Introduction
転移は、固形腫瘍による死亡の90％以上を占めています。骨は、様々な癌の種類、特に乳癌および前立腺癌の転移によって影響を受ける最も一般的な臓器です。クリニックで診断すると、骨転移は通常、すでに多くの場合、神経学的症状を伴う、骨に溶骨性または骨芽細胞の変化のいずれかで進行した段階に入ってきました。
主に明白な溶骨性骨転移1-3に焦点を当てた以前の研究は、しかし、我々は現在、溶骨性プロセスの開始前に、骨の中に微小転移の理解が限られています。これは、少なくとも部分的には、適切な実験モデルとアプローチの欠如にあります。乳癌の遺伝子操作されたマウスモデルは、多くの場合、肺に転移するが、はるかに少ない効率的に骨4へ。同様に、同所移植された腫瘍はほとんどいくつかの骨の熱帯4T1乳腺carcinomで、自発的な骨転移を発症しませんサブクローンおよびMSPは、例外5-7としてPyMTトランスジェニックマウスモデルを過剰発現しました。イントラ脛骨掘削は骨8-10に癌細胞を提供することができますが、それはまた、局所組織への損傷および炎症を招きます。現在の乳癌細胞株の心臓内注射は、骨定着11-13を調査するための主要なアプローチとなっています。癌細胞は、左心室の中に導入された後、しかし、限られた割合は、最終的にそれが困難な定量化方法で微小転移を追跡すること、骨および骨髄に到達します。
本研究では、選択的に局所組織への損傷を引き起こすことなく、骨及び骨髄中の癌細胞を濃縮、後肢組織に癌細胞を送達するために、技術、すなわち内腸骨動脈（IIA）注入14を確立します 。なぜなら骨特異性のため、このアプローチは、無痛性癌細胞は最終的に、ANの前にコロニーを形成するのに十分な時間を可能にしますimalsは、他の重要な臓器における原発腫瘍または転移に屈します。このような生物発光イメージング、免疫蛍光染色および骨組織形態計測などの他の種々の技術と組み合わせると、IIA注入は、特にマルチセルに単一の癌細胞からの進行を追跡するために、骨転移に関連した研究目的の広い範囲のために有用である可能性があります微小転移。特に、我々はIIA注射は、癌細胞と骨微小環境における周囲のセルの様々なタイプの間の相互作用を可視化することを可能にすることを実証しました。
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Protocol
全ての動物作業はベイラー医科大学の動物のケアのガイドラインに基づいて行われました。
1.細胞の調製
注：異なる癌細胞株は、研究目的に応じIIA注入のために使用することができます。我々は、乳癌細胞株を使用しているMCF7、4T1、4T07、MDA-MB-361、MDA-MB-231、MDA-MB-436および研究における前立腺癌細胞株C4-2。我々は通常、我々の研究のために、GFPおよびホタルルシフェラーゼ標識癌細胞の両方を使用し、GFP-ルシフェラーゼ標識MCF7細胞株から、ここでいくつかのデータを示しています。
- 5％CO 2中、37℃で、10％FBSおよび0.1mg / mlのペニシリン-ストレプトマイシンを含有するDMEM中で細胞を維持します。
- 0.25％トリプシン/ EDTA溶液を用いて90％のコンフルエンス - IIA注射前に、80℃で細胞をトリプシン処理。細胞計数のために10ミリリットルのPBSで細胞を細胞を2回洗浄し、再懸濁するために冷PBSを使用してください。 5分間、800×gでPBS、遠心セルを削除します。
- 細胞を再懸濁氷冷PBS中で5×10 6細胞/ mlの濃度で。
- 1マウスのIIA注射のために100μlのGFP-およびホタルルシフェラーゼ標識癌細胞を使用してください。
注：したがって、各動物によって受信されたセルの数が5×10 5であり、この数は、細胞系の侵襲性に基づいて変更される必要があり得ます。 - 氷上で細胞懸濁液を保管してください。
注：これは、注射のために準備が整うまで、振動は、細胞凝集を数分ごとに防止するために必要とされ得ます。 （例えば、MDA-MB-231のような）いくつかの細胞株について、（ 例えば 、45μmの細胞ストレーナーを通過する）、よりストリンジェントな手順は、凝集を防止するために必要とされてもよいです。血管の詰まりが組織の壊死を引き起こし、そのための実験を混乱させる場合がありますのでご了承ください。
2.動物の準備
- 動物の疼痛管理のために、手術前にマウスに栄養補助食品に劣らず24以上時間を5ミリグラム/ kg /日のカルプロフェン（または他の鎮痛剤）を得ました。管理します手術前に0.1mg / mlのブプレノルフィン皮下に60分の線量。注：オプションの手順余分エストラジオールを提供するために、動物の背面にエストラジオールパレットを注入することです。これは、ER +癌細胞（ 例えば 、MCF-7細胞）9のグローを加速していきます。
- 腹腔内注射により - （100ミリグラム/キログラム80）とキシラジン（10 -12.5 mg / mlで）ケタミンで6週齢のマウス（約20グラム） - 4を麻酔。
- つま先のピンチと呼吸数とピンクの粘膜の50％減少（ 例えば、マウスの耳皮膚と足の皮膚）の観察による20グラムのマウスの鎮静の適切なレベルを確認してください。手術中にこれらのバイタルサイン15分毎に監視してください。注：動物のいかなる動きは、動物が十分に麻酔をかけ、手術の準備ができていることを示しています。
- 乾燥を防ぐために、目に獣医軟膏を使用してください。
- 下腹部、特に右鼠径部ここで手術や注射が意志の上でマウスを剃ります場所を取ります。
注：無胸腺ヌードマウスを使用している場合、これは不要です。 - 、その背中の上でマウスを置く彼らの自然な位置に足を広げ、テープ付き携帯解剖段ボールにつま先を貼り付けます。
- 70％イソプロピルエタノールに浸した滅菌綿棒で右鼠径部を拭き、ベタジン外科手術用スクラブで数回続きます。
3.総腸骨静脈と動脈の場所と分離
- 長い4 番目と第3ハンドルで開催された無菌の、＃10炭素鋼メスの刃を使用して、右下腹部にある5 番目の乳首は1.2センチメートル- 1.0の皮膚切開を行います。その後、切開部位を除いて動物の体をカバーするために、滅菌外科用ドレープを使用します。
- 標準ベンチトップ解剖顕微鏡に動物を移動します。注射のために4倍の倍率を使用してください。
- 解剖顕微鏡の4倍の倍率下では、脂肪組織とperitoneu間の鈍分離鉗子を挿入mおよび腸骨血管および神経を露出させるために両側に外側の組織を押し（ 図1参照 ）。
注：正中動脈枝の下部から大動脈の間の動脈は総腸骨動脈と呼ばれています。注入が行われる場所です。 - 船に近い血管と神経の間（膜のような）結合組織、突破するためにストレートの微細鉗子のペアを1つ使用します。
- 左手にまっすぐ細かい鉗子を切り替えます。右手を使用して、角度の付いた微細な鉗子のペアをつかみます。結合組織が破壊されたのと同じ位置に右手の鉗子を挿入します。そして船の下を通って右側の鉗子を貼り付けます。
- 同時に、通過して右手の鉗子を導くために船の左側の結合組織に左手の鉗子を挿入します。
- 右側の鉗子が船の下に到達したら、周囲のTIから血管を分離しようもう少しssue、その後、右側の鉗子の上にそれらを保ちます。
- 右側の鉗子に4-0絹縫合糸の先端を提供するために左側の鉗子を使用し、その後、船の下を通って静かに、ゆっくりと縫合糸を引っ張ります。注意：今の両方の共通の静脈と動脈血管が縫合糸によって持ち上げられ（ 図2を参照）。
4.インジェクションとポスト噴射ケア
- 31 Gインスリン注射器で注入のための細胞を準備します。注射あたりPBSに100μlの細胞懸濁液を使用してください。注入された細胞は、血液の流れを詰まらせ、ブロックしないように、細胞を分離し、凝集を避けるために、上下に数回をピペットとすることを確認します。
- 左手に角度のついたピンセットで、縫合糸の指導に沿って船の下に鉗子を入れ、その後、鉗子の2つのアームを開き、鉗子を軽く開催された血管を持ちます。
注：鉗子の2つのアーム間の間隔がiになりますnjectionサイト。 - 注射の準備ができて、上向きの針のベベルと、右手に100μlの細胞懸濁液と31 G針を保持します。
- （血液が針の先端を入力します）動脈内腔に針を挿入します。次に、細胞を注入することで、ゆっくりと細胞懸濁液を押してください。細胞懸濁液を容器に赤血球を離れてプッシュします。血管を壊したり、細胞懸濁液を漏れ出ないようにしてください。
- 注入が完了すると、そっと針を引き戻すと、出血を止めるために、左側の鉗子で船を保持し続けます。その後、縫合糸を引き離します。
- 左側の鉗子を引き離し、かつ迅速に出血を止めるために動脈切開領域を押して綿棒を使用しています。
注：通常5から10分間連続的圧力は、出血を止めるのに十分です。 - 停止し、出血すると、手術領域の皮膚のエッジを閉じるには、皮膚の接着剤を使用しています。耳タグを作成し、注入された細胞の分布を調べるために、シグナリング生物発光を確認してください。<BR />注：成功した注射は、 図3に類似した画像になります。
- イントラ眼窩洞経由して75ミリグラム/ kgのマウスの濃度でPBS中100μlの15 mg / mlとルシフェリンの注射により生物発光シグナルを確認してください。
- イントラ眼窩注射のために、マウスの目の両側に指を入れて眼球が若干、目のフレームから飛び出し眼球と鼻の間に28 Gインスリン注射針を挿入し、ゆっくりとルシフェリンを注入する注射器をプッシュするために圧力を使用。
注： - 硬組織（骨）を押す前に、3ミリメートル正しい位置で、針は2の深さに到達することができるはずです。 - （ 図3参照 ） を 5分以内に60秒- 10ためのインビボ動物全体のイメージング用のイメージング・システムにマウスを置きます。
注：オプションの手順余分エストラジオールを提供するために、動物の背面にエストラジオールペレットを移植することです。これは、ER +癌細胞（ 例えば 、MCF-7の成長を加速します細胞）15。
- イントラ眼窩注射のために、マウスの目の両側に指を入れて眼球が若干、目のフレームから飛び出し眼球と鼻の間に28 Gインスリン注射針を挿入し、ゆっくりとルシフェリンを注入する注射器をプッシュするために圧力を使用。
- イントラ眼窩洞経由して75ミリグラム/ kgのマウスの濃度でPBS中100μlの15 mg / mlとルシフェリンの注射により生物発光シグナルを確認してください。
- それが目覚めるまで暖かい加熱パッド上でマウスを残します。 、手術後の期間中の裂開や痛みの兆候を腫れ、出血を監視します。痛みの兆候まで、疼痛管理のために与えられた鎮痛カバレッジ（carprofin栄養補助食品が提案）とのケージに戻ってマウスを置きます。手術後7日の間、動物に細心の注意とケアを払ってください。
5.監視転移成長
- 組織形態計測：
- 5日目、および以前14に記載されているようにパラフィン包埋それらを施す-収穫腫瘍はその後3 pH7.0の14％EDTA溶液でそれらを脱灰、24時間、4％パラホルムアルデヒド中で骨を固定する、骨組織を有します。
- セクションパラフィン埋め込む骨3μmの厚さで組織し、以前に14を説明したようにヘマトキシリン/エオシン染色の標準的な組織学的方法を実行します。
- Immunohistochemis試してみてください。
- 被験者パラフィン包埋腫瘍担持骨は、先14に記載されているように様々な目的のために染色免疫組織化学するスライド。簡潔には、それぞれ、抗オステリックス抗体および抗アルカリホスファターゼ（ALP）抗体によるMCF7癌、抗GFP抗体による細胞、および免疫染色骨形成細胞（前骨芽細胞および骨芽細胞）免疫染色。
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Representative Results
図1は、解剖学的位置及び総腸骨動脈（赤）および静脈（青）の関係を示す図です。
図2は、解剖顕微鏡下で腸骨血管や神経の相対的な位置を示しています。 図2Aに示されているように、血管と神経が腹腔壁の下に右であり、皮膚切開がなされ、腹膜が押しのけた後に明らかにすることができます。総腸骨静脈は左にあり、動脈に比べて大きく、暗いです。動脈が真ん中にあり、ピンク色に見えます。これは、静脈よりも薄いが、厚い筋肉壁を有しています。静脈と動脈が平行と密接に相互に接続されています。遠く右には白腰仙神経である。 図2Bは 、4-によって周囲の結合組織、筋肉や神経から分離し、持ち上げ総腸骨血管を示しています0絹縫合糸。総腸骨静脈、動脈、および腰仙神経も示されています。
図3は、イントラ腸骨動脈注射後の生体内や動物のex vivo生物発光画像内の代表を示しています。 100μl中ファイブ×10 5 GFP-ルシフェリン標識MCF7細胞は、内腸骨動脈注射によるマウスの右後肢に投与しました。 D-ルシフェリンは、その後、in vivoでの動物全体の生物発光イメージングに続いて、イントラ軌道洞注射によって投与しました。生物発光信号（ 図3A）によって示されるように注入されたMCF7細胞を、マウスの右後肢で濃縮しました。動物全体のin vivo生物発光シグナルは、3日ごとまたは毎週を追跡し、全動物の生物発光信号が特定のしきい値に達したとき、マウスの骨組織は、（14日目注射後に回収しました光子束> 10 4）。 D-ルシフェリン投与後、内腸骨動脈注射したマウスからの骨組織を迅速に回収し、ex vivoでのイメージングのためにPBS中に浸漬しました。内腸骨動脈からの強い生物発光シグナルは、右後肢の骨を注入ではなく、左制御骨から注入された細胞（ 図3B）の特定の局在を示しました。
図4は、組織学的および免疫染色の代表的な画像を示しています。骨を有する腫瘍を採取した時、それらはパラホルムアルデヒド固定、EDTAの脱灰し、次いでパラフィン包埋を行いました。三ミクロン骨スライドを調製し、標準的なH＆E染色を行いました。赤い矢印で示すように大きな核を有するコンパクトな丸石様細胞は、14日内腸骨動脈注射後の骨組織における微小MCF7転移病変でした。骨髄（BM）と疎な核を有する大規模なピンクのフラット小柱骨（TB）はそのように（ 図4A）標識されている。 図4Bは、GFP標識MCF7細胞（緑）、ALP標識骨芽細胞（左画像の赤い）を示しており、オステリックス標識前骨芽細胞（右の画像の赤い）免疫蛍光染色した後。ブルーDAPI染色は核を示しています。
図1：示されているように、マウスにおける総腸骨動脈（赤）と静脈（青）の解剖腹部大動脈、総腸骨動脈、外腸骨動脈、および大腿動脈が示されています。注射は、大腿動脈の方向に向かって大動脈から総腸骨動脈で行われている。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：4倍の倍率で、標準的な解剖顕微鏡下での腸骨血管や神経 （a）は 、無傷の血管や神経のイメージ。 （b）に持ち上げられた船のイメージ。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： マウスの 代表的 な in vivo および ex vivoの 生物発光画像内腸骨動脈注射後。 （a）は、注入後の全動物の権利のin vivo生物発光信号。 （b）は、ex vivoで生物発光信号左制御骨と14日後に採取した注射した動物から右に注入骨の。すべての生物発光シグナルは、メーカーの推奨する手順と設定を追跡することによって測定した。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図4： 組織学的および免疫染色の代表的な画像 。 （a）は内腸骨動脈内注射後の骨組織を有するMCF7腫瘍の代表的なH＆E染色の画像を表示します。 =25μmのスケールバー。注：HE染色が腫瘍を検出するための効果的な方法ではありません。低倍率では、HE染色では腫瘍を区別するのに十分な感度ではありません。高倍率では、全てのAスキャンすることは効率的ではありませんREAS。 （b）は、骨組織を有するMCF7腫瘍の免疫染色画像を。緑：GFP標識MCF7細胞、左画像内の赤：ALP標識骨芽細胞、レッド、右の画像で：オステ標識前骨芽細胞。ブルーDAPI染色は核を示しています。スケールバー=25μmで。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
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Discussion
唯一の腸骨動脈は、癌細胞に注入の対象ではありますが、私たちは、周囲の組織からの両方の腸骨静脈と動脈の分離をお勧めします、とのバンドルとして一緒にそれらを持ち上げるために。静脈と動脈が広く互いに接触するためである、と静脈血管壁が薄く、壊れやすいです。がん細胞のみを動脈に注入されているがため、成功した注射のために、それは、一緒に2つの容器を保持するために時間と労力を節約できます。 4-0絹縫合糸を、 図2に示すように、このプロセスを支援するために使用される。縫合糸はまた、発生した止血を助けることができます。
IIA注入のほとんどのステップは、解剖顕微鏡下で実行される必要があります。マウスの血管は手続きがやりがいになりますどの、柔らかくて小さいです。我々の経験では100％ - しかし、十分な練習の後、成功率は90に到達することができます。
この技術では、研究者であってもよいです伝統的に「非転移性」と思ったものを含めて自分の好きな癌細胞モデルの骨のコロニー形成モデルを確立するBLE。 MCF-7細胞は、このような例を表します。骨の微小環境に到着したときに実際に、MCF-7細胞はコロニーを形成するために離陸前に短い休眠を受けます。非常に少数の自発的な骨転移は、同所MCF-7異種移植片を保有する動物で検出されています。しかし、失敗はよく播種性腫瘍細胞の残量、植民地化の遅い開始、および（骨病変が確立する前に、動物を殺す）同所性腫瘍のより積極的な成長に起因する可能性があります。このように、検出の欠如が転移するMCF-7細胞の能力に不利な証拠として採用することはできません。実際には、偶数無痛または休止状態の骨の微小転移は、多くの場合、臨床で見られる年対十休眠によって示唆されるように、ヒト乳癌患者においてより一般的であってもよいです。
IIA注射だけでなく、LUに適用することができますミナルまたは基底乳癌細胞だけでなく、前立腺癌などの他の癌タイプに。技術監視骨疾患の異なる選択肢と組み合わせると、イントラ腸骨動脈注入は、多くの研究目的に多大な貢献をすることができます。我々は、一般的に、イントラ腸骨動脈注射後の骨転移の進行を追跡するために生物発光シグナルを使用してから、蛍光免疫組織化学染色のため収穫担癌骨は、癌細胞と周囲の骨の微小環境のニッチの間の相互作用を定義します。骨組織形態計測16-17およびμCT18-20は、癌細胞の接種によって引き起こされる骨構造の変化と骨の他の解剖学的詳細を評価するために使用することができます。適切な考慮事項との組み合わせは、お客様の特定の研究目的のために、各グループによって決定されるべきです。
イントラ脛骨8-10と心臓内接種11月13日 、イントライルの警告と同様にIAC動脈注入は、前の塞栓症および循環への腫瘍細胞の侵入と転移過程の初期段階を再現しないことです。理想的には、同所性腫瘍から始まる自然転移のプロセスは完全に転移カスケードを再現するために必要とされるであろう。しかし、このプロセスは、いくつかの骨指向性4T1サブクローン5-6とMSPはPyMTトランスジェニックマウスモデル7を過剰発現としてのみ少数の例外を除いて、ほとんどのモデルで非常に非効率的です。私たちは、IIA注入が順番に前臨床試験のために真に効率的な自発的な骨転移モデルの設計と開発を容易にすることができる骨の植民地化のプロセスに新たな洞察を提供します願っています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
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