدة جينات. هذا يشير إلى أن داخل القصبة الهوائية تقطير يمكن استخدامها لتحقيق التهاب الرئة، وملامح التعبير الجيني ومسارات إشارات.
الشكل 1: التلقيح البينية القصبة الهوائية من NTHi يدفع التهاب الرئة في فئران تم تلقيح الفئران مع NTHi (10 6 خلية / الماوس) أو عنصر تحكم المالحة. 24 ساعة بعد التطعيم، تمت التضحية الفئران (A) BALF تم جمعها. وتم تحديد إجمالي أعداد الكريات البيض، الوحيدات والعدلات. وتعرض البياناتكما يعني ± SEM. ن = 4 الفئران / مجموعة. * تشير ف <0.05 بالمقارنة مع الفئران التي عولجت المالحة. (ب) كانت ملطخة الخلايا في BALF مع anti-GR1 الأجسام المضادة وتحليلها من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية. (C) H & الملون E-أقسام الرئة تظهر تسلل الكريات البيض والالتهابات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعبير الجيني التفاضلية في الرئتين من WT وحكة - / - الفئران التالية داخل القصبة الهوائية NTHi تلقيح 24 ساعة بعد NTHi تلقيح، والحمض النووي الريبي معزولة من الرئتين اثنين WT (1، 2) واثنين من حكة - / -. (1، 2) الفئران. تم تحليل (A) الحمض النووي الريبي الجودة باستخدام bioanalyzer. (ب) خريطة الحرارة تظهر Z-العشرات (تفسر على أنها مقياس التنمية المستدامة بعيدا عنفي الوسط) لفرز سجل 2 لكل مليون (تسجيل 2 CPM) من 172 الجينات وأعرب تفاضلي التي تم تحديدها باستخدام المقلم في حكة - / - بالمقارنة مع الفئران WT الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا، نحن تصف الإجراء الفريد والغازية الحد الأدنى لتطعيم الرئتين من الفئران مع العوامل المسببة للأمراض الرئة البكتيري. علينا أن نظهر أن هذا الإجراء يمكن أن تستخدم لدراسة وظيفة الجينات المختلفة باستخدام الفئران التي تعاني من نقص في الجينات من مسارات الإشارات التهابات. ويمكن أيضا أن هذا الإجراء يمكن استخدامها لدراسة الاستجابات الالتهابية للعدوى الرئة الفيروسية والفطرية. و(1) في هذا الإجراء، يتم غرس مزايا هذا الإجراء عبر وسائل أخرى مثل الأنف أو استنشاق الهباء الجوي اللقاح المسببة للأمراض مباشرة إلى الجهاز التنفسي السفلي. (2) القدرة على التحكم في حجم اللقاح. و (3) تخفيض خطر التعرض للبكتيريا إلى المعالج.
تعرض القصبة الهوائية جراحيا لغرس البكتيريا هو خطوة حاسمة حيث يجب توخي الحذر لتجنب التسبب في الأضرار التي لحقت الأنسجة المحيطة بها، وخاصة في الأوعية الدموية.
تقطير من البكتيريا في ش القصبة الهوائيةولد أن يتم بعناية لتجنب احتمال وفاة الفئران بسبب الاختناق. ويقترح أن اللقاح (حوالي 50 ميكرولتر) يتم الافراج ببطء ويتم حقن الهواء قبل وبعد اللقاح. الحفاظ على الماوس رأسي بعد تقطير لفترة من الوقت وابقائها راقد أفقيا يسهل سرعة الشفاء. العيب الرئيسي لهذا الإجراء هو أن التعرض لأخطار متعددة خلال فترة قصيرة من الزمن ليست ممكنة نظرا لمتطلبات عملية جراحية. مشكلة محتملة هي أنه إذا تم وضع القسطرة عميق جدا في القصبات الهوائية، وعدد خلايا BALF سيكون أقل. ويمكن حل هذه المشكلة عن طريق سحب أنبوب أعلى قليلا.
منذ الإصابة بالأمراض الهوائية التهابات تتزايد في جميع أنحاء العالم 3،16، فهم الفيزيولوجيا المرضية لهذه الأمراض هو من أهمية قصوى. التقنيات الموضحة في هذه الدراسة يمكن أن تساعد على تحديد مسارات التنظيمية الرئيسية ويمكن أن تسهل تطويرمن طرق العلاج الجديدة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
