Introduction
转移占引起实体瘤死亡的90％以上。骨是受各种癌症类型，特别是乳腺癌和前列腺癌的转移中最常见的器官。当诊断在临床上，骨转移一般都已经进入高级阶段，在骨无论是溶骨性或成骨细胞的改变，常伴有神经症状。
以往的研究主要集中在明显溶骨骨转移1-3，但是我们目前有溶骨过程来临前限制骨骼微的理解。这至少部分是由于缺乏合适的实验模型和方法。乳腺癌的基因工程小鼠模型常转移至肺部，但更高效地骨4。同样，原位移植瘤很少自发的骨转移，一些骨热带4T1乳腺carcinom子的克隆和MSP过表达PyMT转基因小鼠模型例外5-7。帧内胫钻孔可以提供癌细胞的骨8-10，但它也导致损伤和炎症到局部组织。目前的乳腺癌细胞系心内注射已经调查骨定植11-13的主要方法。然而，在癌症细胞导入左心室只有有限的比例将最终达到骨和骨髓，使得它难以跟踪在一个量化的方式微观转移。
在这项研究中，我们建立了一种技术，即帧内髂动脉（ⅡA）注射14，癌细胞选择性地递送到后肢组织中，从而丰富癌细胞在骨和骨髓而不导致破坏局部组织。由于骨特异性，该方法还允许有足够的时间好逸恶劳癌细胞的一个前殖民最终imals屈从于原发肿瘤或转移的其他重要器官。当与各种其他技术，如生物发光成像，免疫荧光染色和骨形态计量学结合，ⅡA注射是相关的骨转移研究目的宽范围可能有用的，尤其是跟踪从单个癌细胞多小区进展微转移。特别是，我们表明，IIA族注射使我们能够可视化癌细胞和各种类型的在骨微环境周围细胞之间的相互作用。
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Protocol
所有的动物工作是按照药品的贝勒医学院的动物护理准则进行。
1.细胞的制备
注意：不同的癌细胞系可以用于IIA注射取决于研究目的。我们已经使用了乳腺癌细胞系MCF7，4T1，4T07，MDA-MB-361，MDA-MB-231，MDA-MB-436和前列腺癌细胞系C4-2在我们的研究。我们通常使用两种GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞对我们的研究，并从GFP荧光素酶标记的MCF7细胞系在这里显示的一些数据。
- 保持在5％CO 2含有10％FBS和0.1mg / ml的青霉素-链霉素，在37℃的细胞在DMEM中。
- IIA注射前，trypsinize在80细胞 - 90％汇合，用0.25％胰蛋白酶/ EDTA溶液。用冷PBS洗细胞两次，并重新悬浮细胞在10ml PBS中的细胞计数。以除去PBS，离心细胞，在800×g离心5分钟。
- 重新悬浮细胞在冰冷的PBS一个的5×10 6个细胞/ ml的浓度。
- 用100微升GFP-和萤火虫荧光素酶标记的肿瘤细胞注射IIA一个鼠标的。
注意：因此，每个动物接收的细胞数为5×10 5个该数目可能需要基于对细胞系的侵袭性被改变。 - 置于冰上细胞悬液。
可能需要的振动，以防止细胞聚集每隔几分钟，直到它准备好用于注射：音符。对于某些细胞系（如MDA-MB-231），可能需要更严格的程序（ 例如 ，通过45微米的细胞滤网），以防止聚集。请注意，血管的堵塞可导致组织坏死，并且因此混杂的实验。
2.动物的制备
- 动物疼痛管理，得到5毫克/公斤/天卡洛芬（或其它止痛药）与膳食补充剂给小鼠手术前不小于24小时。管理剂量的手术前0.1毫克/毫升丁丙诺啡皮下注射60分钟。注意：任选的步骤是植入雌二醇托盘到动物的背部，以提供额外的雌二醇。这将加速ER +肿瘤细胞的增长（ 如 MCF-7细胞）9。
- 麻醉4 - 第6周龄小鼠（约20克）用氯胺酮（80 - 100毫克/千克）和赛拉嗪（10 -12.5毫克/毫升）腹腔注射。
- 通过确认脚趾捏20 G鼠标和呼吸频率减少50％的观察镇静的适当水平和粉红色粘膜（如鼠耳皮肤和皮肤爪子）。保持手术过程中监测这些生命体征，每15分钟。注：动物的无动作表明，该动物是充分麻醉，准备手术。
- 使用于眼部兽医药膏，以防止干燥。
- 剃须鼠标放在下腹部，尤其是右腹股沟区域，手术和注射会发生。
注意：如果使用无胸腺裸鼠这是没有必要的。 - 把鼠标在它的后面，传播腿在它们的自然位置，坚持脚趾用胶带剥离移动纸板。
- 请用70％乙醇异丙醇浸泡消毒棉签右腹股沟区，随后与优碘手术擦洗几次。
3.髂总静脉和动脉位置，并分离
- 使1.0皮肤切口- 1.2厘米长的第4 次 ，并使用在3号手柄保持无菌，＃10碳钢手术刀片5 个乳头在右下腹部之间。然后用无菌手术盖布来覆盖动物体除外切口部位。
- 移动动物标准台式解剖显微镜。使用4X的放大率注射。
- 根据解剖显微镜的放大4倍，将脂肪组织和peritoneu之间钝性分离钳m和向外推两侧组织以暴露髂血管和神经（参见图1）。
注意：从中线主动脉和动脉分支的下部之间的动脉被称为髂总动脉。这是其中注入发生。 - 使用一对直线细镊子通过血管和神经之间的结缔组织（如膜）打破，接近船只。
- 切换直细镊子左手。抓住一对用右手角度的细镊子的。将右手镊子到同一位置，结缔组织已经被打破。然后通过粘右手镊子，容器的下方。
- 同时，插入左手镊子插入血管的左侧的结缔组织，以指导右手镊子经历。
- 一旦右手镊子得到船底下，试图将船从周围的TI分开ssue多一点点，然后让他们在右手镊子的顶部。
- 使用左手钳提供一个4-0丝线缝合的尖端右手镊子，然后通过血管下方轻柔缓慢地拉出缝合。注：现在无论是常见的静脉和动脉血管被缝合举起来（ 见图2）。
4.注射后注射护理
- 准备用于注射的细胞在31克胰岛素注射器。使用100μl的细胞悬浮液在PBS中每次注射。确保吸取上下数次以分离细胞并避免聚合，使得注射的细胞不会堵塞和阻塞血液流动。
- 与在左手倾斜钳，把钳子沿着缝线的引导容器的下方，然后打开钳子的两个臂，具有对镊子轻轻保持的血管。
注意：钳子的两个臂之间的间隔将是第injection网站。 - 持用100μl细胞悬浮液的31克针在右侧，与针的斜面向上，准备用于注射。
- 针插入动脉管腔（血液会进入针头）。然后推细胞悬浮液缓慢地注入细胞。将细胞悬浮液将推开红细胞中的容器中。尽量不要打破船只或泄漏细胞悬液出来。
- 当注射完毕后，轻轻地拉了回来针，并继续保持船只在左边手钳止血。话扯远了缝合。
- 拉开左手钳，赶紧用棉签按压切开动脉区止血。
注意：通常5 - 10分钟的持续压力足以止血。 - 当出血停止，用皮胶，关闭手术区域的皮肤边缘。使耳标签，并检查生物发光信号来检查注射的细胞的分布。<BR />注：一个成功的注入将导致类似的图像中图3。
- 以100微升15毫克/毫升的荧光素在PBS注射75毫克/经由帧内眶窦千克小鼠浓度检查的生物发光信号。
- 对于帧内入轨，把鼠标两侧眼球的手指，使用压力，使眼球从眼睛框稍微弹出，插入眼球和鼻子之间的28克胰岛素注射器针头，然后慢慢推注射器注入荧光素。
注意：在正确的位置，针应能达到2的深度 - 打硬组织（骨）前3毫米。 - 鼠标放置到成像系统用于体内整个动物成像10 - 5分钟内60秒（ 见图3）。
注意：可选的步骤是植入雌二醇粒料到动物的背部，以提供额外的雌二醇。这将加速ER +肿瘤细胞的生长（ 例如 ，MCF-7细胞）15。
- 对于帧内入轨，把鼠标两侧眼球的手指，使用压力，使眼球从眼睛框稍微弹出，插入眼球和鼻子之间的28克胰岛素注射器针头，然后慢慢推注射器注入荧光素。
- 以100微升15毫克/毫升的荧光素在PBS注射75毫克/经由帧内眶窦千克小鼠浓度检查的生物发光信号。
- 离开鼠标放在一个温暖的加热垫，直到醒来。监控出血，肿胀，在手术后的一段开裂和疼痛的迹象。把老鼠回用镇痛药覆盖率（carprofin膳食补充剂的建议）疼痛管理给定的，直到没有痛苦的迹象笼。在手术后7天密切关注和照顾动物。
5.监测转移性生长
- 组织形态测定：
- 收获肿瘤携带骨组织，固定在4％低聚甲醛的骨头24小时，然后脱钙它们在pH 7.0的3 14％的EDTA溶液-第5天，并使其受到石蜡包埋如前所述14。
- 部以3微米的厚度的石蜡嵌入骨组织和如先前所述14进行苏木精/曙红染色的标准的组织学方法。
- Immunohistochemis尝试：
- 受试者石蜡包埋的肿瘤轴承骨滑动如前所述14免疫组织化学染色用于各种目的。简言之，将免疫染色的MCF7肿瘤细胞通过抗GFP抗体，和免疫染色的成骨细胞（预成骨细胞和成骨细胞）分别由抗Osterix的抗体和抗碱性磷酸酶（ALP）的抗体。
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Representative Results
图1示出的解剖位置和髂总动脉（红色）和静脉（蓝色）的关系。
图2显示了在解剖镜下髂血管和神经的相对位置。 如图2A所示，血管和神经的右腹膜壁下方和皮肤切口由与腹膜推开后，可以发现。髂总静脉是在左侧，并与动脉是更大和更暗。动脉是在中间，并期待粉红色。它比静脉薄，但有更厚的肌壁。静脉和动脉平行且相互紧密相连。在右边更远是白腰骶神经。 图2B示出了由4-从周围结缔组织，肌肉和神经分离，并举起髂血管0丝线缝合。髂总静脉，动脉，腰骶神经也表示。
图3显示了内髂动脉注射后的代表在体内和动物的体外生物发光图像。五×10 5个 GFP荧光素标记的MCF7细胞在100μl被施用到由内髂动脉注射的小鼠的右后肢。 D-萤光素然后通过内轨道窦注射给药，随后在体内整个动物生物发光成像。注入的MCF7细胞在小鼠的右后肢富集由生物发光信号（ 图3A）所指示的。整个动物的体内生物发光信号每3天或每星期进行了追踪，然后收获小鼠骨组织在第14天注射后当整个动物的生物发光信号达到一定的阈值（光子通量> 104）。 D-萤光素给药后，从内髂动脉注射小鼠的骨组织被迅速收集并浸入在PBS用于离体成像。从内髂动脉的强生物发光信号注入右后肢骨骼而不是从左侧控制骨表明注射的细胞（ 图3B）的具体定位。
图4示出了组织学和免疫荧光染色的代表性图像。当肿瘤轴承骨收获，对它们进行多聚甲醛固定，EDTA脱钙，然后石蜡包埋。准备三个微米骨幻灯片和进行标准的H＆E染色。紧凑鹅卵石样细胞具有较大的细胞核在骨组织中微观的MCF7转移性病灶内髂动脉注射后14天，用红色箭头所示。骨髓（BM）和大粉平小梁骨（TB）与稀疏核被如此标记的（ 图4A）。 图4B示出GFP标记MCF7细胞（绿色），ALP标记的成骨细胞（左图像中的红色），和Osterix的标记前成骨细胞（红色右图中）免疫荧光染色后。蓝色DAPI染色表示细胞核。
图 1： 在小鼠髂总动脉（红色）和静脉（蓝色）的解剖学腹主动脉，髂总动脉，髂外动脉和股动脉被示为指示。注射液是从朝向股动脉方向主动脉髂总动脉进行。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：用放大4倍标准的解剖显微镜下髂血管和神经 （ 一 ）完整的血管和神经的图像。 （ 二 ）解除血管的图像。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：代表 在体内 和 小鼠的 体外 生物发光图像内髂动脉注射后。 （ 一 ）注射后整个动物权利在体内的生物发光信号。 （ 二 ） 体外生物发光信号左控制骨骼和收获7-14天后即注射的动物的权利注入骨。所有的生物发光信号分别按照制造商推荐的程序和设置测量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图4： 组织学和免疫荧光染色的代表性图像 。 （ 一 ）代表H＆E染色MCF7肿瘤的骨组织内，髂动脉注射后的图像。比例尺= 25微米。注意：HE染色不检测肿瘤的有效途径。在较低的放大倍率，HE染色不够准确区分肿瘤。在更高的放大倍率，则不能有效地扫描所有的一REAS。 （b）该MCF7肿瘤轴承骨组织的免疫荧光染色图像。绿色：GFP标记MCF7细胞，红左侧图像中：ALP标记成骨细胞，红右图像：Osterix的标记前成骨细胞。蓝色DAPI染色表示细胞核。比例尺= 25微米。 请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
虽然只有髂动脉被注射癌细胞的目标，我们建议既髂静脉和动脉从周围组织中分离，并把它们一起抬起作为包。这是因为静脉和动脉广泛相互接触，与静脉血管壁薄，容易断裂。因此，对于一个成功的注射，这样可以节省时间和精力，将两个容器保持在一起，虽然癌细胞仅注射到动脉。 4-0丝线来帮助这个过程如图2所示，缝合线还可以帮助它应该出现止血。
需要的解剖显微镜下进行IIA注射的大多数步骤。鼠标容器是柔软而小，这使得程序有挑战性。在我们的经验100％ - 然而，经过充分实践，成功率可以达到90。
利用这种技术，研究人员可以是BLE建立自己喜欢的肿瘤细胞模型的骨骼殖民化模型，包括那些传统上认为“非转移”。 MCF-7细胞表示这样的例子。事实上，在骨微环境到达时，MCF-7细胞起飞拓殖之前经历短暂休眠。在进行原位乳腺癌MCF-7异种移植物的动物已检测很少自发骨转移。然而，故障很可能从播散的肿瘤细胞的剩余量，定植的缓慢启动，和原位肿瘤的更积极的增长（即杀死动物前骨病变可建立）导致。因此，缺乏检测不能被视为证据对MCF-7细胞对转移的能力。事实上，无痛甚至休眠骨微可以是在人类乳腺癌患者更为普遍，因为建议的几年到几十年的休眠是经常出现在诊所。
IIA注射液不仅可以应用于陆minal或基底乳腺癌细胞，而且对其他类型的癌症，如前列腺癌。当与技术监控骨病不同的选择相结合，内髂动脉注射可对许多研究目的显著的贡献。我们通常使用的生物发光信号跟踪骨转移进展内髂动脉注射后，再收获荷瘤骨荧光免疫组织化学染色确定肿瘤细胞和周围骨龛微环境之间的相互作用。骨形态计量学16-17和μCT18-20可用于评估骨结构的改变和由癌细胞接种引起骨的其它解剖学细节。适当的考虑和组合应该由每个小组针对其特定的研究目的而定。
类似内胫骨和8-10内接种心11-13，内部金正日的警告IAC动脉注射的是，它不概括在转移过程栓塞和肿瘤细胞进入循环之前早期步骤。理想的情况下，就需要从原位肿瘤开始自发转移过程中充分概括转移级联。然而，这种方法是在大多数模型高度低效的，只有少数例外，例如一些骨嗜4T1亚克隆5-6和MSP过表达PyMT转基因小鼠模型7。我们希望IIA注入将提供新的见解骨殖民化进程，又可以方便设计和真正有效的自发骨转移模型的开发临床前研究。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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