Here, we describe the development and application of a gel contraction assay for evaluating contractile function in mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition.
Fibrosis is often involved in the pathogenesis of various chronic progressive diseases such as interstitial pulmonary disease. Pathological hallmark is the formation of fibroblastic foci, which is associated with the disease severity. Mesenchymal cells consisting of the fibroblastic foci are proposed to be derived from several cell sources, including originally resident intrapulmonary fibroblasts and circulating fibrocytes from bone marrow. Recently, mesenchymal cells that underwent epithelial-mesenchymal transition (EMT) have been also supposed to contribute to the pathogenesis of fibrosis. In addition, EMT can be induced by transforming growth factor β, and EMT can be enhanced by pro-inflammatory cytokines like tumor necrosis factor α. The gel contraction assay is an ideal in vitro model for the evaluation of contractility, which is one of the characteristic functions of fibroblasts and contributes to wound repair and fibrosis. Here, the development of a gel contraction assay is demonstrated for evaluating contractile ability of mesenchymal cells that underwent EMT.
La fibrosi è coinvolto nella patogenesi di diverse malattie croniche progressive, come la malattia polmonare interstiziale, fibrosi cardiaca, cirrosi epatica, insufficienza renale terminale, sclerosi sistemica, e malattie autoimmuni 1. Tra le malattie polmonari interstiziali, la fibrosi polmonare idiopatica (IPF) è una malattia cronica progressiva e mostra prognosi infausta. caratteristica patologica della IPF è lo sviluppo di focolai fibroblastici costituito da fibroblasti attivati e miofibroblasti che sono associati con la prognosi. Le origini di tali fibroblasti polmonari sono proposti per essere derivato da varie cellule mesenchimali, tra cui fibroblasti polmonari residenti in origine e fibrociti circolanti dal midollo osseo. Recentemente, transizione epitelio-mesenchimale (EMT) è stata proposta per essere associato con la formazione di cellule mesenchimali 2, e contribuire alla patogenesi di malattie fibrotiche.
Si pensa che EMT svolge un ruolo importante nel processo di sviluppo fetale, la guarigione della ferita, e la progressione del cancro, tra cui l'invasione tumorale e metastasi 3. A seguito del processo di EMT, cellule epiteliali ottenere la capacità delle cellule mesenchimali da perdita di marcatori epiteliali, come la E-caderina, e l'espressione di marcatori mesenchimali, quali vimentina, e α-actina del muscolo liscio (SMA) 4,5. Studi precedenti hanno mostrato l'evidenza che processo EMT è stato associato con lo sviluppo della fibrosi tissutale nel rene e del polmone 6 7. Inoltre, l'infiammazione cronica promuove fibrotica malattia 8; Inoltre, tali citochine infiammatorie come il fattore di necrosi tumorale membro superfamiglia 14 (TNFSF14, la luce), il fattore di necrosi tumorale (TNF) -α, e l'interleuchina-1β, hanno dimostrato di migliorare EMT 9-12.
assay contrazione di gel di collagene, un saggio contrazione delle cellule a base di collagene, in cui fibroblasti sono incorporati nel tipo Icollagene gel tridimensionale, è un ideale modello in vitro per la valutazione della contrattilità. Contrattilità è una delle funzioni caratteristiche di fibroblasti e contribuisce al normale ferita riparazione e fibrosi 13. In questo saggio, si ritiene che l'attaccamento di fibroblasti di collagene di tipo I mediante meccanismi di integrine e dovrebbe produrre tensione meccanica in alcune condizioni, e di conseguenza portare alla contrazione del tessuto.
Qui, lo sviluppo del test gel contrazione è segnalato per essere adattato per valutare l'acquisizione della funzione contrattile nelle cellule che sottoposti EMT. Questo rapporto dimostra che questo saggio modificato è adatto per valutare la contrattilità delle cellule mesenchimali che hanno subito EMT.
Il protocollo sviluppato in questo studio comprende due fasi. Il primo passo è eseguito per indurre EMT, mentre il secondo passo è il dosaggio gel contrazione. Poiché è importante confermare che le cellule sottoposti EMT, passaggio 2 fornisce un eccellente complemento ai cambiamenti di espressione morfologiche e geniche. Studi precedenti hanno mostrato che EMT delle cellule A549 è stata indotta da solo il 24 TGF-β1; tuttavia, come abbiamo riportato in precedenza 10, TNF-α aumenta EMT e l'…
The authors have nothing to disclose.
We thank Dr. Tadashi Koyama for technical help. This work was supported in part by JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045, 15K09211, 15K19172; a grant to the Respiratory Failure Research Group from the Ministry of Health, Labour and Welfare, Japan; a grant for research on allergic disease and immunology, Japan.
DMEM | sigma aldrich | 11965-092 | For A549 medium |
FBS | GIBCO | 10437 | |
Transforming Growth Factor-β1, Human, recombinant | Wako Laboratory chemicals | 209-16544 | |
Recombinant Human TNF-α | R&D systems | 210-TA/CF | |
E-Cadherin (24E10) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #3195 | 1:3000 dilution |
Vimentin (D21H3) Rabbit mAb | Cell Signaling Technology | #5741 | 1:3000 dilution |
Anti-α-Tubulin antibody | sigma aldrich | T9026 | 1:10000 dilution |
Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle antibody | sigma aldrich | A5228 | 1:10000 dilution |
Anti-N-cadherin antibody | BD Transduction Laboratories | #610920 | 1:1000 dilution |
Anti-Mouse IgG, HRP-Linked Whole Ab Sheep (secondary antibody) | GE Healthcare | NA931-100UL | 1:20000 dilution |
Anti-Rabbit IgG, HRP-Linked Whole Ab Donkey (secondary antibody) | GE Healthcare | NA934-100UL | 1:20000 dilution |
blocking reagent | GE Healthcare | RPN418 | 2% in TBS-T |
6 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Cell Culture Plate, with Lid | corning | #353046 | |
100 mm cell culture dish | TPP | #93100 | |
DMEM, powder | life technologies | 12100-046 | For 4×DMEM |
type 1 collagen gel | Nitta gelatin | Cellmatrix type I-A | |
24 well cell culture plate | AGC TECHNO GLASS | 1820-024 | |
Gel Documentation System | ATTO | AE-6911FXN | Gel imager |
gel analyzing software | ATTO | Densitograph, ver. 3.00 | analysing software bundled with AE-6911FXN |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | life technologies | 25300054 | |
24 Well Plates, Non-Treated | IWAKI | 1820-024 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | life technologies | 15250-061 | |
RNA extraction kit | Qiagen | 74106 | |
reverse transcriptase | life technologies | 18080044 | |
real time PCR system | Stratagene | Mx-3000P | |
SYBR green PCR kit | Qiagen | 204145 | |
Protease Inhibitor Cocktail (100X) | life technologies | 78429 | |
PVDF membrane | ATTO | 2392390 | |
protein assay kit | bio-rad | 5000006JA | |
polyacrylamide gel | ATTO | 2331810 | |
western blotting detection reagent | GE Healthcare | RPN2232 | |
cold CCD camera | ATTO | Ez-Capture MG/ST | |
Trypsin inhibitor | sigma aldrich | T9003-100MG | |
Polyoxyethylene (20)Sorbitan Monolaurate | Wako Laboratory chemicals | 163-11512 | |
polyoxyethylene (9) octyiphenyl ether | Wako Laboratory chemicals | 141-08321 |