The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Cigaretrøg (CS) er en stor risikofaktor for hjerte-kar-og lungesygdomme. Fordi CS er en kompleks aerosol indeholder mere end 7.000 kemiske stoffer en det er udfordrende at vurdere bidragene fra de enkelte bestanddele af sin samlede toksicitet. Toksikologiske profiler af de enkelte bestanddele samt blandinger kan dog etableres in vitro ved at anvende højt gennemgående sat screening-værktøjer, der gør det muligt profilering af skadelige og potentielt skadelige Bestanddele (HPHCs) af tobaksrøg, som defineret af det amerikanske Food and Drug Administration (FDA). 2
For en indledende vurdering, blev en impedans-baserede instrument, der anvendes til en real-time, label-free vurdering af forbindelsens toksicitet. Instrumentet udlæsning afhængig celleadhæsion, levedygtighed og morfologi, der alle sammen giver et overblik over cellens status. En dimensionsløs parameter, opkaldt celle indeks, bruges til kvantificering. Et sæt af difskellige farvningsprotokoller blev udviklet til en fluorescens billeddannelse-baserede undersøgelse og en HCS platform blev brugt til at få mere dybdegående information om den slags cytotoksicitet fremkaldt af hver HPHC.
Af de 15 testede bestanddele, blev kun fem udvalgt til HCS-baseret analyse, da de registrerede en beregnelige LD 50 (<20 mm). Disse omfattede 1-aminonaphtalene, Arsen (V), chrom (VI), Crotonaldehyd og phenol. Baseret på deres virkning i HCS, kan 1-aminonaphtalene og Phenol identificeres at inducere mitokondriel dysfunktion, og sammen med chrom (VI) som genotoksisk baseret på den øgede histon H2AX phosphorylering. Crotonaldehyd blev identificeret som en oxidativ stress inducer og Arsen som en stress kinase pathway aktivator.
Denne undersøgelse viser, at en kombination af impedans-baserede og HCS teknologier giver en robust værktøj til in vitro-vurdering af CS bestanddele.
Toksikologisk risikovurdering har historisk påberåbt sig brugen af dyremodeller, som, selv om grundlæggende inden for biovidenskab, er også forbundet med mangler, som inkonsekvent oversættelighed til mennesker og høje omkostninger. Desuden har der været en stigende indsats for at finde alternativer til dyreforsøg i overensstemmelse med ånden i "The 3 R'er" 2 (erstatning, begrænsning og forfining). Denne indsats er blevet accelereret i de seneste par år, ikke kun på grund af de seneste fremskridt såsom high-throughput teknikker og systemer biologi tilgange, men også på grund af lovgivning, der begrænser brugen af dyreforsøg, især i Den Europæiske Union.
Kompleksiteten af cellulære signalveje, der regulerer reaktionen på toksiske fornærmelser gør det klart, at anvendelse af enkelt toksikologiske endpoints ikke vil være tilstrækkelig til at beskrive den toksikologiske grundlag af visse forbindelser. Til dette, samspillet mellem hundredvis af interagerende proteins der bidrager til en biologisk netværk skal også tages i betragtning. For at undersøge effekten af giftstoffer på disse net, et system toksikologi tilgang kombineret med fænotypiske mellem- og high-throughput screening-assays er nyttigt at udlede kræfter og samtidig give flere oplysninger om virkningsmekanismen af individuelle giftstoffer.
I denne undersøgelse anvendte vi HCS som et kraftfuldt screeningsværktøj, som er sammensat af et automatiseret mikroskop og et biologisk softwareprogram, der kan erhverve, bearbejde og analysere billeddata afledt fra specifikke fluorescensbaserede cellulære assays. Dette giver mulighed for visuelle ændringer inden for en celle, der skal kvantificeres, ved en enkelt celle eller subcelleniveau, og mange parametre, der skal analyseres samtidigt. 3 For eksempel blev DNA dobbelt-strengbrud evalueret under anvendelse af et antistof-baserede identifikation af histon H2AX phosphorylering og reaktive oxygenarter (ROS) blev kvantificeret ved anvendelse af en celle-permeable superoxid farvestof.
Fordi lunge epitelceller repræsenterer den første biologiske barriere mod inhalerede giftstoffer, herunder cigaretrøg, vi udnyttet primære bronchieepithelceller celler som en in vitro model for at profilere effekten af HPHCs offentliggjort af USA Food and Drug Administration. 4 Dette håndskrift er en opfølgning -up på en tidligere undersøgelse 5, hvor vi evaluerede den biologiske virkning af en anden delmængde af HPHCs.
Som en del af vores arbejdsgange for at vurdere cytotoksicitet in vitro, vi oprindeligt vurderet de styrker af et udvalg af 15 HPHC s, ved hjælp af en impedans-baseret real-time cellulære analyse (RTCA) system, som tillod os at etablere dosis-intervaller, der er egnede til efterfølgende HCS analyse (figur 1). En toksikologisk HCS vurdering blev derefter udført ved hjælp af ni multi-parametriske endepunkter for cellulær toksicitet, hver overvåget på to tidspunkter (4 og 24 timers). Markørerne anvendt tydede på mitokondrietoksicitet, DNA-skader, stress kinase, reaktive oxygenarter (ROS), indhold glutathion (GSH), caspase-3– 7 Aktivitetsmenutast, cytochrom C frigivelse og permeabilitet cellemembranen, som beskrevet i tabel 1.
Vores tilgang aktiveret identifikation og karakterisering af virkningen af cigaretrøg bestanddele gennem dosis- og tidsafhængig prøveudtagning. I sidste ende, det producerede en in vitro toksikologiske profil for hver HPHC. Multi-omik tilgange kan også anvendes til yderligere at supplere HCS-analyse. Dette ville endelig også give en dybere forståelse af virkningerne på cellesignalering og / eller transkriptionel niveau.
Behovet for alternativer til dyreforsøg og til nye high throughput test tilgange er ofte blevet diskuteret i de seneste år. Dette har ført forskere og regulerende myndigheder til at undersøge alternative metoder til standard toksicitet, udnytte cellulære assays, der nøje efterligner fysiologi målvæv. I dette studie har vi vist anvendeligheden af at kombinere en real-time celle analysator (RTCA) med et højt indhold screening (HCS) platform til at vurdere virkningen af eksponering for enkelte CS vælgere på humane lunge epitelceller. Denne opsætning kan analogt anvendes til at vurdere cytotoksicitet induceret af forskellige andre luftbårne forurenende stoffer, luftbårne partikler og nanopartikler. Desuden kan de opnåede resultater blive matchet med dem fra hel-genom transcriptomics og beregningsmetoder baseret på kausale biologiske netværk. Som tidligere rapporteret, denne tilgang tilladt os at bekræfte data om molekylær vejforstyrrelse på CS eksponering 5 med HCS endpoints, som omhandler disse pathway forstyrrelser også fænotypisk.
Som et flowchart assay, real-time-celle analyse giver cellelevedygtighed-relaterede oplysninger på en dosis- og tidsafhængig opløsning, som giver bedre beslutningsgrundlag hvilken dosis og eksponeringstid punkt kan være gunstige for nedstrøms analyse 14. Princippet i analysatoren er afhængig af ændringer i elektrisk impedans frembragt af cellerne som de tillægger og spredes på en kultur brønd overflade dækket med en guld mikroelektrode. Impedansen omdannes til en dimensionsløs parameter navngivet celle-indeks, som kan anvendes til at overvåge celleadhæsion, spredning, morfologi og i sidste ende cellelevedygtighed. Selvom denne teknik ikke indeholder oplysninger om cytotoksiske mekanismer, dens følsomhed muliggør påvisning af morfologiske celleforandringer selv ved meget lave doser, hvor HCS er ikke informativ (data ikke vist). Baseret på tidli-skellige eksperimenter har vi bemærket, at RTCA metodologi kan detektere morfologiske ændringer ved lavere doser sammenlignet med HCS endpoints.
Efter indledende screening med real-time celle analysator blev en HCS platform, der anvendes til at få mere dybdegående information om den slags cytotoksicitet fremkaldt af hver HPHC. Den HCS assay panel lov til at profilere HPHCs til deres potentielle indvirkning på cellulære rum / organeller samt at identificere dem, fremkalde genotoksicitet eller oxidativ stress. Analysen afslørede distinkte profiler, hvorved de udvalgte HPHCs inducerer cytotoksicitet i NHBE-celler. I almindelighed alle forbindelser undtagen phenol, blev fundet at inducere nekrose ved de højeste testede doser. I overensstemmelse med en potentiel rolle i udviklingen af kræft 1-aminonaphtalene induceret fosforylering af H2AX som markør for genotoksicitet, men HCS panelet også udækket aktiviteten af dette HPHC i mitokondrietoksicitet udlæsning (masse øget og cytochrom C ReleaSE) og oxidativt stress (GSH udtømning). Ligeledes som tidligere beskrevet, Phenol blev identificeret til at inducere mitokondriel dysfunktion, og forårsage DNA-skader samt GSH udtynding. Chrom (VI), en af forbindelserne, der er klassificeret som gruppe I carcinogener, og Crotonaldehyd blev også begge identificeret som genotoksisk, især chrom (VI) også induceret apoptose (caspasekaskaden aktivering) og Crotonaldehyd forårsagede forøget ROS-generering. Endelig Arsen (V), viste sig at inducere cJun phosphorylering, som er en markør for stress kinase pathway aktivering.
I denne undersøgelse anvendte vi NHBE-celler som en model for lunge epiteliale celler in vitro. Ved hjælp af disse celler i en HCS indstilling er uden fortilfælde og muliggjorde undersøgelse af en bredere vifte af endepunkter, herunder genotoksicitet og oxidativ stress markører. Både levende celler og faste cellefarvningsprocedurer fremgangsmåder blev beskrevet i vores protokoller, hvilket viser fleksibiliteten af den samlede teknik. I fhandling, kan de samme protokoller anvendes på et bredere spektrum af mål, der kan adresseres ved brug af noget fluorescerende farvestof eller antistof. For en vellykket gennemførelse af de levende farvningsprotokoller, er det vigtigt at overholde inkubationstiden, som nogle af farvestofferne har en begrænset halveringstid og fluorescenssignalet kan falde inden erhvervelsen billedet er afsluttet. Det er også vigtigt at overveje, at hvis der anvendes en anden celletype, alle farvning betingelser bør revurderes, da den optimale farvestof koncentration og inkubationstiden kan være anderledes.
I den aktuelle papir har vi beskrevet en situation, hvor kun fem forbindelser, hvor screenet med HCS metodologi. I betragtning af den tidligere beskrevne plade layout, blev de doseret over 2 forskellige plade sæt til i alt 24 plader (6 assays og 2 tidspunkter) .Den antal plader kan også forøges, hvilket tillader den samtidige screening af flere forbindelser eller de undersøgtegelse af flere endpoints. Forinden dog bør man tage i betragtning, at visse endpoints (GSH og ROS) kræver øjeblikkelig overtagelse, og som en konsekvens, bør udføres doseringen af pladerne i en forskudt måde at tillade erhvervelsen af den foregående plade. På den anden side, ved hjælp af en fast cellefarvning protokol udgør en fordel, da pladerne kan stables, afbryde protokollen på ethvert trin efter optagelsen, for færdiggørelse af farvningsproceduren på et senere tidspunkt. Denne tilgang, for eksempel, ville give operatøren tid til at færdiggøre alle live celle farvning plader uden at forringe kvaliteten af data.
For yderligere at optimere arbejdsgangen ved at reducere antallet af plader, ville det også være muligt at multiplekse flere endpoints sammen. For eksempel i denne sammenhæng DNA-skader og stress kinase kunne undersøges sammen blot at bruge to sekundært antistof med fluorokromer udsender i forskellige channels. Løbende udvikling af HCS platform, herunder fuldautomatisk cellepodning, forbindelse fortynding, dosering og farvning, samt tilføjelse af nye endepunkter vil yderligere udvide evne til HCS platform som en stærk profilering værktøj til HPHCs på epitel og andre celletyper .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Karsta Luettich og Grégory Vuillaume for revision af manuskriptet.
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |