Introduction
Le metastasi rappresentano oltre il 90% dei decessi causati da tumori solidi. Bone è l'organo più comuni colpite da metastasi di vari tipi di cancro, in particolare della mammella e della prostata. Al momento della diagnosi in clinica, metastasi ossee di solito sono già entrati fase avanzata sia con osteolitiche o osteoblastiche alterazioni nel tessuto osseo, spesso accompagnati da sintomi neurologici.
Studi precedenti prevalentemente concentrati sulle evidenti metastasi osteolitiche 1-3, ma attualmente abbiamo limitato la comprensione di micrometastasi nel ossa prima dell'inizio del processo osteolitica. Questo è almeno in parte a causa della mancanza di appropriati modelli sperimentali e approcci. Modelli murini geneticamente modificati di cancro al seno spesso metastatizzano ai polmoni, ma molto meno efficiente alle ossa 4. Allo stesso modo, i tumori ortotopicamente trapiantati raramente sviluppano metastasi ossee spontanee, con un po '4T1 carcinom mammaria osso-tropicaleun sub-cloni e MSP overexpressed PyMT modello di topo transgenico come eccezioni 5-7. Intra-tibiale di perforazione in grado di fornire le cellule tumorali fino all'osso 8-10, ma incorre anche danni e infiammazioni ai tessuti locali. Attualmente iniezione intra-cardiaca di linee di cellule di cancro al seno è stato l'approccio importante per indagare la colonizzazione ossea 11-13. Tuttavia, dopo che le cellule tumorali sono introdotti nel ventricolo sinistro solo una parte limitata giungere infine a ossa e midollo osseo, rendendo difficile tenere traccia metastasi microscopiche in modo quantificabile.
In questo studio, si stabilisce una tecnica, vale a dire l'arteria intra-iliaca (IIA) di iniezione 14, per fornire selettivamente le cellule tumorali nei tessuti degli arti posteriori, arricchendo in tal modo le cellule tumorali nel midollo e nel midollo osseo senza causare danni ai tessuti locali. A causa della specificità dell'osso, questo approccio consente anche abbastanza tempo per le cellule tumorali indolenti a colonizzare eventualmente prima della unimals soccombono ai tumori primari o metastasi in altri organi vitali. In combinazione con una varietà di altre tecniche, come l'imaging bioluminescenza, immunofluorescenza e Istomorfometria ossa, iniezione IIA è potenzialmente utile per una vasta gamma di scopi di ricerca relativi alla metastasi ossee, soprattutto per tenere traccia la progressione da cellule tumorali singole a più celle micrometastasi. In particolare, abbiamo dimostrato che l'iniezione IIA ci permette di visualizzare le interazioni tra cellule tumorali e vari tipi di cellule che circonda nel microambiente osseo.
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Protocol
Tutto il lavoro animale è stato fatto in accordo con le linee guida per la cura degli animali del Baylor College of Medicine.
1. Preparazione delle cellule
Nota: differenti linee cellulari possono essere utilizzati per l'iniezione IIA seconda scopi di ricerca. Abbiamo utilizzato linee di cellule di cancro al seno MCF7, 4T1, 4T07, MDA-MB-361, MDA-MB-231, MDA-MB-436 e la linea di cellule di cancro alla prostata C4-2 nella nostra ricerca. Usiamo tipicamente sia GFP e lucciola luciferasi cellule tumorali marcato per il nostro studio e alcuni dati qui dalla linea cellulare MCF7 GFP-luciferasi marcato.
- Mantenere cellule in DMEM contenente 10% FBS e 0,1 mg / ml di penicillina-streptomicina a 37 ° C in 5% CO 2.
- Prima dell'iniezione IIA, trypsinize le cellule a 80 - 90% confluenza con il 0,25% soluzione / EDTA tripsina. Utilizzare PBS freddo per lavare le cellule due volte, e risospendere le cellule in 10 ml di PBS per il conteggio delle cellule. Per rimuovere PBS, le cellule centrifugare a 800 xg per 5 min.
- cellule Risospenderead una concentrazione di 5 x 10 6 cellule / ml in PBS ghiacciato.
- Utilizzare 100 ml GFP e cellule tumorali luciferasi marcato Firefly per IIA iniezione di un mouse.
Nota:. Pertanto, il numero di celle ricevute da ciascun animale è 5 x 10 5 Questo numero può essere necessario modificare in base alla aggressività delle linee cellulari. - Mantenere sospensioni cellulari sul ghiaccio.
Nota: Le vibrazioni possono essere necessari per prevenire l'aggregazione delle cellule ogni pochi minuti fino a quando è pronto per l'iniezione. Per alcune linee cellulari (come MDA-MB-231), possono essere necessarie procedure più rigorose (ad esempio, di passaggio 45 micron colino cellula) per prevenire l'aggregazione. Si prega di notare che lo zoccolo dei vasi può provocare necrosi del tessuto, e quindi confondendo gli esperimenti.
2. Preparazione degli animali
- Per la gestione del dolore degli animali, dare 5 mg / kg / die carprofen (o altro analgesico) con integratore alimentare per i topi non meno di 24 ore prima dell'intervento chirurgico. Amministrareuna dose di 0,1 mg / ml di buprenorfina per via sottocutanea 60 min prima dell'intervento. Nota: una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pallet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà il crescere delle cellule ER + tumorali (ad esempio, cellule MCF-7) 9.
- Anestetizzare 4 - 6 settimane di età mouse (circa 20 g) con ketamina (80 - 100 mg / kg) e xilazina (10 -12.5 mg / ml) mediante iniezione intraperitoneale.
- Confermare il livello appropriato di sedazione di un 20 g mouse pizzico punta e l'osservazione di una riduzione del 50% della frequenza respiratoria e rosa mucose (ad esempio, la pelle dell'orecchio del mouse e la pelle della zampa). Continuare a monitorare questi segni vitali ogni 15 min durante l'intervento chirurgico. Nota: Nessun movimento dell'animale indica che l'animale è sufficientemente anestetizzati e pronto per la chirurgia.
- Utilizzare veterinario pomata sugli occhi per prevenire la secchezza.
- Shave il mouse sul basso addome, in particolare la zona inguinale destra dove l'intervento chirurgico e l'iniezione saràprendere posto.
Nota: Questo non è necessario se si utilizzano topi nudi atimici. - Mettere il mouse sul dorso, diffondere le gambe in posizione naturale e bastone le dita dei piedi per cellulare dissezione cartone con nastro adesivo.
- Pulire la zona inguinale destra con il 70% tamponi di cotone sterili etanolo isopropilico imbevuti, seguito con betadine scrub chirurgico più volte.
3. La Vena iliaca comune e Arteria posizione e Separazione
- Effettuare una incisione cutanea di 1,0 - 1,2 cm di lunghezza tra il 4 ° e 5 ° capezzoli nell'addome basso a destra con sterili, # 10 di carbonio lame di bisturi in acciaio detenute in un manico n ° 3. Quindi utilizzare un telo chirurgico sterile per coprire il corpo animale ad eccezione del sito di incisione.
- Spostare l'animale al banco di livello superiore dissezione microscopio. Utilizzare un ingrandimento di 4X per l'iniezione.
- Sotto 4X ingrandimento del microscopio dissezione, inserire una pinza separazione smussato tra il tessuto adiposo e il peritoneum, e spingere i tessuti verso l'esterno su entrambi i lati per esporre i vasi iliaci e nervi (vedi Figura 1).
Nota: L'arteria tra aorta dalla linea mediana e la parte inferiore dei rami dell'arteria è chiamata iliaca comune. È qui che l'iniezione avviene. - Utilizzare un paio di pinze sottili dritti a sfondare il tessuto connettivo (come una membrana) tra le navi e il nervo, più vicino ai vasi.
- Accendere i pinza sottile rette per la mano sinistra. Afferra un paio di pinze sottili ad angolo con la mano destra. Inserire le pinze mano destra nella stessa posizione in cui sono stati suddivisi i tessuti connettivi. E poi attaccare le pinze mano destra attraverso, sotto i vasi.
- Allo stesso tempo, inserire le pinze mano sinistra nei tessuti connettivi sul lato sinistro delle navi per guidare le pinze mano destra che passano attraverso.
- Una volta che la pinza mano destra ottiene sotto i vasi, cercare di separare le navi dal ti circondaSSUE un po 'di più, e poi tenerli in cima alle pinze mano destra.
- Utilizzare pinze mano sinistra per consegnare la punta di una sutura 4-0 di seta per le pinze mano destra, e poi tirare delicatamente e lentamente la sutura attraverso sotto i vasi. Nota: Ora entrambe vasi vena e arteria comuni sono sollevati dalla sutura (vedi Figura 2).
4. iniezione e post-iniezione di cura
- Preparare le cellule per l'iniezione in una siringa da insulina 31 G. Utilizzare 100 ml di sospensione cellulare in PBS per iniezione. Assicurati di pipetta su e giù più volte per separare le cellule ed evitare l'aggregazione in modo che le cellule iniettate non intasare e bloccare il flusso di sangue.
- Con la pinza angolata nella mano sinistra, mettere le pinze sotto i vasi lungo la guida della sutura, e quindi aprire i due bracci della pinza, avendo i vasi detenuti delicatamente sulle pinze.
Nota: L'intervallo tra i due bracci della pinza sarà l'isito njection. - Tenere il 31 ago G con 100 microlitri sospensioni cellulari nella mano destra, con la smussatura dell'ago verso l'alto, pronto per l'iniezione.
- Inserire l'ago nel lume dell'arteria (sangue entrerà la punta dell'ago). Poi spingere sospensione cellulare lentamente per iniettare le cellule. La sospensione cellulare spingerà il sangue rosso nel vaso. Cercate di non rompere i vasi o perdite sospensione cellulare fuori.
- Quando l'iniezione è terminata, tirare delicatamente indietro l'ago e tenere premuto il navi fino alle pinze mano sinistra per fermare l'emorragia. Poi tirare via la sutura.
- Sganciare la pinza della mano sinistra, e utilizzare rapidamente un batuffolo di cotone di premere l'area di incisione dell'arteria per fermare l'emorragia.
Nota: Di solito 5 - 10 min pressione continua è sufficiente per fermare l'emorragia. - Quando il sanguinamento si ferma, usare la colla pelle per chiudere i bordi pelle della zona intervento chirurgico. Fare un marchio auricolare, e verificare la presenza di bioluminescenza segnalazione per esaminare la distribuzione delle cellule iniettate. <br /> Nota: Una iniezione di successo si tradurrà in un'immagine simile alla figura 3.
- Controllare segnalazione bioluminescenza mediante iniezione di 100 microlitri 15 mg / ml luciferina in PBS a 75 mg / kg concentrazione mouse mediante il seno intra-orbitale.
- Per l'iniezione intra-orbitale, mettere le dita su entrambi i lati degli occhi del mouse, usare la pressione per fare bulbo oculare leggermente pop fuori dal telaio occhio, inserire 28 g di aghi di insulina siringa tra palla occhio e il naso, e quindi spingere lentamente la siringa per iniettare luciferina .
Nota: Nella posizione corretta, l'ago deve essere in grado di raggiungere una profondità di 2 - 3 mm prima di colpire tessuti duri (osso). - Posizionare il mouse nel sistema di imaging per l'imaging in vivo animale intero per 10-60 secondi a 5 minuti (vedi figura 3).
Nota: Una procedura opzionale è quello di impiantare estradiolo pellet nella parte posteriore degli animali per fornire estradiolo supplementare. Questo accelererà la crescita delle cellule tumorali ER + (per esempio, MCF-7celle) 15.
- Per l'iniezione intra-orbitale, mettere le dita su entrambi i lati degli occhi del mouse, usare la pressione per fare bulbo oculare leggermente pop fuori dal telaio occhio, inserire 28 g di aghi di insulina siringa tra palla occhio e il naso, e quindi spingere lentamente la siringa per iniettare luciferina .
- Controllare segnalazione bioluminescenza mediante iniezione di 100 microlitri 15 mg / ml luciferina in PBS a 75 mg / kg concentrazione mouse mediante il seno intra-orbitale.
- Lasciare il mouse su una piastra elettrica caldo fino a quando non si sveglia. Monitorare il sanguinamento, gonfiore, segni di deiscenza e dolore durante il periodo post-chirurgica. Mettere i topi torna alla gabbia con una copertura analgesica (carprofin supplemento dietetico suggerito) data per la gestione del dolore fino a quando non segni di dolore. Fate molta attenzione e cura per gli animali durante 7 giorni dopo l'intervento.
5. Monitoraggio metastatico crescita
- Istomorfometria:
- Harvest tumore cuscinetto tessuti ossei, fissare le ossa in paraformaldeide al 4% per 24 ore, poi li Decalcificare a pH 7.0 soluzione EDTA 14% per 3 - 5 giorni, e sottoporli a paraffina embedding come descritto in precedenza 14.
- Sezione tessuti ossei paraffina incorporare al spessore di 3 micron ed eseguire il metodo istologico standard ematossilina / eosina come descritto in precedenza 14.
- Immunohistochemisprovare:
- Soggetto paraffina osso cuscinetto tumore scivola di immunoistochimica colorazione per vari scopi, come descritto in precedenza 14. In breve, immunostain MCF7 cellule tumorali da anticorpi anti-GFP e cellule osteogeniche immunostain (pre-osteoblasti e osteoblasti) da anticorpi anti-Osterix e anticorpi anti-fosfatasi alcalina (ALP), rispettivamente.
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Representative Results
La figura 1 illustra la posizione anatomica e rapporto iliaca comune (rosso) e vena (blu).
La figura 2 mostra la posizione relativa dei vasi iliaci e nervi al microscopio di dissezione. Come illustrato nella Figura 2A, i vasi e nervi sono proprio sotto la parete peritoneale e possono essere rivelate dopo l'incisione cutanea è fatto e il peritoneo viene spinto via. La vena iliaca comune è sulla sinistra, ed è più grande e più scuro rispetto all'arteria. L'arteria è nel mezzo, e sembra rosa. Esso è più sottile della vena, ma ha più spessa parete muscolare. La vena e arteria sono paralleli e strettamente collegati tra loro. Più in là sulla destra è il nervo lombosacrale bianco. La figura 2B mostra vasi iliaci comuni separati dai circostanti del tessuto connettivo, muscoli e nervi, e sollevato da un 4-0 sutura di seta. Il comune vena iliaca, arterie e nervi lombosacrale sono anche indicati.
La figura 3 mostra rappresentante in vivo e ex vivo immagini bioluminescenza di animali dopo l'iniezione intra-arteria iliaca. Cinque x 10 5 cellule MCF7 GFP-luciferina-etichettato 100 ml sono stati somministrati per l'arto posteriore destro del mouse per iniezione dell'arteria intra-iliaca. D-luciferina è stato poi somministrato mediante iniezione intra-sinusale orbita, seguito dal vivo tutta l'imaging bioluminescenza animale in. Le cellule MCF7 iniettate sono stati arricchiti al lembo posteriore destro del mouse, come indicato dai segnali bioluminescenza (Figura 3A). I segnali in vivo bioluminescenza di tutta animali sono stati monitorati ogni 3 giorni o ogni settimana, e poi i tessuti ossei di topo sono state raccolte al giorno 14 dopo l'iniezione, quando l'intero segnale animale bioluminescenza ha raggiunto una certa soglia (Flux Photon> 10 4). Dopo la somministrazione di D-luciferina, i tessuti ossei da arteria intra-iliaca del mouse iniettato sono stati rapidamente raccolte e immersi in PBS per ex vivo imaging. Il segnale bioluminescenza forte dall'arteria iliaca intra-iniettato destra osso posteriore ma non dall'osso comando sinistra ha mostrato la localizzazione specifica delle cellule iniettate (Figura 3B).
La figura 4 mostra immagini rappresentative di colorazione istologica e immunofluorescenza. Quando il tumore cuscinetto ossa sono state raccolte, sono stati sottoposti a fissazione paraformaldeide, EDTA decalcificazione, quindi inclusione in paraffina. Tre micron diapositive ossei sono stati preparati e sono stati eseguiti standard di colorazione H & E. Le cellule ciottoli simile compatte con nuclei grandi erano microscopica MCF7 lesioni metastatiche nel tessuto osseo 14 giorni dopo l'iniezione dell'arteria intra-iliaca, come indicato dalle frecce rosse. Midollo osseo (BM) E le grandi piatti di colore Rosa ossa trabecolari (TB) con nuclei sparsi così etichettate (Figura 4A). Figura 4b mostra MCF7 cellule GFP-etichettata (verdi), osteoblasti ALP-etichettati (rosso nell'immagine a sinistra), e Osterix-etichettato pre-osteoblasti (rosso nell'immagine a destra) dopo immunofluorescenza colorazione. Blu colorazione DAPI indica il nucleo.
Figura 1:. Anatomia di iliaca comune (rosso) e la vena (blu) nel topo dell'aorta addominale, arteria iliaca comune, iliaca esterna, e l'arteria femorale sono mostrati come indicato. L'iniezione viene eseguita in arteria iliaca comune dall'aorta verso la direzione dell'arteria femorale. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2:. Vasi iliaci e nervi al microscopio dissezione standard 4X ingrandimento (a) immagine dei vasi intatti e nervi. (B) immagine dei vasi sollevati. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Rappresentante in vivo e ex vivo immagini bioluminescenza di topo dopo l'iniezione intra-arteria iliaca. (A) Il segnale di bioluminescenza in vivo di tutta diritti degli animali dopo l'iniezione. (B) Il segnale di vivo ex bioluminescenzadi osso di controllo di sinistra e destra osso iniettato da animali iniettati che sono state raccolte 14 giorni. Tutti i segnali bioluminescenza sono stati misurati seguendo procedure e le impostazioni consigliate dal produttore. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Immagini rappresentative della colorazione istologica e immunofluorescenza. (A) rappresentante H & E colorazione immagine di MCF7 tumore cuscinetto tessuto osseo dopo l'iniezione intra-arteria iliaca. Barra di scala = 25 micron. Nota: HE colorazione non è il modo efficace per rilevare i tumori. In ingrandimento minore, HE colorazione non è abbastanza sensibile da distinguere tumori. In alto ingrandimento, non è efficiente per la scansione di tutti i unReas. (B) immagini immunofluorescenza del tessuto osseo cuscinetto MCF7 tumorale. Verdi: MCF7 cellule GFP-etichettata, rosso nell'immagine a sinistra: osteoblasti ALP-etichettati, rosso nell'immagine a destra: Osterix-etichettati pre-osteoblasti. Blu colorazione DAPI indica il nucleo. Barra di scala = 25 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Anche se solo l'arteria iliaca è il bersaglio di iniezione per le cellule tumorali, si consiglia la separazione sia della vena iliaca e l'arteria dai tessuti circostanti, e di sollevare loro insieme come un fascio. Questo perché la vena e arteria ampiamente contatto tra loro, e la parete del vaso venoso è sottile ed è facile da rompere. Pertanto, per una iniezione di successo, fa risparmiare tempo e fatica a reggere le due navi insieme, anche se le cellule tumorali vengono iniettate solo per l'arteria. Una sutura 4-0 seta è usato per aiutare questo processo, come illustrato nella figura 2. La sutura può anche aiutare a fermare il sanguinamento se ciò dovesse accadere.
devono essere eseguite sotto il microscopio dissezione maggior parte delle fasi di iniezione IIA. I vasi del mouse sono morbidi e piccoli, il che rende le procedure impegnativo. Tuttavia, dopo una pratica sufficiente, il tasso di successo può raggiungere 90 - 100% nella nostra esperienza.
Con questa tecnica, i ricercatori possono esserebile per stabilire modelli di colonizzazione delle ossa dei loro modelli di cellule di cancro preferiti, compresi quelli tradizionalmente pensato "non metastatico". MCF-7 cellule rappresentano un esempio. In effetti, quando si arriva nel microambiente osseo, cellule MCF-7 subiscono una breve dormienza prima di decollare da colonizzare. Pochissimi metastasi ossee spontanee sono stati rilevati in animali portatori ortotopico MCF-7 xenotrapianti. Tuttavia, il fallimento potrebbe derivare dalla quantità residua di cellule tumorali disseminate, la lenta iniziazione della colonizzazione e la crescita più aggressiva di tumori ortotopico (che uccide animali prima lesioni ossee possono stabilire). Così, la mancanza di rilevamento non può essere preso come prova contro capacità MCF-7 cellule di metastasi. In realtà, micrometastasi osso indolenti o addirittura dormienti possono essere più frequenti nei pazienti con cancro al seno umano, come suggerito dalla dormienza anni da decenni che è spesso visto in clinica.
iniezione IIA può essere applicato non solo al luterminale o le cellule del cancro al seno basali, ma anche ad altri tipi di cancro, come il cancro alla prostata. In combinazione con diverse scelte di malattia delle ossa tecniche di monitoraggio, l'iniezione intra-arteria iliaca può dare un contributo significativo a molti scopi di ricerca. Usiamo comunemente segnalazione bioluminescenza per tracciare la progressione metastasi ossea dopo l'iniezione intra-arteria iliaca, e poi raccolto le ossa di tumore per lampade fluorescenti colorazione immunoistochimica di definire le interazioni tra le cellule tumorali e le circostanti nicchie microambiente osseo. Bone Istomorfometria 16-17 e 18-20 μCT può essere utilizzato per valutare le alterazioni struttura ossea e altri dettagli anatomici di osso che sono causati dalla inoculazione di cellule tumorali. Considerazioni corretta e combinazioni dovrebbero essere determinati da ciascun gruppo per il loro scopo di ricerca specifico.
Simile a intra-tibiale 8-10 e intra-cardiaca inoculazione 11-13, un avvertimento di intra-iliniezione dell'arteria IAC è che non ricapitola primi passi nel processo metastatico prima embolie e entrata di cellule tumorali in circolo. Idealmente, sarebbe necessario un processo di metastasi spontanea a partire da tumori ortotopico ricapitolare completamente la cascata metastasi. Tuttavia, questo processo è altamente inefficiente nella maggior parte dei modelli, con solo poche eccezioni, come ad esempio alcuni osso-tropico 4T1 sub-cloni 5-6 e MSP sovraespresso PyMT transgenici modello di topo 7. Ci auguriamo che l'iniezione IIA fornirà nuove intuizioni nel processo di colonizzazione delle ossa, che possono a loro volta facilitare la progettazione e lo sviluppo di modelli di metastasi ossee spontanee veramente efficienti per gli studi pre-clinici.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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