Abstract
A continuación, describimos un procedimiento detallado de manera eficiente y entregar directamente Haemophilus influenzae en las vías respiratorias inferiores de los ratones. Demostramos el procedimiento para la preparación de H. inóculo influenzae, la instilación intratraqueal de H. influenzae en el pulmón, la recogida de fluido de lavado bronco-alveolar (BALF), el análisis de las células inmunes en el BALF, y el aislamiento de ARN para análisis de expresión génica diferencial. Este procedimiento puede ser usado para estudiar la respuesta inflamatoria pulmonar a cualquier bacteria, virus u hongos. instilación traqueal directa se prefiere sobre todo sobre los procedimientos intranasal o inhalación de aerosol, ya que ofrece más eficiente el inóculo bacteriano en el tracto respiratorio inferior con menos ambigüedad.
Introduction
La inflamación es un mecanismo inmunológico fundamental en la defensa contra agentes infecciosos. Promueve la erradicación de patógenos y la reparación del tejido dañado. También facilita la recuperación a un estado normal y saludable 1. Sin embargo, la inflamación dysregulated a menudo conduce a enfermedades inflamatorias crónicas 2. Inflamación de las vías respiratorias es un disparador inicial para diferentes enfermedades pulmonares tales como enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC), asma y fibrosis pulmonar 3.
El Haemophilus influenzae no tipificable (no encapsulada) (NTHi) se asocia con enfermedades inflamatorias superior e inferior pulmonares crónicas 4,5. Es la especie dominante aisladas de las vías respiratorias inferiores de los niños y adultos con 4,6,7 enfermedad pulmonar obstructiva crónica. La respuesta inflamatoria después de la infección NTHi se caracteriza por la regulación positiva de citoquinas proinflamatorias (tales como TNF e IL-1β), y está mediada bY por mitógenos proteína quinasa activada (MAPK) y el factor nuclear-kB (NF-kB) a través de los receptores tipo toll (TLR) 8.
Los modelos de ratón son herramientas muy útiles para el análisis de la patología subyacente de la enfermedad inflamatoria pulmonar debido a la disponibilidad de las diferentes líneas de genes deficientes. Varios métodos han sido utilizados para inocular bacterias vivas / atenuadas y productos bacterianos, incluyendo la instilación intranasal y 9,10 inhalación en forma de aerosol. Aquí, demostramos la instilación intratraqueal. Aunque se utiliza con menos frecuencia, este enfoque es más eficiente y altamente reproducible debido a la entrega directa de inóculo en el tracto respiratorio inferior.
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Protocol
Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Baylor Research Institute.
1. El cultivo no tipificable de Haemophilus influenzae (NTHi) y preparar el inóculo
- Placa NTHi en una placa de agar chocolate y mantener la placa boca abajo en un incubador de CO2 humidificado durante la noche a 37 ° C y 5% de CO2. El siguiente día, cultivar las bacterias en caldo de infusión de corazón cerebro. A continuación, añadir 1 ml del caldo en un tubo estéril de 1,5 ml.
- Centrifugar a 4000 xg durante 5 min a temperatura ambiente. A continuación, descartar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 1 ml de PBS estéril 1x. Repita este paso una vez.
- Transferir 100 l de solución de re-suspendido en 900 l de 1x PBS y se mide la absorbancia del cultivo diluido en la longitud de onda de 600 nm en un espectrofotómetro.
- Determinar la viabilidad y unidad de formación de coloniass (UFC) del inóculo cultivando diluciones 1:10 en serie en placas de agar de chocolate y se incubó durante la noche a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Sobre la base de la viabilidad y las UFC determinada a partir del paso anterior, ajustar el inóculo a una concentración final de 20 x 10 6 CFU / ml.
2. intra-traqueal (IT) La instilación
- Inyectar el ratón por vía intraperitoneal (ip) con 0,1 ml / 10 g de peso corporal de ratón con un + solución de 150 mg / ml de ketamina 20 mg / ml de xilazina. El procedimiento debe realizarse en la campana con una fuente de luz para mantener caliente el animal.
- Pellizcar el espacio interdigital del ratón para verificar que el ratón se anestesia adecuada.
- Coloca el ratón sobre su espalda. Afeitar el área ventral del cuello y desinfectar con clorhexidina y alcohol etílico al 70%.
- Levantar la piel de la parte ventral superior del cuello con unas pinzas de dientes de rata. Hacer una pequeña incisión (0,5-1,0 cm) por encima del timo utilizando un bisturíy diseccionar cuidadosamente el músculo para exponer la tráquea.
- Usando una jeringa de 1 ml con una aguja de 27 G, inyectar lentamente 0,05 ml de aire, seguido por 0,05 ml NTHi obtenidos a partir de la Sección 1 o solución salina como control, seguido de otro 0,05 ml de aire. Mantener animales vertical para alrededor de 1 min.
- Cerrar la incisión con pegamento quirúrgico. Mantenga el ratón lateralmente reclinada y caliente durante unos 10 minutos.
3. Colección BALF
- Sacrificar el ratón por dislocación cervical 24 horas después de la infección.
- Abra la cavidad abdominal del ratón con tijeras anatómicas y cortar la aorta ventral a sangrar. Exponer la parte ventral del pulmón.
- Exponer la tráquea y intubar con un catéter de calibre 20. Inculcar 0,8 ml de tampón de BALF (1x PBS, 0,1% de dextrosa, 10 U / ml de heparina) y recoger el lavado por aspiración suave. Repita este procedimiento tres veces.
- Contar el número total de células en 100 l de suspensión de BALF usando un hemocytometros bajo un aumento de 10X con tinción de azul de tripano.
- Preparar en otro portaobjetos para la tinción de Giemsa modificado. Alícuota de 100 l de BALF en los pocillos apropiados de la citospina y centrifugar a 500 g durante 5 min. Secar los portaobjetos durante 10 min y teñir las células con tinción de Giemsa modificado de acuerdo con los protocolos del fabricante.
- Utilizar las células restantes para su posterior análisis, tales como células activadas por la clasificación de fluorescencia (FACS), microscopía confocal, la expresión génica y western blot 11-13.
4. Preparación Histopatología
- Para el análisis histopatológico, infectar a los ratones con NTHi como se describe en el paso 2.4. Después de 24 horas de la infección, sacrificar los animales por dislocación cervical. Cortar abrir la cavidad torácica con tijeras anatómicas para exponer los pulmones y la tráquea como se ha mencionado antes. A continuación, insertar el catéter de calibre 20 en la tráquea.
- Llenar los pulmones con solución de agarosa al 2% caliente preparado en formalina al 4%. Una vez elpulmones están completamente inflados, lugar de hielo en la parte superior de los pulmones para solidificar la solución de agarosa.
- A continuación, retire con cuidado el tapón torácica y lo puso en una solución de 50 ml de formalina al 4% en PBS 1x hasta que se procesa para (H & E) secciones de hematoxilina y eosina.
5. FACS tinción de las células en el BALF
- Poner 1 x 10 5 células del líquido BALF en una placa de titulación de micro de fondo en V de 96 pocillos.
- Lavar las células con 300 l de PBS frío 1x y centrifugado a 4.000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Teñir las células con solución de tinción de células en 100 l de PBS 1x (1: 1000 dilución) y mantener a temperatura ambiente durante 15 min.
- Lavar las células con 300 l de 1x PBS frío a 4000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Mantener células en 100 l de tampón de FACS de lavado [tampón de lavado (1x PBS, 2% de FBS, 1 mM EDTA, 0,1% de azida sódica] que contiene 1: 100 diluido Fc-Block durante 15 min a 4 ° C.
- centrifugar las células a 4.000 xg durante 3 min y deseche supernatant.
- Las células se tiñen con 100 l de cóctel tinción de la superficie (dilución 1: 100) en tampón de lavado FACS durante 30 min a 4 ° C.
- Lavar las células tres veces con 300 l de tampón de lavado FACS a 4.000 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Fijar las células en 100 l de 4% de paraformaldehído durante 15 min a temperatura ambiente.
- Lavar las células dos veces con 300 l de 1x PBS a 400 xg durante 3 min a 4 ° C y volver a suspender en 300 l de tampón de lavado FACS.
- Hacer controles de tinción de un solo color utilizando citometría de flujo perlas.
- Añadir una gota de perlas en la placa de microlitro de fondo en V de 96 pocillos y se lava con 200 l de 1x PBS.
- Añadir 1 l de anticuerpo de tinción de 100 l de 1x PBS y los granos y se incuba a temperatura ambiente durante 5 min.
- Lávese las perlas dos veces con 300 l de PBS 1x.
- Analizar los controles manchados de células individuales y por citometría de flujo 14.
6. La homogeneización del tejido pulmonar para aislar ARN
- Después de la infección, se recoge una pequeña pieza de pulmón (20-40 mg) y mantenerlo en la estabilización de ARN reactivo a 4 ° C durante la noche. A continuación, almacenarlo a -80 ° C hasta que el siguiente paso.
- Lavar los tejidos del pulmón en frío PBS 1x para deshacerse del reactivo de estabilización de ARN.
- Coloque el tejido en un tampón que contiene 1,5 ml de lisis tubo de centrífuga (1 ml de tampón de lisis + 10 l β-mercaptoetanol).
- Picar el tejido en trozos pequeños con unas tijeras de punta y homogeneizar usando una mano de mortero de pellets de motor sin cuerda de 20-40 seg.
- Mantenga el lisado en hielo durante 5 min y proceder con el paso 7.1.
7. Aislamiento de ARN del pulmón
- Se centrifuga el lisado a 18.000 xg durante 3 min. Eliminar el sobrenadante con la pipeta y transferir cuidadosamente a un nuevo tubo de 1,5 ml.
- Añadir 1 volumen de etanol al 70% al lisado. Mezclar inmediatamente por pipeteo y esperar 2-4 minutos.
- Transferir hasta 700 l de lisado a una columna giratoria colocadaen un tubo de recogida de 2 ml.
- Se centrifuga a 9.600 g durante 15 seg y desechar el flujo a través.
- Añadir 350 l tampón de lavado riguroso y se centrifuga a 9.600 g durante 15 seg. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 80 l de DNasa I directamente a la membrana de la columna de centrifugación y mantenerlo a temperatura ambiente durante 15 min.
- Añadir 350 l de tampón de lavado astringente a la columna de centrifugación y centrifugar a 9600 xg durante 15 seg. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 500 l de tampón de lavado ARN y se centrifuga a 9.600 g durante 15 seg. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 500 l de tampón de ARN de lavado y centrifugado a 9.600 xg durante 2 min. Desechar el flujo continuo.
- Colocar la columna de centrifugación en un nuevo tubo de recogida de 2 ml y se centrifuga a 9.600 g durante 1 min. Desechar el flujo continuo.
- Añadir 30-50 l de agua libre de RNasa directamente a la columna de centrifugación y se centrifuga a 9.600 g durante 1 min. ARN almacenar a -80 ° C.
- Realizar análisis RNAseq 14.
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Representative Results
Instilación intratraqueal resultó en un marcado aumento del número de leucocitos en el BALF (Figura 1A, panel izquierdo) de la instalación con solución salina. El análisis recuento diferencial de los leucocitos mostró claramente el aumento de la infiltración de neutrófilos (Figura 1, panel derecho). El análisis FACS de las células en el BALF confirmó además el aumento del número de neutrófilos (Figura 1B). El análisis histológico de las secciones teñidas con H y E del tejido pulmonar mostraron aumento de la inflamación de las vías respiratorias (Figura 1C). Estos datos sugieren colectivamente que la instilación intratraqueal induce la inflamación de las vías respiratorias en los ratones. Para apoyar el uso de este enfoque para el estudio de las vías de señalización que regulan la patogénesis de las vías respiratorias, se utilizó ratones que son deficientes para el E3 ubiquitina ligasa Itch. Picor se sabe están involucrados en la regulación de las vías de señalización inflamatoria 15. inoculamosla edad y el sexo de tipo salvaje con ajuste C57BL / 6 control y Itch - / - ratones con NTHi. Se aislaron ARN de los tejidos pulmonares de WT control y Itch - / - ratones y se realizó la secuenciación del transcriptoma conjunto para identificar los genes inflamatorios que son expresados diferencialmente. Como se muestra en la Figura 2, la deficiencia de Itch resultó en la expresión diferencial de varios genes. Esto sugiere que la instilación intratraqueal se puede utilizar para investigar la inflamación pulmonar, los perfiles de expresión de genes y vías de señalización.
Figura 1: la inoculación intratraqueal de NTHi induce la inflamación pulmonar en ratones Los ratones fueron inoculados con NTHi (10 6 CFU / ratón) o un control de solución salina.. 24 horas después de la inoculación, se sacrificaron los ratones se recogió (A) BALF. Se determinó el número total de leucocitos, monocitos y neutrófilos. Los datos se presentancomo medias ± SEM. n = 4 ratones / grupo. * Indica p <0,05 en comparación con ratones tratados con solución salina. (B) Las células en el BALF se tiñeron con anticuerpo anti-Gr1 y se analizaron por FACS. (C) H & E-manchado secciones de pulmón que muestran la infiltración de leucocitos y la inflamación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: La expresión génica diferencial en los pulmones de WT y el picor - / - ratones siguientes intra-traqueal NTHi inoculación 24 horas después de NTHi de la inoculación, el ARN se aisló de los pulmones de dos WT (1, 2) y dos Itch - / -. (1, 2) ratones. (A) la calidad del ARN se analizó utilizando un Bioanalyzer. (B) Mapa de calor que muestra las puntuaciones Z (interpretado como una medida de la distancia de SDla media) para el recuento diario de 2 por millón (log 2 CPM) de 172 genes expresados diferencialmente identificados usando bordeadora en el Itch - / -. en comparación con los ratones WT favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
En este documento, se describe un procedimiento único y mínimamente invasivo para inocular los pulmones de ratones con un patógeno pulmonar bacteriana. Se demuestra que este procedimiento puede ser usado para estudiar la función de genes diferentes que utilizan ratones que son deficientes en genes de vías de señalización inflamatorias. Este procedimiento también se puede utilizar para estudiar las respuestas inflamatorias a infecciones pulmonares víricas y fúngicas. Las ventajas de este procedimiento con respecto a otros métodos tales como la intranasal o la inhalación de aerosol se (1) en este procedimiento, el inóculo patógeno se instila directamente en el tracto respiratorio inferior; (2) la capacidad de controlar el tamaño del inóculo; y (3) reducción del riesgo de la exposición bacteriana al controlador.
La exposición de la tráquea quirúrgicamente para infundir bacterias es un paso crucial en el que se debe tener cuidado para evitar causar daño a los tejidos circundantes, especialmente los vasos sanguíneos.
La instilación de bacterias en el sh tráqueaOuld hacerse con cuidado para evitar la posibilidad de la muerte de los ratones por asfixia. Se sugiere que el inóculo (aproximadamente 50 l) se libera lentamente y se inyecta aire antes y después del inóculo. Manteniendo el ratón vertical después de la instilación por un tiempo y mantenerlos lateralmente reclinada facilita una recuperación más rápida. La principal desventaja de este procedimiento es que las exposiciones múltiples dentro de un corto período de tiempo no son posibles debido a la necesidad de la cirugía. Un problema potencial es que si el catéter se coloca demasiado profundo en el bronquio, el recuento de células BALF será menor. Este problema puede ser resuelto tirando del tubo ligeramente hacia arriba.
Dado que la incidencia de las enfermedades de las vías respiratorias inflamatorias están aumentando en todo el mundo 3,16, la comprensión de la fisiopatología de estas enfermedades es de primordial importancia. Las tecnologías descritas en este estudio podrían ayudar a identificar las vías de regulación clave y podrían facilitar el desarrollode nuevas modalidades de tratamiento.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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