Abstract
Her beskriver vi en detaljeret procedure til effektivt og direkte levere Haemophilus influenzae ind i de nederste luftveje hos mus. Vi viser proceduren for udarbejdelse H. influenzae inokulum, intratrakeal instillation af H. influenzae ind i lungen, indsamling af bronko-alveolær udskylningsvæske (BALF), analyse af immunceller i BALF, og RNA-isolering for differentiel genekspression analyse. Denne procedure kan anvendes til at studere lungen inflammatoriske respons på nogen bakterier, virus eller svampe. Direkte tracheal instillation er for det meste foretrækkes frem intranasal eller aerosol indånding procedurer, fordi den mere effektivt leverer den bakterielle inokulum i de nedre luftveje med mindre tvetydighed.
Introduction
Inflammation er en grundlæggende immun mekanisme forsvar mod smitsomme stoffer. Det fremmer udryddelse og reparation af beskadiget væv patogen. Det letter også inddrivelse til en normal sund tilstand 1. Imidlertid dysreguleret inflammation ofte fører til kroniske inflammatoriske sygdomme 2. Luftvejsinflammation er en indledende udløsende faktor for forskellige lungesygdomme, såsom kronisk obstruktiv lungesygdom (COPD), astma og pulmonal fibrose 3.
Den ikke-typebestemmelige (ikke-indkapslet) Haemophilus influenzae (NTHi) er forbundet med kroniske øvre og nedre lunge inflammatoriske sygdomme 4,5. Det er den dominerende art isoleret fra de nedre luftveje hos børn og voksne med kronisk obstruktiv lungesygdom 4,6,7. Den inflammatoriske respons efter NTHi-infektion er kendetegnet ved opregulering af proinflammatoriske cytokiner (såsom TNF og IL-1β), og den er medieret By mitogenaktiveret proteinkinase (MAPK) og nuklear faktor-KB (NF-KB) gennem toll-lignende receptorer (TLRs) 8.
Musemodeller er meget nyttige redskaber til at analysere den underliggende patologi lunge inflammatorisk sygdom på grund af tilgængeligheden af de forskellige gen-mangelfuld linjer. Adskillige fremgangsmåder er blevet anvendt til at pode levende / svækkede bakterier og bakterielle produkter, herunder intranasal instillation og aerosoliseret inhalation 9,10. Her demonstrerer vi intratrakeal instillation. Selv om de anvendes mindre hyppigt, denne fremgangsmåde er mere effektiv og meget reproducerbar grund af den direkte levering af inoculum til de nedre luftveje.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle forsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af Baylor Research Institute.
1. Dyrkning Ikke-typebestemt Haemophilus influenzae (NTHi) og Forberedelse af Inoculum
- Plade NTHi på en chokolade-agarplade og holde pladen på hovedet i en befugtet CO2-inkubator natten over ved 37 ° C og 5% CO2. Den følgende dag kultur bakterierne i hjerne-hjerte-infusionsvæske. Derefter tilsættes 1 ml af mediet i en steril 1,5 ml rør.
- Centrifuger ved 4.000 xg i 5 minutter ved stuetemperatur. Derefter kasseres supernatanten og re-suspendere pellet i 1 ml sterilt 1x PBS. Gentag dette trin én gang.
- Overfør 100 ul resuspenderet opløsning i 900 pi 1x PBS og måle absorbansen af den fortyndede kultur ved 600 nm bølgelængde i et spektrofotometer.
- Bestem levedygtighed og kolonidannende enheds (CFU'er) af inokulum ved dyrkning 1:10 serielle fortyndinger på chokolade-agarplader og inkubering natten over ved 37 ° C og 5% CO2.
- Baseret på levedygtigheden og CFU'er bestemmes ud fra det foregående trin, justere inokulum til en endelig koncentration på 20 x 10 6 CFU / ml.
2. intratrakeal (det) Instillation
- Injicere mus intraperitonealt (ip) med 0,1 ml / 10 g legemsvægt af musen med en 150 mg / ml ketamin + 20 mg / ml xylazin opløsning. Proceduren bør ske i hætten med en lyskilde til at holde dyret varmt.
- Klem interdigitale rum af musen til at kontrollere, at musen er tilstrækkeligt bedøvet.
- Placer musen på ryggen. Barbere den ventrale del af halsen og desinficere med chlorhexidin og 70% ethylalkohol.
- Løft huden af den øvre ventrale del af halsen ved anvendelse af rotte tand pincet. Lave et lille snit (0,5-1,0 cm) over thymus under anvendelse af en skalpelog omhyggeligt dissekere musklen for at blotlægge trachea.
- Anvendelse af en 1 ml sprøjte med en 27 G nål, injicer langsomt 0,05 ml luft, efterfulgt af 0,05 ml NTHi opnået fra punkt 1 eller saltvand som kontrol, efterfulgt af endnu 0,05 ml luft. Hold dyr lodret for omkring 1 min.
- Lukke snittet med kirurgisk lim. Hold musen sideværts liggende og varme i ca. 10 min.
3. BALF Collection
- Sacrifice musen ved cervikal dislokation 24 timer efter infektion.
- Åbne bughulen af musen med anatomiske saks og klippe den ventrale aorta til at bløde. Eksponere den ventrale del af lungen.
- Eksponere luftrøret og intubere den med en 20 gauge kateter. Indgyde 0,8 ml BALF buffer (1x PBS, 0,1% dextrose, 10 U / ml heparin) og indsamle udskylning ved forsigtig aspiration. Gentag denne procedure tre gange.
- Tæl det samlede antal celler i 100 pi BALF suspension under anvendelse af en hemocytometer under 10X forstørrelse med Trypan Blue-farvning.
- Forbered dias for modificeret Giemsa farvning. Alikvote 100 ul BALF i de relevante brønde i cytospin og centrifuger ved 500 xg i 5 min. Tør dias i 10 minutter og plette de celler under anvendelse af modificeret Giemsa farve ifølge fabrikantens protokoller.
- Brug de resterende celler til efterfølgende analyse, såsom fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS), konfokal mikroskopi, genekspression og western blot 11-13.
4. Histopatologi Forberedelse
- For histopatologi analyse, inficere mus med NTHi som beskrevet i trin 2.4. Efter 24 timer af infektionen, ofrer dyrene ved cervikal dislokation. Skar brysthulen med anatomiske saks for at afsløre lungerne og luftrøret som nævnt før. Indsæt derefter 20 gauge kateter ind i luftrøret.
- Fyld lungerne med 2% varme agaroseopløsning udarbejdet i 4% formalin. Nårlunger er fuldt oppustet, sted is på toppen af lungerne til at størkne agaroseopløsning.
- Derefter forsigtigt fjerne thorax stik og sætte det i en 50 ml opløsning af 4% formalin i 1x PBS, indtil den er behandlet for hematoxylin og eosin (H & E) sektioner.
5. FACS farvning af celler i BALF
- Sæt 1 x 10 5 celler fra BALF væske i en 96-brønds V-bund mikrotiterplade.
- Vask cellerne med 300 pi kold 1x PBS og centrifugering ved 4.000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Farv cellerne med cellefarvende opløsning i 100 pi 1x PBS (1: 1.000 fortynding) og holde ved stuetemperatur i 15 min.
- Vask cellerne med 300 pi kold 1x PBS ved 4.000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Holde celler i 100 pi FACS-vaskebuffer [vaskebuffer (1 x PBS, 2% FBS, 1 mM EDTA, 0,1% natriumazid] indeholdende 1: 100 fortyndet Fc-blok i 15 min ved 4 ° C.
- Centrifuger cellerne ved 4000 xg for 3 min og kassere supernatant.
- Farv cellerne med 100 pi overfladefarvning cocktail (1: 100 fortynding) i FACS vaskebuffer i 30 minutter ved 4 ° C.
- Vask cellerne tre gange med 300 pi FACS-vaskebuffer ved 4000 xg i 3 minutter ved 4 ° C.
- Fix celler i 100 pi 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur.
- Vask cellerne to gange med 300 pi 1x PBS ved 400 x g i 3 minutter ved 4 ° C og resuspender i 300 pi FACS-vaskebuffer.
- Gør ensfarvede farvning kontrol ved hjælp af flowcytometri perler.
- Tilsæt en dråbe perler i 96-brønds V-bund mikrotiterplade og vask med 200 pi 1x PBS.
- Tilsæt 1 pi farvning antistof til 100 pi 1x PBS og perler og inkuberes ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Vask perler to gange med 300 pi 1x PBS.
- Analyser single-farvede knapper og celler ved flowcytometri 14.
6. Homogenisering af Lung Tissue at isolere RNA
- Efter infektion, indsamle et lille stykke af lungen (20-40 mg) og holde det i RNA stabiliserende reagens ved 4 ° C natten over. Derefter opbevares det ved -80 ° C indtil det næste trin.
- Vask lungevæv i koldt 1x PBS til at slippe af RNA stabilisering reagens.
- Placer vævet i et 1,5 ml centrifugerør indeholdende lyseringsbuffer (1 ml lyseringsbuffer + 10 pi β-mercaptoethanol).
- Hak vævet i små stykker ved hjælp af spidse saks og homogeniseres ved hjælp af en trådløs motor pellet støder til 20-40 sek.
- Hold lysatet på is i 5 minutter og fortsæt med trin 7.1.
7. RNA Isolation fra Lung
- Centrifugeres lysatet ved 18.000 xg i 3 min. Fjern supernatanten ved pipettering og omhyggeligt overføre det til en ny 1,5 ml rør.
- Tilsæt 1 volumen 70% ethanol til lysatet. Bland straks ved pipettering og vente 2-4 min.
- Overfør op til 700 pi lysat til et spin-søjle placereti et 2 ml opsamlingsrør.
- Centrifuger ved 9600 xg i 15 sek og kassér gennemstrømning.
- Tilføj 350 pi stringent vaskebuffer og centrifugeres ved 9.600 xg i 15 sek. Kassér gennemløbet.
- Tilføj 80 pi DNase I direkte til spin kolonne membran og opbevares ved stuetemperatur i 15 min.
- Tilføj 350 pi stringent vaskebuffer til spin kolonne og der centrifugeres ved 9.600 xg i 15 sek. Kassér gennemløbet.
- Tilføj 500 pi RNA vaskebuffer og centrifugeres ved 9.600 xg i 15 sek. Kassér gennemløbet.
- Tilføj 500 pi RNA vaskebuffer og centrifugering ved 9.600 xg i 2 min. Kassér gennemløbet.
- Placer spinkolonne i et nyt 2 ml opsamlingsrør og der centrifugeres ved 9.600 xg i 1 min. Kassér gennemløbet.
- Tilføj 30-50 pi RNase-frit vand direkte til spin kolonne og der centrifugeres ved 9.600 xg i 1 min. Store RNA ved -80 ° C.
- Udfør RNAseq analyse 14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Intratrakeal instillation resulterede i et markant forøget antal leukocytter i BALF (figur 1A, venstre panel) end installation med saltvand. Den differentialtælling analyse af leukocytterne viste klart forøget neutrofil infiltration (figur 1, højre panel). FACS-analyse af cellerne i BALF bekræftede yderligere det øgede antal neutrofiler (figur 1B). Histologisk analyse af H & E-farvede sektioner af lungevævet viste forøget luftvejsinflammation (figur 1C). Disse data antyder, at kollektivt intratrakeal inddrypning inducerer luftvejsinflammation i mus. For at understøtte anvendelsen af denne fremgangsmåde til undersøgelse signalveje, der regulerer luftvejs patogenese anvendte vi mus, som er deficiente for E3 ubiquitin ligase kløe. Kløe er kendt for at være involveret i regulering inflammatoriske signalveje 15. Vi podetalders- og køn-matchede vildtype C57BL / 6-kontrol og Itch - / - mus med NTHi. Vi isoleret RNA fra lungevæv af kontrol WT og Itch - / - mus og udrettet al transkriptom sekventering for at identificere de inflammatoriske gener, som udtrykkes differentielt. Som vist i figur 2, kløe mangel resulterede i differential ekspression af flere gener. Dette antyder, at intratracheal instillation kan anvendes til at undersøge lungeinflammation, genekspressionsprofiler og signalveje.
Figur 1: intratrakeal podning af NTHi inducerer lungeinflammation hos mus Mus blev inokuleret med NTHi (10 6 CFU / mus) eller en saltvandskontrol.. 24 timer efter podning blev musene aflivet (A) BALF opsamledes. De samlede leukocyt, monocyt- og neutrofile blev bestemt. Data er præsenteretsom middelværdi ± SEM. n = 4 mus / gruppe. * Angiver p <0,05 sammenlignet med saltvandsbehandlede mus. (B) Cellerne i BALF blev farvet med anti-Gr1 antistof og analyseret ved FACS. (C) H & E-farvede lunge sektioner viser leukocyt infiltration og inflammation. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Differential genekspression i lungerne af WT og Itch - / - mus intratrakeal NTHi inokulering 24 timer efter NTHi inokulation, RNA blev isoleret fra lungerne af to WT følgende (1, 2) og to kløe - / -. (1, 2) mus. (A) RNA kvalitet blev analyseret under anvendelse af en Bioanalyzer. (B) Heat kort, der viser Z-scores (tolkes som et mål for sd væk framiddelværdien) for log 2 tæller per million (log 2 CPM) af 172 differentielt udtrykte gener identificeret ved hjælp kantskæreren i Itch - / -. i forhold til WT mus Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Heri beskriver vi en unik og minimalt invasiv procedure til at pode lungerne hos mus med en bakteriel lunge patogen. Vi viser, at denne fremgangsmåde kan anvendes til at studere funktionen af forskellige gener ved anvendelse mus, som er mangelfuld i gener af inflammatoriske signaleringsveje. Denne fremgangsmåde kan ligeledes anvendes til at studere de inflammatoriske reaktioner på virale og fungale lungeinfektioner. Fordelene ved denne fremgangsmåde i forhold til andre metoder, såsom intranasal eller aerosol inhalation (1) i denne procedure, den patogene inokulum direkte indpodet til de nedre luftveje; (2) evnen til at styre inokulum størrelse; og (3) reduceret risiko for bakteriel eksponering for handleren.
Eksponering af luftrøret kirurgisk for at indgyde bakterier er et afgørende skridt, hvor der skal udvises forsigtighed for at undgå at forårsage skade på omgivende væv, især blodkarrene.
Inddrypning af bakterier i trachea should gøres omhyggeligt for at undgå muligheden for død af mus som følge af kvælning. Det foreslås, at podestoffet (ca. 50 pi) frigives langsomt og luft injiceres før og efter inoculum. Holde musen lodret efter instillation i et stykke tid og holde dem sideværts liggende letter hurtigere helbredelse. Den største ulempe ved denne procedure er, at flere engagementer inden for en kort periode ikke er muligt på grund af kravet om operationen. En potentielt problem er, at hvis kateteret placeres for dybt i Bronkie vil BALF celletal være lavere. Dette problem kan løses ved at trække slangen en smule opad.
Da forekomsten af luftvejs inflammatoriske sygdomme er stigende på verdensplan 3,16, forstå patofysiologi af disse sygdomme er af afgørende betydning. De er beskrevet i denne undersøgelse teknologier kan bidrage til at identificere de vigtigste regulatoriske veje og kunne fremme udviklingenaf nye behandlingsmuligheder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Chocolate agar plate | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| Dextrose Anhydrous | Themo Scientific | R01300 | |
| Heparin | Hospira,Inc | RL-3010 | |
| Deft quick solution | Sigma | GS500-500ML | |
| Syringe needle 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| Iml syringe | BD | REF 309602 | |
| Catheter 20GA | BD | REF 381433 | |
| Dissecting Scissors, straight, 10 cm long | kentscientific | INS600393 | |
| Iris Forceps, serrated, 10cm long | kentscientific | INS650915 | |
| Tweezer #5 Stainless steel, 11cm long | kentscientific | INS600095 | |
| 10% Formalin | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| Agarose | peqlab | 35-1020 | |
| 5ml polystyrene round-bottom tubes | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml Microcentrifuge tubes | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini kit | Qiagen | 74104 | |
| Pellet pestile motor (Tissue homoginizer) | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 well microtiter plates V bottom | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | Working dilution 1:100 |
| Ly-6G-eFlor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | Working dilution 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| RBC Lysis Buffer (10X) | Biolegend | 420301 | |
| Live/Dead fixable aqua dead cell stain kit | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 FcBlock | BD | 553142 | |
| Facs tubes polystyrene round bottom tube | BD | 352052 | |
| Formaldehyde | Polyscience | 4018 |
References
- Medzhitov, R.
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M.
- Barnes, P. J. Immunology of asthma and chronic obstructive pulmonary disease. Nat Rev Immunol. 8, 183-192 (2008).
- Sethi, S., Murphy, T. F. Infection in the pathogenesis and course of chronic obstructive pulmonary disease. N Engl J Med. 359, 2355-2365 (2008).
- King, P. T., Sharma, R. The Lung Immune Response to Nontypeable Haemophilus influenzae (Lung Immunity to NTHi). J Immunol Res. 2015, 706376 (2015).
- Kapur, N., Grimwood, K., Masters, I. B., Morris, P. S., Chang, A. B. Lower airway microbiology and cellularity in children with newly diagnosed non-CF bronchiectasis. Pediatr Pulmonol. 47, 300-307 (2012).
- King, P. T., Holdsworth, S. R., Freezer, N. J., Villanueva, E., Holmes, P. W. Microbiologic follow-up study in adult bronchiectasis. Respir Med. 101, 1633-1638 (2007).
- Shuto, T., et al. Activation of NF-kappa B by nontypeable Hemophilus influenzae is mediated by toll-like receptor 2-TAK1-dependent NIK-IKK alpha /beta-I kappa B alpha and MKK3/6-p38 MAP kinase signaling pathways in epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 98, 8774-8779 (2001).
- Moghaddam, S. J., et al. Haemophilus influenzae lysate induces aspects of the chronic obstructive pulmonary disease phenotype. Am J Respir Cell Mol Biol. 38, 629-638 (2008).
- Rajagopalan, G., et al. Intranasal exposure to bacterial superantigens induces airway inflammation in HLA class II transgenic mice. Infect Immun. 74, 1284-1296 (2006).
- Ganesan, S., et al. Elastase/LPS-exposed mice exhibit impaired innate immune responses to bacterial challenge: role of scavenger receptor A. Am J Pathol. 180, 61-72 (2012).
- Hogner, K., et al. Macrophage-expressed IFN-beta contributes to apoptotic alveolar epithelial cell injury in severe influenza virus pneumonia. PLoS Pathog. 9, e1003188 (2013).
- Karisola, P., et al. Invariant Natural Killer T Cells Play a Role in Chemotaxis, Complement Activation and Mucus Production in a Mouse Model of Airway Hyperreactivity and Inflammation. PloS one. 10, e0129446 (2015).
- Theivanthiran, B., et al. The E3 ubiquitin ligase Itch inhibits p38alpha signaling and skin inflammation through the ubiquitylation of Tab1. Sci Signal. 8, 22 (2015).
- Venuprasad, K., Zeng, M., Baughan, S. L., Massoumi, R. Multifaceted role of the ubiquitin ligase Itch in immune regulation. Immunol Cell Biol. , (2015).
- Decramer, M., Janssens, W., Miravitlles, M.
