Abstract
Ici, nous décrivons une procédure détaillée pour efficacement et livrons directement Haemophilus influenzae dans les voies respiratoires inférieures des souris. Nous démontrons la procédure de préparation H. influenzae inoculum, instillation intra-trachéale de H. influenzae dans le poumon, la collecte du liquide de lavage broncho-alvéolaire (BALF), l' analyse des cellules immunitaires dans le BALF et l' isolement de l' ARN pour l' analyse différentielle de l' expression génique. Cette procédure peut être utilisée pour étudier la réponse inflammatoire pulmonaire à une bactérie, un virus ou des champignons. endotrachéale directe instillation est le plus souvent préféré aux procédures d'inhalation par voie nasale ou d'un aérosol, car il fournit plus efficacement l'inoculum bactérien dans les voies respiratoires inférieures avec moins d'ambiguïté.
Introduction
L'inflammation est un mécanisme immunitaire fondamental de la défense contre les agents infectieux. Il favorise l'élimination des agents pathogènes et la réparation des tissus endommagés. Il facilite également la récupération à un état de santé normal 1. Cependant, l' inflammation dérégulée conduit souvent à des maladies inflammatoires chroniques 2. Inflammation des voies respiratoires est un facteur déclenchant diverses maladies pulmonaires telles que la maladie pulmonaire obstructive chronique (COPD), l' asthme et la fibrose pulmonaire 3.
La non typable (non encapsulé) , Haemophilus influenzae (NTHi) est associée à des maladies inflammatoires pulmonaires supérieures et inférieures à 4,5 chroniques. Ce sont les espèces dominantes isolées des voies respiratoires inférieures des enfants et des adultes avec 4,6,7 chronique de la maladie pulmonaire obstructive. La réponse inflammatoire après l'infection NTHi est caractérisée par la régulation positive des cytokines pro-inflammatoires (telles que le TNF et l'IL-1β), et il est médié by mitogène protéine kinase activée (MAPK) et le facteur nucléaire-kB (NF-kB) grâce à des récepteurs Toll-like (TLR) 8.
Des modèles de souris sont des outils très utiles pour l'analyse de la pathologie sous-jacente de la maladie inflammatoire pulmonaire en raison de la disponibilité des différentes lignes de gènes déficients. Plusieurs méthodes ont été utilisées pour inoculer des bactéries vivantes atténuées et / produits bactériens, y compris l' instillation intranasale et par inhalation sous forme d' aérosol 9,10. Ici, nous démontrons intra-trachéale instillation. Bien qu'ils soient utilisés moins fréquemment, cette approche est plus efficace et hautement reproductible en raison de la livraison directe de l'inoculum pour les voies respiratoires inférieures.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées en conformité avec les directives du Comité institutionnel des animaux soin et l'utilisation (IACUC) de l'Institut de recherche Baylor.
1. La culture non-typable Haemophilus influenzae (NTHi) et préparation de l'inoculum
- Plaque de NTHi sur une plaque de gélose chocolat et maintenir la plaque à l' envers dans un incubateur à CO2 humidifiée pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2. Le jour, après culture des bactéries dans un bouillon d'infusion cerveau-coeur. Ensuite, ajoutez 1 ml de bouillon dans un tube de 1,5 ml stérile.
- Centrifuger à 4000 xg pendant 5 min à température ambiante. Ensuite, jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 1 ml de PBS stérile 1x. Répétez cette étape une fois.
- Transférer 100 pl de solution de remise en suspension dans 900 ul de PBS 1x et mesurer l'absorbance de la culture diluée à 600 nm de longueur d'onde dans un spectrophotomètre.
- Déterminer l'unité viabilité et formant des coloniess (CFU) de l'inoculum par culture 1:10 dilutions en série sur des plaques de gélose chocolat et incubation pendant une nuit à 37 ° C et 5% de CO 2.
- Sur la base de la viabilité et le nombre de CFU déterminé à partir de l'étape précédente, ajuster l'inoculum à une concentration finale de 20 x 10 6 UFC / ml.
2. intra-trachéale (it) instillation
- Injecter la souris par voie intrapéritonéale (ip) avec 0,1 ml / 10 g de poids corporel de souris avec une / ml de kétamine + 20 mg / ml d'une solution de 150 mg de xylazine. La procédure doit être fait dans le capot avec une source de lumière pour garder la chaleur animale.
- Pincer l'espace interdigital de la souris pour vérifier que la souris est correctement anesthésiés.
- Placez la souris sur son dos. Rasez la zone ventrale du cou et désinfecter avec de la chlorhexidine et de l'alcool éthylique à 70%.
- Soulever la peau de la partie supérieure ventrale du cou à l'aide de rat pince à dents. Une petite incision (0,5 à 1,0 cm) au-dessus du thymus à l'aide d'un scalpelet de disséquer soigneusement le muscle pour exposer la trachée.
- En utilisant une seringue de 1 ml avec une aiguille de 27 G, injecter lentement 0,05 ml d'air, suivi de 0,05 ml NTHi obtenus à partir de la section 1 ou une solution saline comme témoin, suivie d'une autre de 0,05 ml d'air. Gardez l'animal vertical pour environ 1 min.
- Fermer l'incision avec de la colle chirurgicale. Gardez la souris latéralement en position couchée et chaud pendant environ 10 min.
3. LLBA Collection
- Sacrifiez la souris par dislocation cervicale 24 heures après l'infection.
- Ouvrez la cavité abdominale de la souris avec des ciseaux anatomiques et couper l'aorte ventrale à saigner. Exposer la partie ventrale du poumon.
- Exposer la trachée et l'intubation avec un cathéter de calibre 20. Instiller 0,8 ml de tampon LLBA (1x PBS, 0,1% de dextrose, 10 U / ml d'héparine) et recueillir le lavage par aspiration douce. Répétez cette procédure trois fois.
- Compter le nombre total de cellules dans 100 ul de suspension à l'aide d'un LLBA hemocytomètre sous un grossissement 10X avec coloration au bleu Trypan.
- Préparer des lames pour la coloration Giemsa modifiée. Aliquote de 100 pi de LLBA dans les puits appropriés de la Cytospin et centrifuger à 500 g pendant 5 min. Sécher les lames pendant 10 min et tacher les cellules en utilisant Giemsa modifié selon les protocoles du fabricant.
- Utiliser les cellules restantes pour une analyse ultérieure, tels que le tri cellulaire activé florescence (FACS), la microscopie confocale, l' expression génique et Western Blot 13/11.
4. histopathologie Préparation
- Pour l'analyse histopathologique, infecter des souris avec NTHi comme décrit dans l'étape 2.4. Après 24 heures d'infection, sacrifier les animaux par dislocation cervicale. Couper ouvrir la cavité thoracique anatomiques avec des ciseaux pour exposer les poumons et la trachée, comme mentionné précédemment. Ensuite, insérer le cathéter de calibre 20 dans la trachée.
- Remplissez le poumon avec une solution d'agarose chaud 2% préparé dans 4% de formaline. Une fois lapoumons sont complètement gonflés, le lieu de la glace au-dessus des poumons pour solidifier la solution d'agarose.
- Puis, enlevez délicatement le bouchon thoracique et le mettre dans une solution à 50 ml de formol à 4% dans PBS 1x jusqu'à ce qu'il soit traité pour (H & E) sections hématoxyline et éosine.
5. FACS coloration des cellules dans le LLBA
- Mettre à 1 x 10 5 cellules à partir du fluide de LLBA dans une microplaque de titrage à 96 puits à fond en V.
- Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS et centrifuger à 4000 g pendant 3 min à 4 ° C.
- Colorer les cellules avec une solution de coloration de cellules dans 100 ul de PBS 1x (1: 1000 dilution) et conserver à la température ambiante pendant 15 min.
- Laver les cellules avec 300 pi de froid 1x PBS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
- Gardez les cellules dans 100 pi de tampon de lavage FACS [tampon de lavage (PBS 1x, 2% de FBS, 1 mM EDTA, azoture de sodium à 0,1%] contenant 1: 100 dilué Fc-Block pendant 15 min à 4 ° C.
- Centrifuger les cellules à 4000 g pendant 3 min et jeter supernatant.
- cellules Stain avec 100 pi coloration de surface cocktail (dilution 1: 100) dans un tampon de lavage FACS pendant 30 min à 4 ° C.
- Laver les cellules trois fois avec 300 pi de tampon de lavage FACS à 4000 xg pendant 3 min à 4 ° C.
- Fixer les cellules dans 100 pi de paraformaldehyde à 4% pendant 15 min à température ambiante.
- Laver les cellules deux fois avec 300 ul de 1 x PBS à 400 g pendant 3 min à 4 ° C et remettre en suspension dans 300 pi de tampon de lavage FACS.
- Faire des contrôles de coloration unique couleur à l'aide de cytométrie de flux perles.
- Ajouter une goutte de perles dans la plaque de microlitre 96 puits à fond en V et laver avec 200 ul PBS 1x.
- Ajouter 1 pi d'anticorps de coloration à 100 ul de 1 x PBS et les billes et on incube à température ambiante pendant 5 min.
- Lavez perles deux fois avec 300 pi de PBS 1x.
- Analyser les contrôles et les cellules individuelles tachée par cytométrie en flux 14.
6. Homogénéisation du tissu pulmonaire pour isoler l'ARN
- Après l'infection, prélever un petit morceau de poumon (20-40 mg) et le maintenir dans l'ARN stabilisant réactif à 4 ° C pendant la nuit. Ensuite, le stocker à -80 ° C jusqu'à ce que la prochaine étape.
- Laver les tissus pulmonaires dans le froid 1x PBS pour se débarrasser du réactif de stabilisation de l'ARN.
- Placer le tissu dans un tube de 1,5 ml centrifugeuse contenant un tampon de lyse (1 ml de tampon de lyse + 10 ul de β-mercaptoéthanol).
- Hacher le tissu en petits morceaux avec des ciseaux pointus et homogénéiser à l'aide d'un fil moteur pellet pilon pendant 20-40 sec.
- Gardez le lysat sur la glace pendant 5 min et passez à l'étape 7.1.
7. Isolement de l'ARN du poumon
- Centrifuger le lysat à 18000 xg pendant 3 min. Retirer le surnageant par pipetage et transférer soigneusement dans un nouveau tube de 1,5 ml.
- Ajouter 1 volume d'éthanol à 70% au lysat. Mélanger immédiatement par pipetage et attendre 2-4 min.
- Transférer jusqu'à 700 pi de lysat dans une colonne de centrifugation placédans un tube collecteur de 2 ml.
- Centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec et jeter le flux continu.
- Ajouter 350 pi de tampon de lavage stringent et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
- Ajouter 80 ul DNase I directement à la membrane de la colonne de spin et de le maintenir à la température ambiante pendant 15 min.
- Ajouter un tampon de lavage stringent 350 pi à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
- Ajouter 500 pi de tampon de lavage d'ARN et centrifuger à 9600 xg pendant 15 sec. Jeter l'écoulement.
- Ajouter 500 pi de tampon de lavage d'ARN et essorage à 9600 xg pendant 2 min. Jeter l'écoulement.
- Placez la colonne de spin dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. Jeter l'écoulement.
- Ajouter 30-50 eau libre de RNase-ul directement à la colonne et centrifuger à 9600 xg pendant 1 min. ARN de magasin à -80 ° C.
- Effectuer une analyse 14 RNA-seq.
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Representative Results
Instillation intra-trachéale a donné lieu à un nombre nettement accru de leucocytes dans le LLBA (figure 1A, panneau de gauche) que l' installation avec une solution saline. L'analyse de comptage différentiel des leucocytes a clairement montré une infiltration accrue de neutrophiles (Figure 1, panneau de droite). L'analyse FACS des cellules dans le BALF a en outre confirmé l'augmentation du nombre de neutrophiles (figure 1B). L' analyse histologique de coupes H & E tachée du tissu pulmonaire a montré une augmentation inflammation des voies respiratoires (figure 1C). Ces données suggèrent collectivement que l'instillation intratracheale induit une inflammation des voies aériennes chez la souris. Pour soutenir l'utilisation de cette approche pour étudier les voies de signalisation qui régulent les voies respiratoires pathogenèse, nous avons utilisé des souris qui sont déficientes pour l'E3 ubiquitine ligase Itch. Itch est connue pour être impliquée dans la régulation de la signalisation inflammatoire des voies 15. Nous inoculél'âge et le sexe de type sauvage appariés C57BL / 6 contrôle et Itch - / - souris avec NTHi. Nous avons isolé l'ARN à partir des tissus pulmonaires de WT de commande et Itch - / - souris et effectué le séquençage du transcriptome entier pour identifier les gènes inflammatoires qui sont exprimés différemment. Comme on le voit sur la figure 2, la carence Itch a donné lieu à l' expression différentielle de plusieurs gènes. Ceci suggère que l'instillation intratracheale peut être utilisé pour étudier l'inflammation pulmonaire, les profils d'expression des gènes et des voies de signalisation.
Figure 1: l' inoculation intra-trachéale de NTHi induit une inflammation des poumons chez la souris Des souris ont été inoculées avec NTHi (10 6 UFC / souris) ou une solution saline de contrôle.. 24 h après l'inoculation, on a sacrifié les souris (A) BALF a été recueillie. Le nombre total de leucocytes, monocytes et neutrophiles ont été déterminées. Les données sont présentéescomme moyen ± SEM. n = 4 souris / groupe. * Indique p <0,05 par rapport à des souris salines traitées. (B) Les cellules dans le BALF ont été colorées avec un anticorps anti-Gr1 et analysées par FACS. (C) H & E tachés sections pulmonaires montrant l' infiltration leucocytaire et de l' inflammation. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2: L' expression différentielle de gènes dans les poumons du WT et Itch - / - souris après NTHi intratracheale inoculation 24 heures après NTHi l' inoculation, l' ARN a été isolé à partir des poumons de deux WT (1, 2) et deux Itch - / -. (1, 2) chez la souris. (A) la qualité de l' ARN a été analysé à l' aide d' un Bioanalyseur. (B) Carte de chaleur montrant Z-scores (interprété comme une mesure de l' écart de sdla moyenne) pour le comptage log 2 par million (log 2 CPM) de 172 gènes exprimés de manière différentielle identifiés en utilisant déligneuse dans le Itch - / -. par rapport aux souris WT S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Ici, nous décrivons un procédé unique et peu invasive pour inoculer les poumons de souris par un pathogène bactérien du poumon. Nous démontrons que cette procédure peut être utilisée pour étudier la fonction des différents gènes en utilisant des souris qui sont déficientes en gènes des voies de signalisation inflammatoires. Cette procédure peut également être utilisée pour étudier les réponses inflammatoires à des infections virales et fongiques pulmonaires. Les avantages de cette procédure par rapport aux autres méthodes telles que intranasale ou par aérosol pour inhalation sont (1) dans cette procédure, l'inoculum pathogène est directement insufflé dans les voies respiratoires inférieures; (2) la capacité de contrôler la taille de l'inoculum; et (3) réduit le risque d'exposition bactérienne au gestionnaire.
L'exposition de la trachée chirurgicalement pour inculquer des bactéries est une étape cruciale où les soins doivent être prises pour éviter de causer des dommages aux tissus environnants, en particulier les vaisseaux sanguins.
Instillation des bactéries dans la trachée should être fait avec soin pour éviter la possibilité de la mort des souris en raison de l'asphyxie. Il est suggéré que l'inoculum (environ 50 ul) est libérée lentement et l'air injecté avant et après l'inoculation. Garder la souris verticale suivant l'instillation pendant un certain temps et les maintenir en position couchée latéralement facilite une récupération plus rapide. L'inconvénient majeur de cette procédure est que les expositions multiples dans un court laps de temps ne sont pas possibles en raison de l'exigence de la chirurgie. Un problème potentiel est que si le cathéter est placé trop profondément dans les bronches, le nombre de cellules LLBA sera inférieur. Ce problème peut être résolu en tirant légèrement vers le haut du tube.
Comme l'incidence des maladies des voies respiratoires inflammatoires augmentent dans le monde entier 3,16, la compréhension de la physiopathologie de ces maladies est d' une importance primordiale. Les technologies décrites dans cette étude pourraient aider à identifier les voies réglementaires clés et pourraient faciliter le développementde nouvelles modalités de traitement.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
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