Introduction
Métastases représentent plus de 90% des décès causés par des tumeurs solides. L'os est l'organe le plus commun affecté par des métastases de divers types de cancer, notamment les cancers du sein et de la prostate. Lorsqu'elle est diagnostiquée dans la clinique, les métastases osseuses habituellement sont déjà entrés dans les stades avancés avec soit ostéolytiques ou ostéoblastiques altérations osseuses, souvent accompagnées de symptômes neurologiques.
Des études antérieures principalement axées sur les manifestes des métastases osseuses ostéolytiques 1-3, mais nous avons actuellement compréhension des micrométastases dans les os limité avant le début du processus d'ostéolyse. Ceci est au moins en partie à cause du manque de modèles et approches expérimentales appropriées. Des modèles de souris transgéniques de cancer du sein métastasent souvent aux poumons, mais beaucoup moins efficacement aux os 4. De même, les tumeurs orthotopiquement transplantées développent rarement des métastases osseuses spontanées, avec une certaine 4T1 carcinom mammaire d'os-tropicalun sous-clones et MSP surexprimés modèle de souris transgénique PyMT comme des exceptions 5-7. Perçage intra-tibial peut fournir les cellules cancéreuses à l'os 8-10, mais il encourt également des dommages et de l' inflammation dans les tissus locaux. Actuellement injection intra-cardiaque de lignées de cellules de cancer du sein a été la principale approche pour étudier la colonisation osseuse 11-13. Cependant, après que les cellules cancéreuses sont introduits dans le ventricule gauche seulement une proportion limitée sera finalement atteindre l'os et la moelle osseuse, ce qui rend difficile le suivi des métastases microscopiques d'une manière quantifiable.
Dans cette étude, nous établissons une technique, à savoir l' artère intra-iliaque (IIA) injection 14, pour délivrer sélectivement les cellules cancéreuses dans les tissus des membres postérieurs, enrichissant ainsi les cellules cancéreuses dans les os et la moelle osseuse sans causer de dommages aux tissus locaux. En raison de la spécificité de l'os, cette approche permet également de suffisamment de temps pour les cellules cancéreuses indolents pour coloniser finalement avant unimals succombent à des tumeurs primaires ou de métastases dans d'autres organes vitaux. Lorsqu'il est combiné avec une variété d'autres techniques, telles que l'imagerie par bioluminescence, immunofluorescence et histomorphométrie osseuse, l'injection IIA est potentiellement utile pour un large éventail d'objectifs de recherche liés à des métastases osseuses, en particulier pour suivre la progression des cellules cancéreuses individuelles à multi-cellulaire micrométastases. En particulier, nous avons démontré que l'injection II nous permet de visualiser les interactions entre les cellules cancéreuses et les différents types de cellules dans le microenvironnement entourant l'os.
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Protocol
Tous les travaux de l'animal a été fait conformément aux directives de protection des animaux du Baylor College of Medicine.
1. Préparation des cellules
Remarque: Les différentes lignées de cellules cancéreuses peuvent être utilisés pour l'injection en fonction AII fins de recherche. Nous avons utilisé des lignées de cellules de cancer du sein MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 et la lignée cellulaire de cancer de la prostate C4-2 dans notre recherche. Nous utilisons généralement à la fois GFP et luciole cellules cancéreuses luciférase marqué pour notre étude et nous montrons quelques données ici à partir de la lignée cellulaire MCF7 GFP-luciférase marqué.
- Maintenir les cellules dans du DMEM contenant 10% de FBS et 0,1 mg / ml de pénicilline-streptomycine à 37 ° C dans 5% de CO2.
- Avant injection IIA, trypsiniser cellules à 80 - 90% de confluence avec 0,25% de solution / EDTA trypsine. Utilisez PBS froide pour laver les cellules deux fois, et remettre en suspension les cellules dans 10 ml de PBS pour le comptage des cellules. Pour supprimer PBS, les cellules de centrifugation à 800 g pendant 5 min.
- cellules Re-suspendreà une concentration de 5 x 10 6 cellules / ml dans du PBS glacé.
- Utilisez 100 GFP pi et les cellules cancéreuses luciole luciférase marqué pour l'injection IIA d'une souris.
Remarque:. Par conséquent, le nombre de cellules reçues par chaque animal est de 5 x 10 5 Ce nombre peut être nécessaire de modifier en fonction de l'agressivité des lignées cellulaires. - Gardez des suspensions de cellules sur la glace.
Note: Les vibrations peuvent être nécessaires pour empêcher l'agrégation des cellules toutes les quelques minutes jusqu'à ce qu'il soit prêt pour l'injection. Pour certaines lignées de cellules (comme MDA-MB-231), des procédures plus strictes (par exemple, en passant par 45 um tamis cellulaire) peuvent être nécessaires pour empêcher l' agrégation. S'il vous plaît noter que le sabot des navires peut provoquer une nécrose des tissus, et donc confondre les expériences.
2. Préparation des animaux
- Pour la gestion de la douleur animale, donner 5 mg / kg / jour carprofène (ou un autre analgésique) avec supplément alimentaire pour les souris pas moins de 24 heures avant la chirurgie. Administrerune dose de 0,1 mg / ml de buprénorphine sous-cutanée 60 minutes avant l'intervention chirurgicale. Remarque: une procédure facultative consiste à implanter estradiol palette dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer le grossissement des cellules ER + cancer (par exemple, cellules MCF-7) 9.
- Anesthésier a 4 - souris âgées de 6 semaines (environ 20 g) avec de la kétamine (80 - 100 mg / kg) et de xylazine (10 -12,5 mg / ml) par injection intrapéritonéale.
- Confirmer le niveau approprié de la sédation d'une souris de 20 g par pincement de l' orteil et l'observation d'une réduction de 50% de la fréquence respiratoire et rose des muqueuses (par exemple, la peau de l' oreille de la souris et de la peau de la patte). Gardez le contrôle de ces signes vitaux toutes les 15 min pendant la chirurgie. Remarque: Aucun mouvement de l'animal indique que l'animal est suffisamment anesthésié et prêt pour la chirurgie.
- Utilisez vétérinaire pommade sur les yeux pour prévenir la sécheresse.
- Rasez la souris sur le bas-ventre, en particulier la région de l'aine droite où la chirurgie et l'injection seraprend place.
Note: Ceci est pas nécessaire si la souris nude athymiques sont utilisés. - Placez la souris sur le dos, les jambes se propager dans leurs positions naturelles et de coller les orteils au carton de dissection mobile avec du ruban adhésif.
- Essuyez la région de l'aine droite avec 70% d'éthanol isopropylique imbibés des cotons-tiges stériles, puis avec de la bétadine récurer chirurgicale plusieurs fois.
3. La Veine iliaque commune et Artère Lieu et séparation
- Faire une incision de la peau de 1,0 - 1,2 cm de long entre le 4 e et 5 e mamelons dans l'abdomen inférieur droit, en utilisant # 10 carbone lames de scalpels en acier stériles maintenues dans une poignée n ° 3. Ensuite, utilisez un drap chirurgical stérile pour couvrir le corps de l'animal à l'exception du site d'incision.
- Déplacer l'animal à banc norme top dissection microscope. Utilisez un grossissement de 4X pour injection.
- 4X sous grossissement du microscope à dissection, insérer une pince de séparation entre émoussées le tissu adipeux et le peritoneum, et pousser les tissus vers l' extérieur sur les deux côtés pour exposer les vaisseaux iliaques et des nerfs (voir Figure 1).
Remarque: L'artère entre l'aorte de la ligne médiane et la partie inférieure des branches de l'artère est appelée artère iliaque commune. Ceci est le lieu de l'injection. - Utilisez une paire de pinces fines droites pour briser le tissu conjonctif (comme une membrane) entre les navires et le nerf, plus près des vaisseaux.
- Mettez les pinces fines droites à la main gauche. Prenez une paire de pinces fines à angle en utilisant la main droite. Insérez la pince de la main droite en même position où les tissus conjonctifs ont été brisées. Et puis coller la pince de la main droite à travers, sous les navires.
- Dans le même temps, insérez la pince de la main gauche dans les tissus conjonctifs sur le côté gauche des vaisseaux pour guider la pince de la main droite en passant par.
- Une fois que la pince de la main droite obtient sous les vaisseaux, essayer de séparer les vaisseaux de la ti environnantessu un peu plus, puis les garder au-dessus de la pince de la main droite.
- Utilisez une pince de la main gauche pour délivrer la pointe d'une suture 4-0 en soie à la pince de la main droite, puis tirez la suture doucement et lentement à travers sous les vaisseaux. Note: Maintenant , les deux navires de la veine et l' artère communes sont soulevées par la suture (voir la figure 2).
4. Injection et post-injection de soins
- Préparer les cellules pour l'injection dans un 31 G seringue à insuline. Utiliser 100 ul de suspension cellulaire dans du PBS par injection. Assurez-vous de la pipette de haut en bas plusieurs fois pour séparer les cellules et éviter l'agrégation de telle sorte que les cellules injectées ne seront pas obstruer et bloquer le flux sanguin.
- Avec la pince à angle dans la main gauche, placez la pince sous les navires le long de la direction de la suture, puis ouvrez les deux bras de la pince, ayant les navires détenus doucement sur la pince.
Remarque: L'intervalle entre les deux branches de la pince sera l'iSite njection. - Tenez le G aiguille 31 avec 100 suspensions cellulaires ul dans la main droite, avec le biseau de l'aiguille vers le haut, prêt pour l'injection.
- Insérez l'aiguille dans la lumière de l'artère (sang entrera dans la pointe de l'aiguille). Poussez ensuite la suspension cellulaire lentement pour injecter les cellules. La suspension cellulaire va repousser le sang rouge dans le récipient. Essayez de ne pas briser les vaisseaux ou d'une fuite de la suspension cellulaire sur.
- Lorsque l'injection est terminée, tirez doucement l'aiguille et maintenez les vaisseaux sur la pince de la main gauche pour arrêter le saignement. Puis arracher la suture.
- Retirez les pinces de la main gauche, et d'utiliser rapidement un coton-tige pour presser la zone d'incision de l'artère pour arrêter le saignement.
Remarque: En général, 5-10 min pression continue est suffisante pour arrêter le saignement. - Lorsque le saignement arrête, utiliser la colle de peau pour fermer les bords de la peau de la zone de la chirurgie. Faire une marque auriculaire, et vérifier la signalisation pour examiner la répartition des cellules injectées bioluminescence. <br /> Note: Une injection réussie se traduira par une image similaire à la figure 3.
- Vérifiez la signalisation bioluminescence par injection de 100 pi de 15 mg / ml de luciférine dans du PBS à 75 mg / concentration kg souris via le sinus intra-orbitaire.
- Pour l'injection intra-orbitaire, mettre les doigts des deux côtés de l'oeil de la souris, utiliser la pression pour faire boule d'oeil légèrement pop hors du cadre de l'oeil, insérez 28 G aiguilles insuline de seringues entre boule d'oeil et le nez, puis pousser lentement seringue pour injecter luciférine .
Remarque: À la bonne position, l'aiguille doit être en mesure d'atteindre une profondeur de 2 - 3 mm avant de frapper les tissus durs (os). - Placer la souris dans le système d'imagerie pour l'imagerie in vivo de l' animal entier pendant 10-60 secondes à 5 min (voir la figure 3).
Note: Une procédure facultative est d'implanter estradiol pellet dans le dos des animaux pour fournir estradiol supplémentaire. Cela permettra d' accélérer la croissance des cellules ER + cancer (par exemple, MCF-7cellules) 15.
- Pour l'injection intra-orbitaire, mettre les doigts des deux côtés de l'oeil de la souris, utiliser la pression pour faire boule d'oeil légèrement pop hors du cadre de l'oeil, insérez 28 G aiguilles insuline de seringues entre boule d'oeil et le nez, puis pousser lentement seringue pour injecter luciférine .
- Vérifiez la signalisation bioluminescence par injection de 100 pi de 15 mg / ml de luciférine dans du PBS à 75 mg / concentration kg souris via le sinus intra-orbitaire.
- Laissez la souris sur un coussin chauffant au chaud jusqu'à ce qu'il se réveille. Surveiller le saignement, un gonflement, des signes de déhiscence et de la douleur au cours de la période post-chirurgicale. Mettez les souris dos à la cage avec une couverture analgésique (complément alimentaire carprofin suggéré) donnée pour la gestion de la douleur jusqu'à ce que aucun signe de douleur. Portez une attention particulière et des soins aux animaux pendant 7 jours après la chirurgie.
5. Suivi de croissance métastatique
- histomorphométrie:
- Récolte portant une tumeur des tissus osseux, fixer les os dans 4% de paraformaldehyde pendant 24 heures, puis décalcifier les pH 7,0 solution d'EDTA 14% pour les 3 - 5 jours et les soumettre à l' inclusion en paraffine comme décrit précédemment 14.
- Section Les tissus osseux paraffine intégrer à l'épaisseur de 3 um et effectuer la méthode histologique standard d'hématoxyline / éosine comme décrit précédemment 14.
- ImmunohistochemisEssai:
- Objet portant une tumeur osseuse dans la paraffine coulisse pour coloration immunohistochimique à diverses fins 14 comme décrit précédemment. En bref, MCF7 immunocoloration des cellules cancéreuses par des anticorps anti-GFP et les cellules ostéogéniques immunocoloration (pré-ostéoblastes et les ostéoblastes) par les anticorps anti-Osterix et l'anti-phosphatase alcaline (ALP) des anticorps, respectivement.
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Representative Results
La figure 1 illustre la localisation anatomique et la relation de l' artère iliaque commune (rouge) et la veine (bleu).
La figure 2 montre la position relative des vaisseaux iliaques et les nerfs en microscopie de dissection. Comme le montre la figure 2A, les vaisseaux et les nerfs sont juste en dessous de la paroi péritonéale et peuvent être révélées après l'incision de la peau est faite et le péritoine est repoussé. La veine iliaque commune est sur la gauche, et est plus grand et plus sombre par rapport à l'artère. L'artère est au milieu, et regarde rose. Il est plus mince que la veine, mais a plus épaisse paroi musculaire. La veine et l'artère sont parallèles et étroitement reliés entre eux. Plus loin , sur la droite est le nerf lombo blanc. La figure 2B montre les vaisseaux iliaques communs séparés du tissu conjonctif, les muscles et les nerfs environnants, et levé par un 4-0 soie suture. La veine iliaque commune, l'artère et le nerf lombo sont également indiqués.
La figure 3 montre représentative in vivo et ex vivo des images de bioluminescence des animaux après injection intra-artérielle iliaque. Cinq x 10 5 cellules MCF7 GFP-luciférine marqué dans 100 pi ont été administrés à la patte arrière droite de la souris par injection de l' artère intra-iliaque. D-luciférine a été ensuite administrée par injection intra-sinusienne orbite, suivie par l'imagerie in vivo dans toute la bioluminescence animale. Les cellules MCF7 ont été enrichies par injection à la patte postérieure droite de la souris , comme indiqué par les signaux de bioluminescence (figure 3A). Les signaux de bioluminescence in vivo de l'animal entier ont été suivis tous les 3 jours ou toutes les semaines, et ensuite les tissus osseux de souris ont été récoltées au jour 14 post-injection lorsque l'ensemble signal de bioluminescence animal atteint un certain seuil (Photon flux> 10 4). Après l' administration de D-luciférine, les tissus osseux à partir de l' artère iliaque intra-souris injectées ont été rapidement prélevés et immergés dans du PBS pour l' imagerie ex vivo. Le signal de bioluminescence forte de l'artère intra-iliaque injecté os postérieur droit , mais pas de l'os de la commande de gauche a montré la localisation spécifique des cellules injectées (Figure 3B).
La figure 4 montre des images représentatives de la coloration histologique et immunofluorescence. Lorsque la tumeur portant des os ont été récoltés, ils ont été soumis à la fixation de paraformaldehyde, EDTA décalcification, puis paraffine-plongement. Trois um diapositives osseuses ont été préparées et la coloration H & E norme ont été réalisées. Les cellules de pavés en forme compacte avec de plus grands noyaux étaient des lésions métastatiques MCF7 microscopiques dans le tissu osseux 14 jours après l'injection intra-artérielle iliaque, comme indiqué par les flèches rouges. La moelle osseuse (BM) Et les gros os trabéculaire plat rose (TB) avec des noyaux rares sont donc étiquetés (figure 4A). La figure 4B montre GFP marqué les cellules MCF7 (vert), ostéoblastes ALP-étiquetés (rouge dans l'image à gauche), et Osterix marqué pré-ostéoblastes (rouge dans l'image de droite) après immunofluorescence. Bleu coloration DAPI indique le noyau.
Figure 1:. Anatomie de l' artère iliaque commune (rouge) et la veine (bleu) chez la souris aorte abdominale, artère iliaque commune, l' artère iliaque externe, et l' artère fémorale sont présentées comme indiqué. L' injection est réalisée à l' artère iliaque commune de l' aorte vers la direction de l' artère fémorale. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2:. Vaisseaux iliaques et les nerfs sous microscope de dissection standard avec grossissement 4X (a) l' image des vaisseaux intacts et les nerfs. (B) Image de navires levés. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: Représentant in vivo et ex vivo images de bioluminescence de la souris après l' injection de l' artère intra-iliaque. (A) Le signal de bioluminescence in vivo de l'ensemble de droite des animaux après l' injection. (B) L'ex vivo signal de bioluminescencede gauche os de contrôle et le droit os injecté à partir d'animaux qui ont été injectés récoltées 14 jours plus tard. Tous les signaux de bioluminescence ont été mesurés en suivant la procédure et les paramètres recommandés par le fabricant. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 4: Des images représentatives de la coloration histologique et immunofluorescence. (A) l' image de coloration représentant H & E de MCF7 portant une tumeur du tissu osseux après l' injection de l' artère intra-iliaque. Barre d'échelle = 25 pm. Note: coloration HE est pas le moyen efficace pour détecter les tumeurs. Dans un grossissement plus faible, la coloration HE ne sont pas assez sensibles pour différencier les tumeurs. Dans un plus fort grossissement, il est efficace pour balayer tous les areas. (B) les images de coloration immunofluorescence du tissu portant des os MCF7 de tumeur. Vert: les cellules MCF7 GFP marquée, rouge dans l'image à gauche: ostéoblastes ALP-étiquetés, Rouge à l'image de droite: Osterix-étiquetés pré-ostéoblastes. Bleu coloration DAPI indique le noyau. Barre d'échelle = 25 pm. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Bien que l'artère iliaque est la cible d'injection pour les cellules cancéreuses, nous recommandons la séparation des deux veine iliaque et l'artère à partir de tissus environnants, et les élevons ensemble comme un paquet. En effet, la veine et l'artère contacter intensivement les uns avec les autres, et la paroi du vaisseau veineux est mince et est facile à briser. Par conséquent, pour une injection réussie, il fait gagner du temps et des efforts pour maintenir les deux navires ensemble, bien que les cellules cancéreuses sont injectées seulement à l'artère. Une suture 4-0 en soie est utilisé pour aider ce processus comme le montre la figure 2. La suture peut aussi aider les saignements d'arrêt si elle se produit.
La plupart des étapes de l'injection IIA doivent être effectuées sous le microscope de dissection. Les vaisseaux de la souris sont doux et faible, ce qui rend les procédures difficiles. Cependant, après une pratique suffisante, le taux de réussite peut atteindre 90 - 100% dans notre expérience.
Avec cette technique, les chercheurs peuvent êtreble d'établir des modèles de colonisation osseuse de leurs modèles de cellules cancéreuses préférés, y compris ceux qui sont traditionnellement pensé "non-métastatique". Cellules MCF-7 représentent un exemple. En effet, en arrivant dans le microenvironnement osseux, MCF-7 cellules subissent une courte dormance avant de décoller pour coloniser. Très peu de métastases osseuses spontanées ont été détectées chez des animaux porteurs orthotopique MCF-7 xénogreffes. Cependant, l'échec peut résulter de la quantité résiduelle de cellules tumorales disséminées, l'initiation lente de la colonisation, et la croissance plus agressive des tumeurs orthotopique (qui tue les animaux avant que les lésions osseuses peuvent établir). Ainsi, le manque de détection ne peut pas être considérée comme une preuve contre la capacité des cellules MCF-7 à métastaser. En fait, micrométastases osseuses indolents ou même dormants peuvent être plus fréquentes chez les patients atteints de cancer du sein humain, comme l'a suggéré la dormance par des années à des décennies que l'on voit souvent dans la clinique.
injection IIA peut être appliqué non seulement luminal ou des cellules de cancer du sein de base, mais aussi d'autres types de cancer tels que le cancer de la prostate. Lorsqu'il est combiné avec différents choix de techniques de surveillance des maladies de l'os, l'injection de l'artère intra-iliaque peut apporter une contribution significative à de nombreuses fins de recherche. Nous utilisons habituellement signalisation de bioluminescence pour suivre la progression de métastase osseuse après l'injection intra-artérielle iliaque, puis les os porteurs de tumeurs récolte pour la coloration immunohistochimique de fluorescence pour définir les interactions entre les cellules cancéreuses et entourant les niches microenvironnement osseux. Histomorphométrie osseuse 16-17 et 18-20 μCT peut être utilisé pour évaluer les modifications de la structure des os et d' autres détails anatomiques de l' os qui sont causés par l'inoculation des cellules cancéreuses. considérations et des combinaisons appropriées doivent être déterminées par chaque groupe pour leur but spécifique de recherche.
Semblable à intra-tibial 8-10 et l' inoculation intra-cardiaque 11-13, une mise en garde du commerce intra-ill'injection de l'artère iac est qu'il ne récapituler pas les premières étapes dans le processus métastatique avant l'embolie et l'entrée des cellules tumorales dans la circulation. Dans l'idéal, un processus de métastase spontanée à partir de tumeurs orthotopiques serait nécessaire pour récapituler complètement la cascade de métastases. Cependant, ce processus est très inefficace dans la plupart des modèles, avec seulement quelques exceptions près, comme certains os tropique 4T1 sous-clones 5-6 et MSP surexprimé PyMT modèle de souris transgénique 7. Nous espérons que l'injection IIA fournira de nouveaux aperçus sur le processus de colonisation osseuse, ce qui peut à son tour faciliter la conception et le développement de modèles de métastases osseuses spontanées vraiment efficaces pour les études pré-cliniques.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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