Introduction
मेटास्टेसिस ठोस ट्यूमर की वजह से होने वाली मौतों के 90% से अधिक के लिए खाते। अस्थि सबसे आम अंग विभिन्न प्रकार के कैंसर, विशेष रूप से स्तन और प्रोस्टेट कैंसर के मेटास्टेसिस से प्रभावित है। जब क्लिनिक में निदान, हड्डी मेटास्टेसिस आमतौर पर पहले से ही उन्नत चरणों हड्डी में या तो osteolytic या osteoblastic परिवर्तन, अक्सर स्नायविक लक्षण के साथ साथ के साथ प्रवेश किया है।
पिछले अध्ययनों में मुख्य रूप से, प्रकट osteolytic हड्डी मेटास्टेसिस 1-3 पर ध्यान केंद्रित हालांकि हम वर्तमान में हड्डियों में micrometastases की समझ सीमित है osteolytic प्रक्रिया की शुरुआत से पहले। यह कम से कम आंशिक रूप से उचित प्रयोगात्मक मॉडल और दृष्टिकोण की कमी के कारण है। स्तन कैंसर के अनुवांशिक इंजीनियर माउस मॉडल अक्सर फेफड़ों के लिए metastasize, लेकिन बहुत हड्डियों से 4 कुशलता से कम है। इसी तरह, orthotopically प्रत्यारोपित ट्यूमर शायद ही कभी सहज हड्डी मेटास्टेसिस, कुछ अस्थि-उष्णकटिबंधीय 4T1 स्तन carcinom के साथ विकसितएक उप क्लोन और एमएसपी अपवाद के रूप में 5-7 PyMT ट्रांसजेनिक माउस मॉडल overexpressed। इंट्रा-tibial ड्रिलिंग हड्डी 8-10 के लिए कैंसर की कोशिकाओं को वितरित कर सकते हैं, लेकिन यह भी स्थानीय ऊतकों को नुकसान और सूजन incurs। वर्तमान में स्तन कैंसर कोशिका लाइनों का इंट्रा-हृदय इंजेक्शन प्रमुख दृष्टिकोण हड्डी बसाना 11-13 जांच करने के लिए किया गया है। हालांकि, के बाद कैंसर की कोशिकाओं को बाएं वेंट्रिकल में पेश कर रहे हैं केवल एक सीमित अनुपात अंत में हड्डी और अस्थि मज्जा तक पहुंच जाएगा, यह मुश्किल एक quantifiable फैशन में सूक्ष्म मेटास्टेसिस ट्रैक करने के लिए कर रही है।
इस अध्ययन में, हम एक तकनीक है, अर्थात् इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी (आईआईए) इंजेक्शन 14 की स्थापना, चुनिंदा हिंद अंग के ऊतकों में कैंसर की कोशिकाओं को वितरित करने के लिए जिससे स्थानीय ऊतकों को नुकसान के कारण के बिना हड्डी और अस्थि मज्जा में कैंसर की कोशिकाओं को समृद्ध। हड्डी विशिष्टता की वजह से, यह दृष्टिकोण भी अकर्मण्य कैंसर की कोशिकाओं के लिए पर्याप्त समय से पहले अंततः एक उपनिवेश स्थापित करने की अनुमति देता हैimals प्राथमिक ट्यूमर या अन्य महत्वपूर्ण अंगों में मेटास्टेसिस का शिकार। जब इस तरह के bioluminescence इमेजिंग, immunofluorescence धुंधला और हड्डी histomorphometry के रूप में अन्य तकनीकों की एक किस्म के साथ संयुक्त, आईआईए इंजेक्शन हड्डी मेटास्टेसिस से संबंधित अनुसंधान प्रयोजनों के एक व्यापक गुंजाइश के लिए संभावित रूप से उपयोगी है, खासकर बहु-सेल के लिए एक कैंसर की कोशिकाओं से प्रगति ट्रैक करने के लिए micrometastases। विशेष रूप से, हम दिखा दिया कि आईआईए इंजेक्शन कैंसर की कोशिकाओं और हड्डी microenvironment में कोशिकाओं के आसपास के विभिन्न प्रकार के बीच बातचीत कल्पना करने के लिए सक्षम बनाता है।
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Protocol
सभी जानवर काम चिकित्सा के Baylor कॉलेज के जानवरों की देखभाल के दिशा-निर्देशों के अनुसार किया गया था।
1. सेल तैयार
नोट: विभिन्न कैंसर कोशिका लाइनों आईआईए इंजेक्शन अनुसंधान प्रयोजनों के आधार पर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। हम स्तन कैंसर कोशिका लाइनों का इस्तेमाल किया है MCF7, 4T1, 4T07, एमडीए MB-361, एमडीए MB-231, एमडीए MB-436 और हमारे शोध में प्रोस्टेट कैंसर कोशिका लाइन c4-2। हम आम तौर पर हमारे अध्ययन के लिए दोनों GFP- और जुगनू luciferase लेबल कैंसर की कोशिकाओं का उपयोग करें और यहां GFP-luciferase लेबल MCF7 सेल लाइन से कुछ डेटा दिखाने के लिए।
- 5% सीओ 2 में 37 डिग्री सेल्सियस पर 10% FBS और 0.1 मिलीग्राम / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन युक्त DMEM में कोशिकाओं को बनाए रखें।
- 0.25% trypsin / EDTA समाधान के साथ 90% संगम - आईआईए इंजेक्शन से पहले, 80 पर कोशिकाओं trypsinize। सेल गिनती के लिए 10 मिलीलीटर पीबीएस में कोशिकाओं को दो बार धोने के लिए, और फिर से निलंबित कोशिकाओं ठंड पीबीएस का प्रयोग करें। 5 मिनट के लिए 800 XG पर पीबीएस, अपकेंद्रित्र कोशिकाओं को हटाने के लिए।
- फिर से निलंबित कोशिकाओंठंडा पीबीएस में 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं / एमएल की एकाग्रता में।
- 100 μl GFP- और एक माउस की आईआईए इंजेक्शन के लिए जुगनू luciferase लेबल कैंसर की कोशिकाओं का प्रयोग करें।
नोट:। इसलिए, प्रत्येक जानवर द्वारा प्राप्त कोशिकाओं की संख्या 5 एक्स 10 5 यह संख्या सेल लाइनों की आक्रामकता पर आधारित बदले जाने की जरूरत हो सकती है। - बर्फ पर सेल निलंबन रखें।
नोट: कंपन सेल एकत्रीकरण हर कुछ मिनट रोकने के लिए जब तक यह इंजेक्शन के लिए तैयार है की जरूरत हो सकती है। (जैसे एमडीए MB-231) के रूप में कुछ सेल लाइनों के लिए, और अधिक कठोर प्रक्रियाओं (जैसे, 45 माइक्रोन सेल झरनी के माध्यम से गुजर) एकत्रीकरण को रोकने की जरूरत हो सकती है। कृपया ध्यान दें कि जहाजों की रोकना ऊतक परिगलन का कारण हो सकता है, और इसलिए प्रयोगों confounding।
2. पशु तैयारी
- जानवर दर्द प्रबंधन के लिए, सर्जरी से पहले कोई कम से कम 24 घंटा के चूहों को पूरक आहार के साथ 5 मिलीग्राम / किग्रा / दिन Carprofen (या अन्य एनाल्जेसिक) दे। प्रशासन0.1 मिलीग्राम / एमएल buprenorphine subcutaneously 60 मिनट सर्जरी से पहले की एक खुराक। नोट: एक वैकल्पिक प्रक्रिया जानवरों के पीछे में एस्ट्राडियोल फूस प्रत्यारोपण करने के लिए अतिरिक्त एस्ट्राडियोल प्रदान करना है। इस ईआर + कैंसर कोशिकाओं के बढ़ने (जैसे, MCF 7 कोशिकाओं) 9 को गति देगा।
- 6 सप्ताह पुरानी माउस (लगभग 20 ग्राम) ketamine के साथ - intraperitoneal इंजेक्शन द्वारा (80 - 100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 -12.5 मिलीग्राम / एमएल) एक 4 anesthetize।
- पैर की अंगुली चुटकी द्वारा एक 20 ग्राम माउस और श्वसन दर में 50% की कमी के अवलोकन के बेहोश करने की क्रिया के उचित स्तर की पुष्टि और श्लेष्मा झिल्ली गुलाबी (जैसे, माउस कान त्वचा और पंजा त्वचा)। सर्जरी के दौरान इन महत्वपूर्ण संकेत हर 15 मिनट की निगरानी रखें। नोट: पशु की कोई आंदोलन को इंगित करता है कि पशु पर्याप्त anesthetized और सर्जरी के लिए तैयार है।
- सूखापन को रोकने के लिए आंखों पर पशु चिकित्सक मरहम का प्रयोग करें।
- पेट के निचले हिस्से पर माउस दाढ़ी, विशेष रूप से सही कमर क्षेत्र है जहां सर्जरी और इंजेक्शन होगाजगह लें।
नोट: यह आवश्यक हो तो athymic नग्न चूहों का इस्तेमाल कर रहे हैं नहीं है। - अपनी पीठ पर माउस रखो, उनके प्राकृतिक स्थिति में पैर फैलाने और टेप के साथ मोबाइल विच्छेदन गत्ता करने के लिए पैर की उंगलियों चिपके रहते हैं।
- 70% isopropyl इथेनॉल लथपथ बाँझ कपास swabs के साथ सही कमर क्षेत्र को साफ कर लें, betadine शल्य साफ़ कई बार साथ पीछा किया।
3. आम श्रोणिफलक नस और धमनी स्थान और पृथक्करण
- लंबे समय तक 4 वें और एक नंबर 3 के हैंडल में आयोजित बाँझ, # 10 कार्बन स्टील स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर निचले सही पेट में 5 वें निपल्स के बीच 1.2 सेमी - 1.0 की एक त्वचा चीरा। तब चीरा साइट को छोड़कर पशु शरीर को कवर करने के लिए एक बाँझ सर्जिकल कपड़ा का उपयोग करें।
- मानक बेंच शीर्ष विच्छेदन खुर्दबीन के लिए पशु ले जाएँ। इंजेक्शन के लिए 4X के एक बढ़ाई प्रयोग करें।
- विच्छेदन माइक्रोस्कोप के 4X बढ़ाई के तहत, वसा ऊतकों और peritoneu के बीच कुंद जुदाई संदंश डालनेमी, और ऊतकों के बाहर दोनों पक्षों पर धक्का श्रोणिफलक वाहिकाओं और नसों (चित्रा 1 देखें) बेनकाब करने के लिए।
नोट: धमनी शाखाओं के निचले हिस्से midline से महाधमनी और बीच धमनी आम श्रोणिफलक धमनी कहा जाता है। यह जहां इंजेक्शन जगह लेता है। - , बर्तन और तंत्रिका के बीच संयोजी ऊतक (एक झिल्ली की तरह) के माध्यम से तोड़ने के लिए जहाजों के करीब सीधे ठीक संदंश की एक जोड़ी का उपयोग करें।
- बाएं हाथ के लिए सीधे ठीक संदंश स्विच। कोणीय ठीक दाहिने हाथ का उपयोग संदंश की एक जोड़ी को पकड़ो। एक ही स्थिति है, जहां संयोजी ऊतक टूट गया है में दाहिने हाथ संदंश डालें। और फिर के माध्यम दाहिने हाथ संदंश छड़ी, जहाजों के नीचे।
- इसी समय, जहाजों के बाईं ओर संयोजी ऊतक में बाएं हाथ संदंश डालने के माध्यम से जा दाहिने हाथ संदंश मार्गदर्शन करने के लिए।
- एक बार दाहिने हाथ संदंश जहाजों के नीचे हो जाता है, आसपास के तिवारी से जहाजों को अलग करने की कोशिशएक छोटा सा और ssue, और फिर उन्हें दाहिने हाथ संदंश के शीर्ष पर रहते हैं।
- दाहिने हाथ संदंश को 4-0 रेशम सीवन की नोक वितरित करने के लिए बाएं हाथ संदंश का प्रयोग करें, और तब जहाजों के नीचे के माध्यम से और धीरे धीरे सिवनी खींच। नोट: अब दोनों आम नस और धमनी वाहिकाओं सिवनी से ऊपर उठा लिया जाता है (देखें चित्र 2)।
4. इंजेक्शन और बाद इंजेक्शन की देखभाल
- एक 31 जी इंसुलिन सिरिंज में इंजेक्शन के लिए कोशिकाओं को तैयार। इंजेक्शन प्रति पीबीएस में सेल निलंबन के 100 μl का प्रयोग करें। कई बार नीचे कोशिकाओं को अलग किया और एकत्रीकरण से बचने के लिए इतना है कि इंजेक्शन कोशिकाओं रोकना नहीं होगा और रक्त प्रवाह को ब्लॉक विंदुक ऊपर और सुनिश्चित करें।
- बाएं हाथ में कोणीय संदंश के साथ, सिवनी के मार्गदर्शन के साथ जहाजों के नीचे संदंश डाल दिया, और फिर संदंश के दो हथियार खोलने, संदंश पर धीरे आयोजित वाहिकाओं कर रही है।
नोट: संदंश के दो हथियार के बीच अंतराल रहा हो जाएगाnjection साइट। - दाहिने हाथ में 100 μl सेल निलंबन के साथ 31 जी सुई पकड़ो, ऊपर की ओर सुई के उठाव के साथ, इंजेक्शन के लिए तैयार है।
- धमनी लुमेन में सुई डालें (रक्त सुई टिप में प्रवेश करेंगे)। तब कोशिकाओं इंजेक्षन करने के लिए धीरे-धीरे में सेल निलंबन धक्का। सेल निलंबन के बर्तन में लाल रक्त दूर धक्का होगा। जहाजों को तोड़ने या सेल निलंबन बाहर लीक नहीं की कोशिश करें।
- जब इंजेक्शन समाप्त हो गया है, धीरे सुई वापस खींचने के लिए और बाएं हाथ संदंश पर जहाजों को पकड़े रक्तस्राव को रोकने के लिए रहते हैं। फिर सिवनी दूर खींच।
- दूर बाएं हाथ संदंश खींचो, और जल्दी से धमनी चीरा क्षेत्र प्रेस करने के लिए रक्तस्राव को रोकने के लिए एक कपास झाड़ू का उपयोग करें।
नोट: आमतौर पर 5 - 10 मिनट निरंतर दबाव रक्तस्राव को रोकने के लिए पर्याप्त है। - जब बंद हो जाता है खून बह रहा है, शल्य चिकित्सा के क्षेत्र की त्वचा के किनारों को बंद करने के लिए त्वचा गोंद का उपयोग करें। एक कान-टैग करें, और bioluminescence इंजेक्शन कोशिकाओं के वितरण की जांच करने के संकेत के लिए जाँच करें। <br /> नोट: एक सफल इंजेक्शन समान एक छवि में परिणाम 3 चित्रा को होगा।
- 75 मिलीग्राम / इंट्रा-कक्षीय साइनस के माध्यम किलो माउस एकाग्रता में 100 μl 15 मिलीग्राम पीबीएस में / एमएल luciferin के इंजेक्शन से bioluminescence सिगनल की जाँच करें।
- इंट्रा-कक्षीय इंजेक्शन के लिए, माउस आंख के दोनों किनारों पर उंगलियां डाल आंख गेंद थोड़ा आंख फ्रेम से बाहर पॉप, आंख और नाक गेंद के बीच 28 जी इंसुलिन सिरिंज सुई डालें, और फिर धीरे धीरे luciferin इंजेक्षन करने के लिए सिरिंज धक्का बनाने के लिए दबाव का उपयोग ।
नोट: सही स्थिति में सुई 2 की गहराई तक पहुंचने के लिए सक्षम होना चाहिए - हार्ड ऊतक (हड्डी) से टकराने से पहले 3 मिमी। - 10 के लिए इन विवो पूरे पशु इमेजिंग के लिए इमेजिंग प्रणाली में माउस प्लेस - 5 मिनट के भीतर 60 सेकंड (चित्रा 3 देखें)।
नोट: एक वैकल्पिक प्रक्रिया जानवरों की पीठ में गोली एस्ट्राडियोल प्रत्यारोपण करने के लिए अतिरिक्त एस्ट्राडियोल प्रदान करना है। इस ईआर + कैंसर कोशिकाओं के विकास (जैसे, MCF 7 को गति देगाकोशिकाओं) 15।
- इंट्रा-कक्षीय इंजेक्शन के लिए, माउस आंख के दोनों किनारों पर उंगलियां डाल आंख गेंद थोड़ा आंख फ्रेम से बाहर पॉप, आंख और नाक गेंद के बीच 28 जी इंसुलिन सिरिंज सुई डालें, और फिर धीरे धीरे luciferin इंजेक्षन करने के लिए सिरिंज धक्का बनाने के लिए दबाव का उपयोग ।
- 75 मिलीग्राम / इंट्रा-कक्षीय साइनस के माध्यम किलो माउस एकाग्रता में 100 μl 15 मिलीग्राम पीबीएस में / एमएल luciferin के इंजेक्शन से bioluminescence सिगनल की जाँच करें।
- एक गर्म हीटिंग पैड पर माउस छोड़ दें जब तक यह उठता है। खून बह रहा है मॉनिटर, सूजन, शल्य चिकित्सा के बाद की अवधि के दौरान स्फुटन और दर्द के लक्षण। चूहों एनाल्जेसिक कवरेज (carprofin आहार अनुपूरक सुझाव) दर्द का कोई संकेत नहीं है जब तक दर्द प्रबंधन के लिए दिया साथ पिंजरे में वापस डाल दिया। सर्जरी के बाद 7 दिनों के दौरान पशुओं के लिए करीब ध्यान और देखभाल भुगतान करते हैं।
5. निगरानी Metastatic विकास
- Histomorphometry:
- हार्वेस्ट ट्यूमर असर हड्डी के ऊतकों, 24 घंटे के लिए 4% paraformaldehyde में हड्डियों को ठीक तो पीएच में उन्हें 3 के लिए 7.0 14% EDTA समाधान decalcify - 5 दिन, और जैसा कि पहले embedding 14 में वर्णित आयल करने के लिए उन्हें विषय।
- धारा 3 माइक्रोन की मोटाई पर आयल एम्बेड हड्डी के ऊतकों और के रूप में पहले 14 में वर्णित Hematoxylin / Eosin धुंधला की मानक ऊतकीय विधि प्रदर्शन करते हैं।
- Immunohistochemisकोशिश करो:
- विषय आयल एम्बेडेड ट्यूमर असर हड्डी के रूप में पहले 14 में वर्णित विभिन्न प्रयोजनों के लिए धुंधला हो immunohistochemistry के लिए स्लाइड। संक्षेप में, विरोधी GFP एंटीबॉडी, और immunostain osteogenic कोशिकाओं (पूर्व अस्थिकोरक और अस्थिकोरक) विरोधी Osterix एंटीबॉडी और विरोधी alkaline फॉस्फेट (एएलपी) एंटीबॉडी, क्रमशः द्वारा MCF7 कैंसर की कोशिकाओं को immunostain।
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Representative Results
चित्रा 1 संरचनात्मक स्थान और आम श्रोणिफलक धमनी (लाल) और नस (नीला) के रिश्ते को दिखाता है।
चित्रा 2 विच्छेदन माइक्रोस्कोपी के तहत श्रोणिफलक वाहिकाओं और नसों के रिश्तेदार की स्थिति से पता चलता है। जैसा कि चित्र में दिखाया गया 2A, वाहिकाओं और नसों पेरिटोनियल दीवार के नीचे सही कर रहे हैं और बाद त्वचा चीरा किया जाता है और पेरिटोनियम दूर धकेल दिया जाता है पता चला जा सकता है। आम श्रोणिफलक नस पर छोड़ दिया है, और धमनी की तुलना में बड़ा और गहरा है। धमनी बीच में है, और गुलाबी लग रहा है। यह नस की तुलना में पतली है, लेकिन मोटा मांसपेशियों की दीवार है। नस और धमनी समानांतर और बारीकी से एक-दूसरे के साथ जुड़े हुए हैं। सही पर आगे सफेद lumbosacral तंत्रिका है। चित्रा 2B आम श्रोणिफलक वाहिकाओं के आसपास संयोजी ऊतक, मांसपेशियों और नसों से अलग कर दिया, और एक 4 से ऊपर उठा लिया चलता0 रेशम सीवन। आम श्रोणिफलक नस, धमनी, और lumbosacral तंत्रिका भी संकेत कर रहे हैं।
चित्रा 3 इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन के बाद विवो और जानवरों के पूर्व vivo bioluminescence छवियों में प्रतिनिधि से पता चलता है। पांच x 10 5 GFP-luciferin लेबल 100 μl में MCF7 कोशिकाओं इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन द्वारा माउस का सही हिंद अंग को प्रशासित रहे थे। डी luciferin तो इंट्रा-कक्षा साइनस इंजेक्शन द्वारा प्रशासित किया गया था, इन विवो पूरे जानवर bioluminescence इमेजिंग द्वारा पीछा किया। के रूप में bioluminescence संकेतों (चित्रा 3 ए) ने संकेत दिया इंजेक्शन MCF7 कोशिकाओं माउस का सही हिंद अंग में समृद्ध थे। इन विवो पूरे जानवरों की bioluminescence संकेतों हर 3 दिन या हर हफ्ते ट्रैक किए गए थे, और फिर माउस अस्थि ऊतकों (14 दिन बाद इंजेक्शन पर काटा गया जब पूरे जानवर bioluminescence संकेत एक निश्चित सीमा तक पहुँचफोटॉन प्रवाह> 10 4)। डी luciferin प्रशासन के बाद, इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन माउस से हड्डी के ऊतकों जल्दी से काटा और पूर्व vivo इमेजिंग के लिए पीबीएस में डूबे हुए थे। इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी से मजबूत bioluminescence संकेत सही हिंद हड्डी इंजेक्शन लेकिन बाएं नियंत्रण हड्डी से नहीं इंजेक्शन कोशिकाओं (चित्रा 3 बी) के विशिष्ट स्थानीयकरण दिखाया।
चित्रा 4 ऊतकीय और immunofluorescent धुंधला के प्रतिनिधि छवियों से पता चलता। जब ट्यूमर असर हड्डियों काटा गया है, वे paraformaldehyde निर्धारण, EDTA विकैल्सीकरण, और फिर आयल एम्बेडिंग के अधीन थे। तीन माइक्रोन हड्डी स्लाइड तैयार किए गए थे और मानक एच एंड ई धुंधला प्रदर्शन किया गया। बड़ा नाभिक के साथ कॉम्पैक्ट पत्थर की तरह कोशिकाओं के रूप में लाल तीर द्वारा संकेत, 14 दिनों के इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन के बाद हड्डी के ऊतकों में सूक्ष्म MCF7 मेटास्टेटिक घावों थे। अस्थि मज्जा (बीएम) और बड़े गुलाबी फ्लैट घरनदार हड्डियों (टीबी) विरल नाभिक के साथ ऐसा चिह्नित कर रहे हैं (चित्रा 4 क)। चित्रा 4 बी से पता चलता GFP लेबल MCF7 कोशिकाओं (हरा), एएलपी लेबल अस्थिकोरक (बाएं छवि में लाल), और Osterix लेबल पूर्व अस्थिकोरक (सही छवि में लाल) immunofluorescent धुंधला करने के बाद। ब्लू DAPI धुंधला नाभिक इंगित करता है।
चित्रा 1:। माउस में आम श्रोणिफलक धमनी (लाल) और नस (नीला) के एनाटॉमी उदर महाधमनी, आम श्रोणिफलक धमनी, बाहरी श्रोणिफलक धमनी, और और्विक धमनी के रूप में संकेत दिखाए जाते हैं। इंजेक्शन और्विक धमनी दिशा की ओर महाधमनी से आम श्रोणिफलक धमनी में किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 2:। 4X बढ़ाई साथ मानक विच्छेदन खुर्दबीन के नीचे श्रोणिफलक वाहिकाओं और नसों (एक) बरकरार वाहिकाओं और नसों की छवि। (ख) हटा लिया जहाजों की छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3: इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन के बाद विवो और माउस के पूर्व vivo bioluminescence छवियों में प्रतिनिधि। (क) में विवो इंजेक्शन के बाद पूरे जानवरों के अधिकार के bioluminescence संकेत। (ख) पूर्व vivo bioluminescence संकेतबाएं नियंत्रण हड्डी और इंजेक्शन पशुओं है कि 14 दिन बाद काटा गया से सही इंजेक्शन हड्डी की। सभी bioluminescence संकेतों के निर्माता की प्रक्रिया और सेटिंग्स की सिफारिश का पालन करके मापा गया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 4: ऊतकीय और immunofluorescent धुंधला के प्रतिनिधि छवियाँ। (ए) प्रतिनिधि एच ई MCF7 ट्यूमर इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन के बाद हड्डी के ऊतकों असर का धुंधला छवि। स्केल बार = 25 माइक्रोन। नोट: महामहिम धुंधला हो ट्यूमर का पता लगाने के लिए प्रभावी तरीका नहीं है। कम बढ़ाई में, वह धुंधला काफी संवेदनशील ट्यूमर भेद करने के लिए नहीं है। उच्च बढ़ाई में, यह सब एक स्कैन करने के लिए कुशल नहीं हैreas। (ख) MCF7 ट्यूमर असर हड्डी के ऊतकों की Immunofluorescent धुंधला छवियों। ग्रीन: GFP लेबल MCF7 कोशिकाओं, लाल बाईं छवि में: एएलपी लेबल अस्थिकोरक, लाल सही छवि में: Osterix लेबल पूर्व अस्थिकोरक। ब्लू DAPI धुंधला नाभिक इंगित करता है। स्केल बार = 25 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
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Discussion
हालांकि केवल श्रोणिफलक धमनी कैंसर कोशिकाओं के लिए इंजेक्शन का लक्ष्य है, हम दोनों श्रोणिफलक नस और आसपास के ऊतकों से धमनी की जुदाई सलाह देते हैं, और उन्हें एक बंडल के रूप में एक साथ उठा। इसका कारण यह है शिरा और धमनी बड़े पैमाने पर एक दूसरे के साथ संपर्क करें, और शिरापरक पोत दीवार पतली है और तोड़ने के लिए आसान है। इसलिए, एक सफल इंजेक्शन के लिए, यह समय और एक साथ दो जहाजों को धारण करने के लिए प्रयास की बचत होती है, हालांकि कैंसर की कोशिकाओं को केवल धमनी को इंजेक्ट कर रहे हैं। 4-0 रेशम सीवन के रूप में चित्रा 2 में दिखाया गया है इस प्रक्रिया में मदद करने के लिए प्रयोग किया जाता है। सीवन भी मदद मिल सकती है रोक खून बह रहा है यह हो जाना चाहिए।
आईआईए इंजेक्शन के अधिकांश कदम विच्छेदन खुर्दबीन के तहत किया जा करने की जरूरत है। माउस जहाजों, मुलायम और छोटे हैं जो प्रक्रियाओं चुनौतीपूर्ण बना देता है। 100% हमारे अनुभव में - हालांकि, पर्याप्त अभ्यास के बाद, सफलता की दर 90 तक पहुँच सकते हैं।
एक इस तकनीक के साथ, शोधकर्ताओं हो सकता हैअपने पसंदीदा कैंसर कोशिका मॉडल की हड्डी बसाना मॉडल, पारंपरिक रूप से सोचा था कि "गैर-मेटास्टेटिक" उन सहित स्थापित करने के लिए ble। MCF 7 कोशिकाओं में इस तरह के एक उदाहरण का प्रतिनिधित्व करते हैं। दरअसल, जब हड्डी microenvironment में आ रहा है, MCF 7 कोशिकाओं एक छोटी निद्रा से दूर ले जा उपनिवेश स्थापित करने से पहले गुजरना। बहुत कुछ सहज हड्डी मेटास्टेसिस ओर्थोटोपिक MCF 7 xenografts ले जाने के पशुओं में पाया गया है। हालांकि, विफलता अच्छी तरह से प्रचारित ट्यूमर कोशिकाओं के अवशिष्ट मात्रा, उपनिवेशवाद की धीमी शुरूआत, और ओर्थोटोपिक ट्यूमर के विकास को और अधिक आक्रामक (है कि जानवरों को मारता हड्डी घावों स्थापित कर सकते हैं पहले) से हो सकता है। इस प्रकार, का पता लगाने की कमी MCF 7 कोशिकाओं 'metastasize करने की क्षमता के खिलाफ सबूत के तौर पर नहीं लिया जा सकता। वास्तव में, अकर्मण्य या भी निष्क्रिय हड्डी micrometastases सुझाव द्वारा वर्षों के लिए दशकों निद्रा है कि अक्सर क्लिनिक में देखा जाता है के रूप में, मानव स्तन कैंसर के रोगियों में अधिक प्रचलित हो सकता है।
आईआईए इंजेक्शन लू करने के लिए न केवल लागू किया जा सकतामीनल या बेसल स्तन कैंसर की कोशिकाओं, लेकिन यह भी इस तरह के प्रोस्टेट कैंसर के रूप में अन्य प्रकार के कैंसर के लिए। जब तकनीक निगरानी हड्डी रोग के विभिन्न विकल्पों के साथ संयुक्त, इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन कई शोध उद्देश्यों के लिए एक महत्वपूर्ण योगदान कर सकते हैं। हम आमतौर पर इंट्रा-श्रोणिफलक धमनी इंजेक्शन के बाद हड्डी मेटास्टेसिस प्रगति का पता लगाने के लिए bioluminescence संकेतन का उपयोग करें, और उसके बाद फ्लोरोसेंट immunohistochemistry धुंधला के लिए फसल ट्यूमर असर हड्डियों के कैंसर की कोशिकाओं और आसपास के हड्डी microenvironment आलों के बीच बातचीत को परिभाषित करने के लिए। अस्थि 16-17 histomorphometry और μCT 18-20 हड्डियों के ढांचे परिवर्तन और कहा कि कैंसर की कोशिकाओं की टीका के कारण होता है हड्डी के अन्य संरचनात्मक विवरण का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। समुचित विचार और संयोजन उनकी विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य के लिए प्रत्येक समूह द्वारा निर्धारित किया जाना चाहिए।
इंट्रा-tibial 8-10 और इंट्रा-हृदय टीका 11-13, इंट्रा-इल की एक चेतावनी के लिए इसी प्रकारआईएसी धमनी इंजेक्शन है कि यह दिल का आवेश और संचलन में ट्यूमर कोशिकाओं के प्रवेश करने से पहले मेटास्टेटिक प्रक्रिया में जल्दी कदम पुनरावृत्ति नहीं करता है। आदर्श रूप में, एक सहज प्रक्रिया मेटास्टेसिस ओर्थोटोपिक ट्यूमर से शुरू पूरी तरह से मेटास्टेसिस झरना पुनरावृत्ति करने की जरूरत होगी। हालांकि, इस प्रक्रिया में इस तरह के कुछ अस्थि-रेखा 4T1 उप क्लोन 5-6 और एमएसपी overexpressed PyMT ट्रांसजेनिक माउस मॉडल के रूप में 7 अधिकांश मॉडल में अत्यधिक अक्षम, केवल कुछ अपवादों के साथ है। हमें उम्मीद है आईआईए इंजेक्शन हड्डी उपनिवेशन प्रक्रिया में उपन्यास अंतर्दृष्टि, जो बदले में पूर्व नैदानिक अध्ययन के लिए डिजाइन और सही मायने में कुशल सहज हड्डी मेटास्टेसिस मॉडल के विकास की सुविधा कर सकते हैं प्रदान करेगा।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| DMEM | HyClone | SH30022.01 | |
| FBS | Gibco | 16000 | |
| Pen/Strep Amphatericin B | Lonza Biowhittaker | 17-745E | |
| PBS | Lonza Biowhittaker | 17-516F | |
| Trypsin/EDTA solution | HyClone | SH30042.01 | |
| 45 μM cell strainer | VWR International Laboratory | 195-2545 | |
| MediGel CPF with carprofen | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Buprenorphine | Controlled item from veterinary care in BCM | For pain management | |
| Estradiol pellet | Innovative Research of America | SE-121 | |
| Ketamine and xylazine | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| Vet ointment | Controlled item from veterinary care in BCM | Avoid eye dryness | |
| Shaver | Oster | 78005-050 | For furred mice |
| Isopropyl ethanol | ACROS | 67-63-0 | |
| Betadine surgical scrub | Controlled item from veterinary care in BCM | ||
| #10 scalpel blades | Ted Pella, Inc | 549-3CS-10 | Multiple |
| No. 3 handle | Ted Pella, Inc | 541-31 | Need to be autoclaved |
| Sterile surgical drape | Sai Infusion Technology | PSS-SD1 | |
| Straight forceps | Roboz Surgical Instrument | RS-5132 | Need to be autoclaved |
| Straight fine forceps | Fine Science Tools | 11253-20 | Need to be autoclaved |
| Edged fine forceps | Fine Science Tools | 11253-25 | Need to be autoclaved |
| 4-0 Vicryl silk suture | Johnson & Johnson Health Care | J214H | |
| 31 G insuline syringes | BD | 328418 | Multiple |
| Q-tips cotton swabs (Sterile) | VWR International Laboratory | 89031-272 | |
| Skin glue | Henry Schein Animal Health | 31477 | For surgery site skin closure |
| Ear Tag Applicator | Fine Science Tools | 24220-00 | |
| Ear tags | Fine Science Tools | 24220-50 | |
| D-luciferin | Gold Biotechnology | LUCK | Avoid light and put on ice |
| 28 G insulin syringes | BD | 329410 | For intra-orbital injection |
| Paraformadehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | For tissue fixation |
| EDTA | OmniPur | 4050 | For bone tissue decalficication |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Dissection microscope | Leica | Leica S6E stereo | |
| IVIS Lumina II imaging system | Advanced Molecular Vision | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| Anti-GFP antibodies (JL-8) | Clontech | 632381 | |
| Anti-ALP antibodies | Abcam | ab108337 | |
| Anti-Osterix antibodies | Abcam | ab22552 |
References
- Kang, Y., et al. A multigenic program mediating breast cancer metastasis to bone. Cancer cell. 3 (6), 537-549 (2003).
- Lu, X., et al. VCAM-1 promotes osteolytic expansion of indolent bone micrometastasis of breast cancer by engaging alpha4beta1-positive osteoclast progenitors. Cancer cell. 20 (6), 701-714 (2011).
- Ell, B., Kang, Y.
- Kretschmann, K. L., Welm, A. L. Mouse models of breast cancer metastasis to bone. Cancer Metastasis Rev. 31 (3-4), 579-583 (2012).
- Lelekakis, M., et al. A novel orthotopic model of breast cancer metastasis to bone. Clin Exp Metastasis. 17 (2), 163-170 (1999).
- Rose, A. A., et al. Osteoactivin promotes breast cancer metastasis to bone. Mol Cancer Res. 5 (10), 1001-1014 (2007).
- Welm, A. L., et al. The macrophage-stimulating protein pathway promotes metastasis in a mouse model for breast cancer and predicts poor prognosis in humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (18), 7570-7575 (2007).
- Li, X., et al. Loss of TGF-beta Responsiveness in Prostate Stromal Cells Alters Chemokine Levels and Facilitates the Development of Mixed Osteoblastic/Osteolytic Bone Lessions. Mol. Cancer. Res. 10 (4), 494-503 (2012).
- Gregory, L. S., Choi, W., Burke, L., Clements, J. A. Breast Cancer Cells Induce Osteolytic Bone Lesions In vivo through a Reduction in Osteoblast Activity in Mice. PLoS ON. 8 (9), e68103 (2013).
- Waning, D. L., et al. Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice. Nat Med. 21 (11), 1262-1271 (2015).
- Simmons, J. K., et al.
- Werbeck, J. L., et al. Tumor microenvironment regulates metastasis and metastasis genes of mouse MMTV-PymT mammary cancer cells in vivo. Vet Pathol. 51 (4), 868-881 (2014).
- Xiang, J., et al. CXCR4 Protein Epitope Mimetic Antagonist, POL5551, Disrupts Metastasis and Enhances Chemotherapy Effect in Triple Negative Breast Cancer. Mol Cancer Ther. 14 (11), 2473-2485 (2015).
- Wang, H., et al. The osteogenic niche promotes early-stage bone colonization of disseminated breast cancer cells. Cancer Cell. 27 (2), 193-210 (2015).
- Hoffmann, J., et al. Characterization of new estrogen receptor destabilizing compounds: effects on estrogen-sensitive and tamoxifen-resistant breast cancer. J Natl Cancer Inst. 96 (3), 210-218 (2004).
- Tannehill-Gregg, S. H., Levine, A. L., Nadella, M. V., Iguchi, H., Rosol, T. J. The effect of zoledronic acid and osteoprotegerin on growth of human lung cancer in the tibias of nude mice. Clin Exp Metastasis. 23 (1), 19-31 (2006).
- Slyfield, C. R., Tkachenko, E. V., Wilson, D. L., Hernandez, C. J.
- Koba, W., Jelicks, L. A., Fine, E. J. MicroPET/SPECT/CT imaging of small animal models of disease. Am J Pathol. 182 (2), 319-324 (2013).
- Simmons, J. K., et al. Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo. Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).
- Amend, S. R., et al. Thrombospondin-1 regulates bone homeostasis through effects on bone matrix integrity and nitric oxide signaling in osteoclasts. J Bone Miner Res. 30 (1), 106-115 (2015).
