Мы демонстрируем процедуру внутритрахеального введения Haemophilus influenzae в нижние дыхательные пути мышей. Это очень полезный инструмент для изучения сигнальных путей, которые регулируют воспаление дыхательных путей на мышиных моделях.
Для просмотра этого контента требуется подписка на JoVE. Войдите или начните свой бесплатный пробный период.
В этой статье
Краткое содержание
Аннотация
Здесь мы опишем подробную процедуру эффективно и непосредственно доставить гемофильной инфекции в нижних дыхательных путей у мышей. Показана процедура подготовки H. инокулята гриппа, внутри трахеи закапывания H. гриппа в легкие, коллекция бронхо-альвеолярного лаважа (БАЛ), анализ иммунных клеток в БАЛ и выделения РНК для дифференциального анализа экспрессии генов. Эта процедура может быть использована для изучения легких воспалительной реакции на любые бактерии, вирусы или грибы. Прямая трахеи инстилляции в основном предпочтительнее интраназального или аэрозольные ингаляции процедур, так как он более эффективно доставляет бактериального инокулята в нижних отделах дыхательных путей с меньшей неоднозначностью.
Введение
Воспаление является основной иммунный механизм защиты против инфекционных агентов. Это способствует ликвидации патогенных микроорганизмов и ремонт поврежденной ткани. Это также облегчает восстановление до нормального здорового состояния 1. Тем не менее, дизрегуляции воспаление часто приводит к хроническим воспалительным заболеваниям 2. Воспаление дыхательных путей является начальным толчком для различных легочных заболеваний , таких как хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ), астма и легочный фиброз 3.
Нетипируемых (некапсулированного) гемофильной (NTHi) связан с хроническими верхней и ни....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Протокол
Все эксперименты проводились в соответствии с руководящими принципами животных по уходу и использованию комитета (Institutional IACUC) научно-исследовательского института Бейлора.
1. Культивирование нетипируемых гемофильной (NTHi) и подготовка посевного материала
- Пластина NTHI на агаровой пластине шоколада и держать тарелку вверх дном в увлажненной CO 2 инкубаторе в течение ночи при температуре 37 ° С и 5% CO 2. На следующий день, культура бактерий в сердечно-мозговым бульоне. Затем добавляют 1 мл бульона в стерильный 1,5 мл трубки.
- Центрифуга при 4000 х г в течение 5 мин при комнатной т....
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Результаты
Intra-трахеи закапывания привело к значительно увеличению числа лейкоцитов в БАЛ (рис 1А, левая панель) , чем установка с физиологическим раствором. Дифференциальный подсчет анализ лейкоцитов ясно показали повышенную нейтрофильной инфильтрации (рис 1, правая панель). Анализ FACS - клеток в БАЛ дополнительно подтверждено увеличение числа нейтрофилов (Фигура 1В). Гистологический анализ Н & Е-окрашенных участках легочной ткани показали .......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Обсуждение
Здесь мы описываем уникальную и минимально инвазивные процедуры для инокуляции легких мышей с бактериальным патогеном легких. Показано, что эта процедура может быть использована для изучения функции различных генов с использованием мышей, которые дефицитны по генам воспалительных сигнальных путей. Эта процедура также может быть использован для изучения воспалительные реакции на вирусные и грибковые инфекции легких. Преимущества этой процедуры по сравнению с другими методами, такими как интраназального или аэрозольной ин.......
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Раскрытие информации
Авторам нечего раскрывать.
Благодарности
Мы благодарим доктора Карсона Харрода за критическое прочтение рукописи. Мы также благодарим г-на Минхуэй Цзэна и докторов Махеша Катанию и Прашанта Кхаре за их вклад. Эта работа была поддержана грантами Американского онкологического общества (грант исследователя, 122713-RSG-12-260-01-LIB) и Онкологического центра Саммонса (грант пилотного проекта) К. Венупрасаду.
....Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Материалы
| Имя | Компания | Каталожный номер | Комментарии |
|---|---|---|---|
| Шоколадная агаровая тарелка | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Декстроза безводная | Themo Scientific | R01300 | |
| Гепарин | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Ловкое быстрое решение | Sigma | GS500-500ML | |
| Игла для шприца 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Шприц Iml | BD | REF 309602 | |
| катетер 20GA | BD | REF | |
| Ножницы для препарирования, прямые, длина 10 см | kentscientific | INS600393 | |
| Щипцы для радужной оболочки, зубчатые, длина 10 см | kentscientific | INS650915 | |
| Пинцет #5 Нержавеющая сталь, длина 11 см | kentscientific | ||
| 10% формалин | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5мл полистирольные тубы с круглым дном | BD | REF 352058 | |
| 1,5 мл Микроцентрифужные пробирки | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Мотор для гранул (Гомогинизатор тканей) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 луночных микротитровальных пластин V дно | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Рабочее разведение 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Рабочее разведение 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Живой/Мертвый корректируемый набор для окрашивания морскими мертвыми клетками | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/ CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs трубки полистирольная круглая нижняя трубка | BD | 352052 | |
| формальдегидом | Polyscience | 4018 |
Ссылки
- Medzhitov, R. Origin and physiological roles of inflammation. Nature. 454, 428-435 (2008).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, inflammation, and cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Barnes, P. J.
Доступ ограничен. Войдите в систему или начните пробный период, чтобы просмотреть этот контент.
Перепечатки и разрешения
