Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Intra-трахеи Администрация Published: March 2, 2016 doi: 10.3791/53964
Automatic Translation
1, 1, 1
1Baylor Institute for Immunology Research, Baylor Research Institute

Abstract

Здесь мы опишем подробную процедуру эффективно и непосредственно доставить гемофильной инфекции в нижних дыхательных путей у мышей. Показана процедура подготовки H. инокулята гриппа, внутри трахеи закапывания H. гриппа в легкие, коллекция бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), анализ иммунных клеток в БАЛ и выделения РНК для дифференциального анализа экспрессии генов. Эта процедура может быть использована для изучения легких воспалительной реакции на любые бактерии, вирусы или грибы. Прямая трахеи инстилляции в основном предпочтительнее интраназального или аэрозольные ингаляции процедур, так как он более эффективно доставляет бактериального инокулята в нижних отделах дыхательных путей с меньшей неоднозначностью.

Introduction

Воспаление является основной иммунный механизм защиты против инфекционных агентов. Это способствует ликвидации патогенных микроорганизмов и ремонт поврежденной ткани. Это также облегчает восстановление до нормального здорового состояния 1. Тем не менее, дизрегуляции воспаление часто приводит к хроническим воспалительным заболеваниям 2. Воспаление дыхательных путей является начальным толчком для различных легочных заболеваний , таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма и легочный фиброз 3.

Нетипируемых (некапсулированного) гемофильной (NTHi) связан с хроническими верхней и нижней легочных воспалительных заболеваний 4,5. Это доминирующий вид , выделенные из нижних дыхательных путей у детей и взрослых с хронической обструктивной болезнью легких 4,6,7. Воспалительная реакция после NTHi инфекции характеризуется повышающей регуляции провоспалительных цитокинов (таких как TNF и IL-1 & beta;), и он опосредован бу митоген активированный протеин киназа (МАРК) и ядерный фактор-kB (NF-kB) через Toll-подобных рецепторов (TLRs) 8.

Мышиные модели являются очень полезными инструментами для анализа, лежащей в основе патологии легких воспалительного заболевания из-за наличия различных генов-дефицитных линий. Существует несколько методов были использованы для инокуляции живых / ослабленные бактерии и бактериальные продукты, в том числе интраназального закапывания и аэрозольного ингаляционного 9,10. Здесь мы демонстрируем внутри трахеи закапывания. Несмотря на то, используется менее часто, такой подход является более эффективным и высокой воспроизводимостью, из-за прямой доставки прививочного материала в нижних отделах дыхательных путей.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) научно-исследовательского института Бейлора.

1. Культивирование нетипируемых гемофильной (NTHi) и подготовка посевного материала

  1. Пластина NTHI на агаровой пластине шоколада и держать тарелку вверх дном в увлажненной CO 2 инкубаторе в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% CO 2. На следующий день, культура бактерий в сердечно-мозговым бульоне. Затем добавляют 1 мл бульона в стерильный 1,5 мл трубки.
  2. Центрифуга при 4000 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем отбросить супернатант и повторно приостанавливать осадок в 1 мл стерильного 1x PBS. Повторите этот шаг один раз.
  3. Перенести 100 мкл ресуспендировали раствора в 900 мкл PBS и 1х измеряют оптическую плотность разведенной культуры при 600 нм в спектрофотометре.
  4. Определить жизнеспособность и колониеобразующих единицыс (КОЕ) посевного материала посредством культивировани 1:10 серийных разведений на шоколад чашках с агаром и инкубировали в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% CO 2.
  5. На основе жизнеспособности и КОЕ , определенной на предыдущем шаге, регулировать прививочный материал до конечной концентрации 20 х 10 6 КОЕ / мл.

2. Intra-трахеи (она) Инстилляции

  1. Вводят мыши внутрибрюшинно (IP) с 0,1 мл / 10 г массы тела мыши с / мл кетамина + 20 мг / мл ксилазина раствора 150 мг. Процедура должна быть выполнена в капюшоне с источником света, чтобы держать животное в тепле.
  2. Зажмите межпальцевых пространство мыши, чтобы убедиться, что мышь адекватно наркозом.
  3. Поместите мышь на его спине. Бритье вентральной области шеи и дезинфицировать с хлоргексидином и 70% этилового спирта.
  4. Подтяжка кожи верхней вентральной части шеи с помощью щипцов зубов крыс. Сделайте небольшой надрез (0,5-1,0 см) выше тимуса с помощью скальпеляи осторожно рассекают мышцы, чтобы разоблачить трахеи.
    1. С помощью 1 мл шприц с иглой 27 G, медленно вводят 0,05 мл воздуха, а затем 0,05 мл NTHi, полученных из секции 1 или физиологического раствора в качестве контрол, а затем еще 0,05 мл воздуха. Держите животное по вертикали около 1 мин.
  5. Закрыть разрез с хирургическим клеем. Держите мышь в боковом лежачем положении и тепло в течение приблизительно 10 мин.

3. БАЛ Коллекция

  1. Жертвоприношение мышь путем смещения шейных позвонков 24 ч после заражения.
  2. Откройте брюшную полость мыши с анатомическими ножницами и разрезать брюшную аорту кровотечению. Выставляют вентральной части легкого.
  3. Expose трахеи и интубации его с 20 калибра катетера. Привить 0,8 мл буфера БАЛ (1x PBS, 0,1% декстрозы, 10 Ед / мл гепарин) и собирают промывание путем осторожного аспирации. Повторите эту процедуру три раза.
  4. Подсчитать общее количество клеток в 100 мкл БАЛ суспензии с использованием hemocytoметр под 10-кратным увеличением с окрашивания трипановым синим.
  5. Подготовка слайдов для модифицированного окрашивания Гимза. Алиготе 100 мкл БАЛ в соответствующие лунки цитоспина и центрифуге при 500 мкг в течение 5 мин. Высушите слайды в течение 10 мин и окрашивают клетки с использованием модифицированной Гимза в соответствии с протоколами производителя.
  6. Используйте оставшиеся клетки для последующего анализа, такие как активированный цветения сортировки клеток (FACS), конфокальной микроскопии, экспрессии генов и вестерн - блоттинга 11-13.

4. Гистологическое Подготовка

  1. Для анализа патоморфологическую, заражают мышей с NTHi, как описано на стадии 2.4. Через 24 часа инфекции, принести в жертву животных путем смещени шейных позвонков. Разрежьте грудной полости с анатомическими ножницами, чтобы обнажить легкие и трахею, как упоминалось ранее. Затем вставьте 20 калибра катетер в трахею.
  2. Заполните легкие с 2% агарозном раствором теплой, полученного в 4% формалине. ОднаждыЛегкие полностью надут, место лед на вершине легких для затвердевания раствора агарозы.
  3. Затем, осторожно удалите грудную пробку и положить его в раствор 50 мл 4% -ного формалина в 1x PBS до тех пор, пока не будет обработан для (H & E) разделы гематоксилином и эозином.

5. FACS окрашиванием клеток в БАЛ

  1. Положите 1 х 10 5 клеток из БАЛ жидкости в V-дно микро титра пластины 96-луночного.
  2. Промыть клетки с 300 мкл холодного 1x PBS и спина при 4000 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
  3. Пятно клетки с раствором клеток пятно в 100 мкл 1x PBS (1: 1000 разведение) и хранить при комнатной температуре в течение 15 мин.
  4. Промыть клетки с 300 мкл холодного 1x PBS при 4000 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
  5. Хранить клеток в 100 мкл FACS буфера для промывки [промывочным буфером (1х PBS, 2% FBS, 1 мМ ЭДТА, 0,1% азида натрия], содержащий 1: 100 разбавленный Fc-Block в течение 15 мин при температуре 4 ° С.
  6. Центрифуга клетки при 4000 мкг в течение 3 мин и выбросьте вирernatant.
  7. Пятно клетки с 100 мкл поверхностного окрашивания коктейль (разведение 1: 100) в FACS буфере для промывки в течение 30 мин при 4 ° С.
  8. Промыть клетки трижды по 300 мкл FACS буфера для промывки при 4000 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С.
  9. Закрепить клеток в 100 мкл 4% параформальдегидом в течение 15 мин при комнатной температуре.
  10. Промыть клетки дважды 300 мкл 1x PBS при 400 х г в течение 3 мин при температуре 4 ° С и повторно приостанавливать в 300 мкл FACS буфера для промывки.
  11. Сделайте одноцветных контроля окрашивания с использованием проточной цитометрии шариков.
    1. Добавьте одну каплю бисера в 96-луночного V-нижней пластине микролитров и промывают 200 мкл 1x PBS.
    2. Добавить 1 мкл меченых антител к 100 мкл 1x PBS и бусин и инкубировать при комнатной температуре в течение 5 мин.
    3. Вымойте бусин в два раза с 300 мкл 1x PBS.
  12. Анализ одиночных пятнах контроля и клеток с помощью проточной цитометрии 14.

6. Усреднение легочную ткань для выделения РНК

  1. После заражения, собрать небольшой кусок легкого (20-40 мг) и держать его в РНК стабилизации реагента при 4 ° С в течение ночи. Затем, не хранить его при температуре -80 ° C до следующего этапа.
  2. Вымойте ткани легкого в холодной 1x PBS, чтобы избавиться от реагента стабилизации РНК.
  3. Поместите ткань в 1,5 мл центрифужную пробирку, содержащую буфера для лизиса в (1 мл буфера для лизиса + 10 мкл β-меркаптоэтанол).
  4. Нарежьте ткань на мелкие кусочки, используя острые ножницы и гомогенизируют с помощью беспроводного двигателя гранул пестиком в течение 20-40 сек.
  5. Держите лизата на льду в течение 5 мин и переходите к шагу 7.1.

7. Выделение РНК из легких

  1. Центрифуга лизат при 18000 мкг в течение 3 мин. Удалить супернатант с помощью пипетки и осторожно перенести его на новый 1,5 мл трубки.
  2. Добавить 1 объем 70% -ного этанола в лизата. Смешайте немедленно пипеткой и ждать в течение 2-4 мин.
  3. Трансфер до 700 мкл лизата в ротационную колонку помещенногов пробирку для сбора 2 мл.
  4. Центрифуга при 9,600 мкг в течение 15 сек и отбросить проточные.
  5. Добавить 350 мкл промывочного буфера жесткие и центрифуге при 9,600 мкг в течение 15 сек. Выбросьте проточные.
  6. Добавьте 80 мкл ДНКазы I непосредственно к мембране ротационную колонку и держать его при комнатной температуре в течение 15 мин.
  7. Добавить 350 мкл промывочного буфера жесткие в колонну спина и центрифуге при 9,600 мкг в течение 15 сек. Выбросьте проточные.
  8. Добавить 500 мкл промывочного буфера РНК и центрифуге при 9,600 мкг в течение 15 сек. Выбросьте проточные.
  9. Добавить 500 мкл промывочного буфера РНК и спина при 9,600 мкг в течение 2 мин. Выбросьте проточные.
  10. Поместите колонку спина в новую пробирку для сбора 2 мл и центрифуге при 9,600 мкг в течение 1 мин. Выбросьте проточные.
  11. Добавить 30-50 мкл РНКазы воды непосредственно в колонну спина и центрифуге при 9,600 мкг в течение 1 мин. Магазин РНК при -80 ° С.
  12. Выполните анализ Секвенирование РНК 14.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Intra-трахеи закапывания привело к значительно увеличению числа лейкоцитов в БАЛ (рис 1А, левая панель) , чем установка с физиологическим раствором. Дифференциальный подсчет анализ лейкоцитов ясно показали повышенную нейтрофильной инфильтрации (рис 1, правая панель). Анализ FACS - клеток в БАЛ дополнительно подтверждено увеличение числа нейтрофилов (Фигура 1В). Гистологический анализ Н & Е-окрашенных участках легочной ткани показали увеличение воспаление дыхательных путей (фиг.1С). Эти данные в совокупности свидетельствуют о том, что внутри трахеи инстилляции вызывает воспаление дыхательных путей у мышей. Для того, чтобы поддержать использование этого подхода для изучения сигнальных путей, которые регулируют дыхательные пути патогенеза, мы использовали мышей, которые являются недостаточными для E3 убиквитинлигазы Itch. Зуд , как известно, участвует в регуляции воспалительной сигнальных путей 15. Мы прививаливозраста и пола соответствует дикого типа управления C57BL / 6 и Itch - / - мышей с NTHi. Мы выделили РНК из ткани легких управления WT и чесаться - / - мышей и проводили весь транскриптом секвенирования для выявления воспалительных генов, которые дифференцированно выражены. Как показано на рисунке 2, дефицит Зуд приводит к дифференциальной экспрессии нескольких генов. Это говорит о том, что внутри трахеи закапывания может быть использован для исследования воспаления легких, профили экспрессии генов и сигнальных путей.

Рисунок 1
Рисунок 1: Intra-трахеи инокуляция NTHi вызывает воспаление легких у мышей , мышей заражают NTHi (10 6 КОЕ / мышь) или контрольным солевым раствором.. 24 ч после инокуляции мышей забивали (А) БАЛ была собрана. Суммарные лейкоциты, моноциты и нейтрофилы числа были определены. представлены данныекак средство ± SEM. п = 4 мышей / группа. * Указывает р <0,05 по сравнению с обработанных солевым раствором мышей. (В) Клетки в БАЛ окрашивали анти-Gr1 антителом и анализировали с помощью FACS. (C) H & E-окрашенные срезы легких , показывающие инфильтрацию лейкоцитов и воспаление. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
На рисунке 2: экспрессия гена Дифференциальный в легких WT и Itch - / - мышей после внутри трахеи NTHi прививка 24 ч после того, как NTHi инокуляции, РНК выделяли из легких двух WT (1, 2) и два Зуд - / -. (1, 2) у мышей. (А) качество РНК анализировали с использованием Bioanalyzer. (B) Тепловая карта , показывающая Z-баллы (интерпретируется как мера УР отсреднее) для подсчета журнала 2 на миллион (вход 2 CPM) 172 дифференцированно выраженных генов , идентифицированных с помощью Кромкообрезная в Itch - / -. по сравнению с мышами WT Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Здесь мы описываем уникальную и минимально инвазивные процедуры для инокуляции легких мышей с бактериальным патогеном легких. Показано, что эта процедура может быть использована для изучения функции различных генов с использованием мышей, которые дефицитны по генам воспалительных сигнальных путей. Эта процедура также может быть использован для изучения воспалительные реакции на вирусные и грибковые инфекции легких. Преимущества этой процедуры по сравнению с другими методами, такими как интраназального или аэрозольной ингаляции (1) в этой процедуре, патогенный инокулят непосредственно закапывают в нижних отделах дыхательных путей; (2) возможность контролировать размер инокулята; и (3) снижение риска бактериального воздействия обработчика.

Воздействие трахеи хирургическим путем для привития бактерий является важным шагом, где необходимо позаботиться, чтобы избежать причинения вреда окружающим тканям, особенно кровеносных сосудов.

Внушение бактерий в трахею шульд быть сделано тщательно, чтобы избежать возможности смерти мышей из-за удушья. Предполагается, что прививочный материал (около 50 мкл) будет выпущен медленно и воздух быть введен до, так и после того, как посевного материала. Поддержание мыши по вертикали после закапывания некоторое время и держать их в боковом направлении лежачем способствует более быстрому восстановлению. Основным недостатком этой процедуры заключается в том, что несколько экспозиций в течение короткого периода времени, не представляется возможным из-за необходимости проведения операции. Потенциальная проблема в том, что, если катетер помещают слишком глубоко в бронхи, граф БАЛ клеток будет ниже. Эта проблема может быть решена путем вытягивания трубки слегка вверх.

Так как частота воспалительных заболеваний дыхательных путей растет во всем мире 3,16, понимание патофизиологии этих заболеваний имеет первостепенное значение. Технологии, описанные в данном исследовании, может помочь выявить ключевых регуляторных путей и может способствовать развитиюновых методов лечения.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Chocolate agar plate Fisher Scientific CAS50-99-7
Dextrose Anhydrous Themo Scientific R01300
Heparin Hospira,Inc RL-3010
Deft quick solution Sigma GS500-500ML
Syringe needle 20/26G  BD (REF305115/175)
Iml syringe BD REF 309602
Catheter 20GA BD REF 381433
Dissecting Scissors, straight, 10 cm long kentscientific INS600393
Iris Forceps, serrated, 10cm long kentscientific INS650915
Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long kentscientific INS600095
10% Formalin Fisher Scientific CAS 67-56-1
Agarose peqlab 35-1020
5ml polystyrene round-bottom tubes BD REF 352058
1.5 ml Microcentrifuge tubes Light Labs A-7001-R
Reasy Mini  kit  Qiagen 74104
Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) Sigma Z359971-1EA
96 well microtiter plates V bottom Thermo 2605
1X PBS Gibco 10010-023
OneComp eBeads eBioscience 01-1111-42
CD45.2-APC eBioscience 17-0454-81 Working dilution 1:100
Ly-6G-eFlor 450 eBioscience 48-5931-82 Working dilution 1:100
BSA HyClone SH30574.03
RBC Lysis Buffer (10X) Biolegend 420301
Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit Invitrogen L-34957
EDTA (0.5M) lifetechnologies 15575-020
CD16/CD32 FcBlock BD 553142
Facs tubes polystyrene round bottom tube BD 352052
Formaldehyde Polyscience 4018

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
  2. Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
  3. Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
  4. Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
  5. King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
  6. Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
  7. King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
  8. Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
  9. Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
  10. Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
  11. Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
  12. Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
  13. Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
  14. Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
  15. Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
  16. Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M. Chronic obstructive pulmonary disease. Lancet. 379, 1341-1351 (2012).

Tags

Immunology выпуск 109 Воспаление, Внутри трахеи респираторно патоген экспрессия генов клеточной сигнализации
Intra-трахеи Администрация<em&gt; Гемофильной</em&gt; В мышиные модели для изучения Воспаление дыхательных путей
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Venuprasad, K., Theivanthiran, B.,… More

Venuprasad, K., Theivanthiran, B., Cantarel, B. Intra-tracheal Administration of Haemophilus influenzae in Mouse Models to Study Airway Inflammation. J. Vis. Exp. (109), e53964, doi:10.3791/53964 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter