Abstract
Sigarettenrook (CS) is een belangrijke risicofactor voor hart- en longziekten. Omdat CS is een complex aerosol met meer dan 7.000 chemicaliën 1 het een uitdaging om de bijdragen van de afzonderlijke bestanddelen zijn algemene toxiciteit te beoordelen. Toxicologische profielen van de afzonderlijke onderdelen, alsmede voor mengsels kunnen echter worden vastgesteld in vitro, door het toepassen van high-throughput screening instrumenten, die de profilering van schadelijke en potentieel schadelijke bestanddelen (HPHCs) van tabaksrook mogelijk te maken, zoals gedefinieerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (FDA). 2
Voor een eerste beoordeling, werd een impedantie gebaseerde instrument gebruikt voor een real-time, label-free beoordeling van de toxiciteit van de verbinding. Het instrument uitlezing is gebaseerd op celadhesie, leefbaarheid en morfologie dat allemaal bij elkaar geven een overzicht van de status cel. Een dimensieloze parameter genaamd cel index wordt gebruikt voor kwantificering. Een set van diflende kleuring protocollen ontwikkeld voor fluorescentie beeldvorming gebaseerd onderzoek en een HCS platform werd gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen.
Van de 15 geteste bestanddelen slechts vijf geselecteerd voor HCS-gebaseerde analyse en mocht berekenbare LD 50 (<20 mM) geregistreerd. Deze omvatten 1-aminonaphtalene, arseen (V), chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol. Op basis van hun werking in de HCS kan 1-aminonaphtalene en fenol worden geïdentificeerd mitochondriale dysfunctie induceren, en samen met chroom (VI) als genotoxisch gebaseerd op de verhoogde histon H2AX fosforylering. Crotonaldehyde werd geïdentificeerd als oxidatieve stress inductor en Arseen als stress-kinase pathway activator.
Deze studie toont aan dat een combinatie van impedantie gebaseerde en HCS technologie verschaft een robuust hulpmiddel voor in vitro beoordeling van CS bestanddelen.
Introduction
Toxicologische risicobeoordeling is van oudsher vertrouwd op het gebruik van dierlijke modellen die, hoewel fundamenteel in de life sciences, zijn ook in verband met tekortkomingen, zoals inconsistent vertaalbaarheid voor de mens en de hoge kosten. Verder is er een toenemende poging om alternatieven voor dierproeven in de geest van "The 3Rs" 2 (vervanging, vermindering en verfijning) te vinden. Deze inspanningen werden versneld in de afgelopen jaren, niet alleen vanwege de recente ontwikkelingen zoals high-throughput technieken en systemen benaderingen, maar ook vanwege de wetgeving die het gebruik van dierproeven, vooral in de Europese Unie.
De complexiteit van cellulaire signaleringsroutes reguleren van de reactie op toxische beledigingen maakt het duidelijk dat het gebruik van één toxicologische eindpunten niet voldoende om de toxicologische hand van bepaalde verbindingen geven is. Hiervoor de wisselwerking tussen honderden interactie proteins bijdragen aan een biologisch netwerk moet ook rekening worden gehouden. Om het effect van toxische stoffen op deze netwerken bestuderen een systeem toxicologische benadering in combinatie met fenotypische midden- en hoge doorvoer screening assays nuttig potenties afleiden en tegelijkertijd zorgen voor meer informatie over het werkingsmechanisme van individuele toxische stoffen.
In deze studie hebben we gebruik HCS als krachtige screeningsmethode, dat bestaat uit een geautomatiseerde microscoop en een biologisch softwaretoepassing die kan verkrijgen, te verwerken en beeldgegevens afkomstig van specifieke fluorescentie gebaseerde cellulaire assays analyseren. Dit maakt visuele veranderingen binnen een cel te kwantificeren, op een enkele cel of subcellulair niveau, en vele parameters tegelijkertijd te analyseren. 3 werden bijvoorbeeld DNA double-strand breaks geëvalueerd onder toepassing van een antilichaam gebaseerde identificatie van histon H2AX fosforylatie en reactieve zuurstofspecies (ROS) werden gekwantificeerd onder toepassing van een cel-permduidelijker zichtbaar superoxide gevoelige kleurstof.
Omdat long epitheelcellen de eerste biologische barrière vormen tegen ingeademd toxische stoffen, zoals sigarettenrook, we benut primaire bronchiale epitheelcellen als een in vitro model om het effect van HPHCs gepubliceerd door de Amerikaanse Food and Drug Administration te profileren. 4 Dit handschrift is een vervolg -up op een eerdere studie 5 waarin we de biologische gevolgen van een andere deelverzameling van HPHCs geëvalueerd.
Als onderdeel van onze workflow te cytotoxiciteit in vitro te beoordelen, we in eerste instantie onderzocht de potenties van een selectie van 15 HPHC's, met behulp van een impedantie gebaseerde real-time mobiele analyse (RTCA) systeem dat liet ons toe om de dosis-bereik, geschikt voor de volgende HCS vast analyse (Figuur 1). Een HCS toxicologische evaluatie werd vervolgens uitgevoerd met behulp van negen meerdere parametrische eindpunten van cellulaire toxiciteit, elk is op twee tijdstippen (4 en 24 uur). De merkers die werden gebruikt waren indicatief voor mitochondriale toxiciteit, DNA schade, stress kinase, reactieve zuurstof species (ROS), glutathion (GSH) gehalte, caspase 3-7 activiteit, cytochroom C en afgifte celmembraan permeabiliteit, zoals beschreven in Tabel 1.
Onze aanpak ingeschakeld identificatie en karakterisering van het effect van sigarettenrook bestanddelen door de dosis en tijdsafhankelijke sampling. Uiteindelijk leverde dat een in vitro toxicologisch profiel voor elke HPHC. Multi-omics benaderingen kunnen ook worden gebruikt om de HCS analyse verder aanvullen. Dit zou uiteindelijk ook een dieper inzicht in de effecten op de cell signaling en / of transcriptie niveau.
Protocol
1. Oogsten normale menselijke bronchiale epitheelcellen (NHBEs)
- Pre-warm het celkweekmedium (bronchiale epitheliale celgroei-medium aangevuld medium), de HEPES, trypsine en trypsine neutraliserende oplossing (TNS) in het waterbad bij 37 ° C.
- Oogst de cellen bij 80% van de samenvloeiing is bereikt.
Opmerking: De volgende NHBE celkweek enten voorwaarden kunnen worden aangewend om confluentie in T75 flessen verkregen onbeklede met 20 ml medium:- Seed 1 x 10 6 cellen voor 3-daagse cultuur, 0,5 x 10 6 cellen voor 4-daagse cultuur en 0,25 x 10 6 cellen voor 5-daagse cultuur. Veranderen medium elke 2 dagen, wanneer cellen zijn in de cultuur om voedingsstoffen te vernieuwen. Kweekcellen bij 37 ° C en 5% CO2.
- Verwijder de bovenstaande vloeistof uit het vat (en) en voeg HEPES om de cellen te wassen (bijv., 3 ml van een 75 cm2 kolf). Draai elke kolf aan de cel monolaag met de HEPES sol te dekkenution.
- Verwijder de HEPES-oplossing en voeg trypsine oplossing (bijv., 3 ml van een 75 cm2 kolf). Draai de kolf naar de cel monolaag met trypsine oplossing te dekken.
- Incubeer de kolf gedurende 5 minuten bij 37 ± 2 ° C. Monitor cel losraken onder de microscoop en eventueel incubeer langer en tik zachtjes de kolf resterende gehechte cellen los.
- TNS toevoegen om de reactie te stoppen (bijv., 3 ml van een 75 cm2 kolf) en breng de celsuspensie aan een 15 ml buis.
- Centrifugeer de celsuspensie bij 300 xg gedurende 5 minuten.
- Verwijder het supernatant en resuspendeer de celpellet in 10 ml vers medium, het mengen zodat een homogeen celsuspensie werd verkregen.
- Filter de celsuspensie door middel van een 100 urn cel zeef om aggregaten te verwijderen en tel de cellen. Opmerking: In ons laboratorium werd een elektrisch veld meerkanaals celtelling systeem gebruikt om de viabl nauwkeurig en consistent evaluerene cellen nummer.
2. Real Time Cell Analyzer (RTCA) -gebaseerde vaststellen van het doseringsbereik (DRF)
Opmerking: Een impedantie gebaseerde meting werd gebruikt om: 1) te evalueren verbinding toxiciteit, 2) Selecteer verbindingen verder worden onderzocht door HCS en 3) selecteer geschikte doses voor HCS. De NHBE cellen in de platen RCTA gedoseerd door toevoeging van 25 gl testverbinding verdunningen 100 pl medium aanwezig in elk putje. Daarom worden alle testoplossingen bereid in 5 maal (5x) de gewenste eindconcentratie.
- Zaaien NHBE Cells
- Programmeer het instrument om het aantal en de duur van de impedantie metingen te bepalen. In deze studie werden gegevens opgenomen na elke 15 min gedurende 48 uur (bij 24 uur ± 2 uur voor en 24 uur na toediening van de cellen met testmiddelen).
- Meet de plaatachtergrond eveneens 50 ul voorverwarmde medium in elk putje van een 96-wells plaat RTCA. Opmerking: Deze stap betekent een technisch voorschrifthet instrument om de elektrische weerstand medium dat vervolgens wordt gebruikt als basis referentie voor celgebaseerde berekening berekenen.
- Bereid een celsuspensie bij een concentratie van 144.000 cellen / ml (± 5%) en voeg 50 ul celsuspensie (7200 cellen / putje) aan elk putje van de RTCA plaat waarin 50 ul / putje medium werd reeds instrument toegevoegde achtergrond meting.
- Laat de cellen hechten gedurende 30 min bij kamertemperatuur voordat ze in de RTCA houder (de homogene verdeling van de cellen te verbeteren). Incubeer de platen in de RTCA RTCA houder in de incubator (37 ° C en 5% CO2) en optekenen van de gegevens voor de volgende 24 ± 2 uur vóór de dosering.
- Verdunningen van HPHCs en positieve controles
- Positive Control Verwatering
- Verdun de Staurosporine stockoplossing (10 mM) in DMSO 01:10 (zie tabel 3) en voeg 5 ul van het dilution tot 195 ul van medium tot een 5x werkende oplossing te verkrijgen.
- HPHC Verwatering
- Los op / vul telkens HPHC in het voertuig (tabel 2) aan een 1 M voorraadoplossing genereren. Verdun elke HPHC stockoplossing 01:10 in medium om een 100 mM oplossing te genereren.
- Genereer de "verbinding moederplaat" maken door de vijf stappen 1:10 seriële verdunning gebruikt medium + 10% voertuig 5x werkoplossingen (figuur 2) te verkrijgen. Opmerking: Uiteindelijk zal de uiteindelijke doses: 0,2 uM, 2 uM, 20 uM, 0,2 mM, 2 mM, 20 mM. Bereid ook de dosis 0, overeenkomend met het enige voertuig, in deze stap.
- doseren
- Pauzeer de RTCA instrument en open de wieg tot het bord te verwijderen.
- Verwijder de plaat en plaats deze in de RTCA plaat temperatuur gereedschap (ontworpen om de temperatuur van de RTCA plaat te stabiliseren tijdens de experimentele procedures buiten de RTCAstation) om te voorkomen dat het koelen van de cellen, die van invloed kunnen de impedantiemeting.
- Voeg 25 ul 5x oplossing uit de "verbinding hoofdplaat" naar cellen in drievoud behoud van dezelfde dosering volgorde als in de verbinding moederplaat (hoogste dosering in de bovenste rij en dragercontrole het rijnummer 7) (figuur 2). Gebruik de bestaande (100 pi) celcultuurmedium niet verwijderen.
- Voeg 25 ul 5x positieve controleoplossing de cellen in de onderste rij (half-rechts) zonder het verwijderen van bestaande kweekmedium. Voeg 25 ul medium aan de cellen in de onderste rij (half-links) zonder het verwijderen van bestaande celkweekmedium.
- Seal de plaat met plaat sealer. Plaats de plaat terug in de RTCA cradle en vergrendelen. Herstart gegevensregistratie voor de gewenste belichtingstijd (bijv., 24 uur). Opmerking: Het gebruik van deze kit film wordt aanbevolen om mogelijke besmetting, met inbegrip van well-to-well kruisbesmetting te voorkomen.
- <strong> Data Analyse RTCA en LD 50 Berekening
- Export ruwe gegevens als een tekstbestand (.txt) of Excel (.xls-bestand). Opmerking: Het bestand wordt alle informatie met betrekking tot de plaat lay-out (Compounds, doses en goed positie) bevatten. Ruwe celstof indexwaarden zijn georganiseerd in een 96 putjes (mirroring putje distributie) en worden voor iedere tijdstippen waarop de registratie plaatsvond. De waarde op positie i in de plaat met 96 putjes op tijdstip t wordt aangeduid met Cl t (i).
- Identificeren als een normalisering verwijzen naar de laatste tijdstip voordat de dosering voor elke positie i in de plaat met 96 (bijv Cell Index bij 23 uur 50 min 00 sec op positie i, CI t (i) = 23: 50: 00 = CI Ref (i)). Opmerking: Deze informatie moet worden geannoteerd wanneer de dosering wordt uitgevoerd.
- Divide, op een goed basis, elke keer dat punt waarden door de normalisering verwijzing naar alle waarden normaliseren bij het doseren de tijd. De genormaliseerde waarde bij positioni in de 96 well plaat op tijdstip t wordt aangeduid door NCI t (i), en wordt dus als NCI t (i) = Cl t (i) / CI Ref (i) voor alle t.
- Bereken de oppervlakte onder de curve (AUC) en 24 uur na toediening voor elk monster i (positie i in de plaat met 96 putjes), inclusief posities voor positieve controle en het voertuig.
- Verkrijgen van de AUC op positie i wordt verkregen door het optellen van de gebieden van elke rechthoek, waarbij elke rechthoek tussen twee tijdstippen aangegeven met t k en t l (t k <t l); bereken elke rechthoek gebied met x * y met x = t l - t k zijnde de afstand tussen twee tijdstippen en y zijnde het gemiddelde van de activiteit van de twee tijdstippen (y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
Opmerking: De AUC van 24 uur na toediening voor positie i is aangegeven met AUC (i). Aangezien alle voorwaarden uitgeplaat in drievoudige putjes de mediaan van de drie waarden gebruikt.
<li> normaliseren van de waarden met behulp van de volgende vergelijking: - Verkrijgen van de AUC op positie i wordt verkregen door het optellen van de gebieden van elke rechthoek, waarbij elke rechthoek tussen twee tijdstippen aangegeven met t k en t l (t k <t l); bereken elke rechthoek gebied met x * y met x = t l - t k zijnde de afstand tussen twee tijdstippen en y zijnde het gemiddelde van de activiteit van de twee tijdstippen (y = (NCI tk (i) + NCI tl (i)) / 2).
waarbij i de positie in de plaat met 96 putjes die AUC werd berekend op 24 uur na dosering,
Voertuig is de mediaan van de AUC-waarden van het voertuig putjes op een plaat bij 24 uur na dosering,
Positieve controle is de mediaan van de AUC-waarden voor de positieve controleputjes op een plaat bij 24 uur na dosering,
CR is de gewenste gemiddelde genormaliseerde waarde voor het voertuig (0%) en
SC is de gewenste mediane genormaliseerde waarde voor de positieve controles (-100%)
OPMERKING: Aan het eind van deze stap, een dataset wordt verkregen dat bevat, voor elke positie i in de put plaat 96, een concentratie ci (logaritmische eenheden) die wordt toegepast op het monster in stand / well i en de bijbehorende genormaliseerde AUC bij 24 uur na inname AUC_normalized (i). - Plot en monteer de (c i, AUC_normalized (i)) -waarden met behulp van een 4-parameters Hill vergelijking. Indien mogelijk, ook LD 50 berekenen.
waarbij Y = AUC_normalized,
Activiteit nul S = 0 activiteitenniveau op nul concentratie van testverbinding
Infinite Activiteit S inf = Activity niveau oneindig concentratie,
AC50 = concentratie waarbij de activiteit 50% van de maximale niveau bereikt,
Hill-coëfficiënt n = Maatregel van de helling in AC50, en
c = concentratie in logaritmische eenheden die overeenkomen met de waarden op de x-as van de dosis-responscurve plot.
OPMERKING: AC50 overeen met LD 50 (cytotoxiciteit assays). Het is een maat voor de sterkte waar lage waarden wijzen op een grote sterkte.
- Positive Control Verwatering
3. Het meten van toxicologische effecten van HCS
OPMERKING: totaal negen meerdere parametrische markers van toxiciteit, gegroepeerd in zes verschillende assays worden gemeten met de HCS platform (tabel 1). Op basis van de RTCA cel levensvatbaarheid (paragraaf 2) het dosisbereik van elk bestanddeel wordt bepaald en een referentiedosis 3R4F is ook inbegrepen. De verwijzing dosis komt overeen met de hoeveelheid HPHC in de rook van een stok van de referentie sigaret 3R4F.
- Zaaien NHBE Cells
- Bereid een celsuspensie bij 120.000 cellen / ml (± 5%) en voeg 100 ul celsuspensie aan elk putje van een 96-well plaat HCS (12.000 cellen / putje). Bereid je genoeg platen voor de beoordeling van alle assays (cytotoxiciteit, DNA-schade, Stress kinase, ROS, GSH inhoud en apoptose) en tijdstippen (4 en 24 uur).
- Laat de HCS platen bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten om de cellen te hechten aan putjes en incubeer bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende 24 ± 2 uur vóór de dosering.
- Verdunning van HCHPs en positieve controles
OPMERKING: De NHBE cellen in de HCS platen worden gedoseerd door het toevoegen van 25 ui proefmonsteroplossingen tot 100 pl medium reeds aanwezig in elk putje. Daarom worden alle doses bereid 5x de gewenste eindconcentratie.- Positieve controles Verwatering (Positive Control Plate)
- Verdeel 40 pl voorraadoplossing van elke positieve controle (zie tabel 3) in kolom # 2 (figuur 4a, putten gearceerd rood). Doseer 20 pi van het voertuig in de kolommen # 3 en # 5 (figuur 4a, putten in de schaduw in het licht blauw) en 40 pi van het voertuig in kolom # 4 (figuur 4a, putten schaduw in lichtblauw).
- Trekken 12 pi uit de putjes in kolom # 2, afgeven aan de putjes in kolom # 3 en meng (figuur 4b), Blijven totdat een definitieve seriële verdunning met 3 doses (D1, D2 en D3) en het voertuig (V) voor elke positieve controle verbinding wordt verkregen (Figuur 4c). Om de positieve controle plaat te genereren, voor te bereiden van een 1:40 verdunning van verbindingen in de media (figuur 4d).
- HPHC Verwatering (Compound Master Plate)
OPMERKING: De gekozen dosis varieert van HPHCs voor HCS worden in tabel 2.- Vul telkens HPHC voorraadoplossing (1 M) 1:10 in medium voor een concentratie van 100 mM. Voeren verdunningen gebruiken medium met 10% voertuig naar de geselecteerde 5x doses per HPHC verkrijgen.
- Positieve controles Verwatering (Positive Control Plate)
- doseren
- Voeg 25 pl 5x oplossingen van de verbinding moederplaat de cellen in drievoud behoud van dezelfde dosering volgorde als in de verbinding moederplaat (hoogste dosering in de bovenste rij en dragercontrole het rijnummer 7) (Figuur 5). Verwijder de eESTAANDE (100 pl) celkweekmedium.
- Voeg 25 pl 5x oplossing uit de positieve controle plaat om de cellen in de onderste rij behoud van dezelfde dosering volgorde als in de positieve controle plaat (Figuur 5). Gebruik de bestaande (100 pi) celcultuurmedium niet verwijderen. Opmerking: Elke assay heeft een specifieke positieve controle; zie Tabel 3. Incubeer de plaat bij 37 ° C en 5% CO2 gedurende de gewenste belichtingstijd (4 of 24 uur).
- kleuring
- Voorbereiding voor alle Testen
- Pre-warm de wasbuffer (PBS) oplossingen bij 37 ° C.
- Bereid de fixatie-oplossing (4% formaldehyde oplossing) toevoegen van 10,81 ml 37% formaldehyde aan 89,19 ml wasbuffer en voorverwarmen bij 37 ° C.
- Bereid de Permeabilisatie buffer door het toevoegen van 10 ml van 10x permeabilisatie buffer tot 90 ml wasbuffer en pre-warm het op 37 ° C.
- Bereid de Blocking buffer door het toevoegen van 10 ml van 10x blokkerende buffer tot 90 ml wasbuffer en pre-warm het op 37 ° C.
- Vooraf verwarmen het celcultuurmedium bij 37 ° C.
- Verwijder de HCS platen uit de incubator als de 4 en 24 uur blootstelling tijden bereikt en voer de volgende specifieke protocollen voor elke assay.
- cytotoxiciteitstest
- Bereid een voldoende volume (V) van live cell kleuroplossing volgens de volgende formule: volume medium (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten)
- Verdun het Mitochondria kleurstof in de Live Cell kleuroplossing volgens instructie leverancier. Verdun de membraanpermeabiliteit kleurstof in de Live Cell kleuroplossing volgens instructie leverancier.
- Voeg 50 ul live cell kleuring oplossing in elk putje van de plaat (en) aangeduid als "Cytotoxiciteitstest". NIET verwijderen celkweekmedium en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO
- Zuig het medium en kleuroplossing en voeg 100 ul / putje van fixatie-oplossing aan elk putje en vervolgens geïncubeerd (platen) gedurende 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig fixatie-oplossing en eenmaal wassen met 100 ul / putje wasbuffer.
- Verwijder wasbuffer en voeg 100 ul / putje 1x permeabilisatie buffer aan elk putje en incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig permeabilisatie buffer en wassen plaat tweemaal met 100 ul / putje wasbuffer.
- Aspireren wasbuffer en voeg 100 gl van 1x blokkerende buffer aan elk putje en incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Bereid een voldoende volume (V) van primaire antilichaamoplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten). Verdun de anti-cytochroom C-antilichaam (muis) 1: 250 in primair antilichaam oplossing.
- Aspireren blokkeerbuffer eend 50 ul / putje primair antilichaam oplossing toe aan elk putje en incubeer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Bereid een voldoende volume (V) van het secundair antilichaam en nucleaire oplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten). Verdun de anti-muis-antilichaam 1: 500 in secundair antilichaam en nucleaire oplossing. Verdun de Nuclear kleurstof 1: 1.000 in secundair antilichaam en nucleaire Solution.
- Zuig Primary Antibody Solution en wassen plaat driemaal met 100 ul / putje wasbuffer met behulp van de plaat wasmachine.
- Aspireren wasbuffer en voeg 50 ul / putje secundair antilichaam en nucleaire oplossing aan elk putje van de plaat (en) en incubeer 60 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig secundair antilichaam en Nucleaire Solution en wassen plaat driemaal met 100 ul / putje wasbuffer met behulp van de plaat wasmachine. Voeg 100 ul / putje wasbuffer. Plate (s) is (zijn) nuklaar om te worden beoordeeld aan de HCS-lezer.
- DNA Damage Assay
- Zuig het medium van de aangewezen "DNA-schade" platen.
- Voer dezelfde stappen zoals beschreven in de juiste volgorde: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Merk op dat in dit geval alleen medium tijdens stap 3.4.2.4 wordt verwijderd.
- Bereid een voldoende volume (V) van primaire antilichaamoplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten)
- Verdun de anti-fosfo H2AX antilichaam (muis) 1: 2000 in Primary Antibody Solution.
- Voer dezelfde stappen als beschreven in 3.4.2.10.
- Bereid een voldoende volume (V) van het secundair antilichaam en nucleaire oplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten)
- Verdun de anti-muis-antilichaam 1: 500 in secundair antilichaam en nucleaire oplossing.
- Verdun de Nuclear dye 1: 1.000 in secundair antilichaam en nucleaire Solution.
- Voer dezelfde stappen zoals beschreven in de volgorde: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- Stress Kinasetest
- Zuig het medium van elk van de aangewezen "Stress Kinase" platen.
- Voer dezelfde stappen zoals beschreven in de juiste volgorde: 3.4.2.4 - 3.4.2.8. Merk op dat in dit geval alleen medium tijdens stap 3.4.2.4 wordt verwijderd.
- Bereid een voldoende volume (V) van primaire antilichaamoplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten)
- Verdun de anti-fosfo cJun antilichaam (konijn) 1: 200 in Primary Antibody Solution.
- Voer dezelfde stappen als beschreven in 3.4.2.10.
- Bereid een voldoende volume (V) van het secundair antilichaam en nucleaire oplossing volgens de volgende formule: Volume blokkeerbuffer (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten)
- Verdun anti-konijn antilichaam 1: 500 in secundair antilichaam en nucleaire oplossing.
- Verdun de Nuclear kleurstof 1: 1.000 in secundair antilichaam en nucleaire Solution.
- Voer dezelfde stappen zoals beschreven in de volgorde: 3.4.2.12-3.4.2.14.
- ROS Assay
- Bereid een voldoende volume (V) van live cell kleuroplossing volgens de volgende formule: volume medium (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten).
- Verdun de ROS kleurstof Live Cell kleuroplossing volgens vendor instructie
- Verdun de Nuclear kleurstof 1: 1000 Live cel kleuring Solution.3.4.5.4) Voeg 50 ul Levende cel kleuring oplossing voor elke aangewezen "ROS" putjes; NIET verwijderen celkweekmedia en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig voorzichtig het medium en de kleuroplossing en was plaat driemaal met 100 ul / putje medium.
- Zuig het medium, voeg 100 _6, l / putje fixatie-oplossing aan elk putje en incubeer dienblad 20 min bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig voorzichtig fixatie-oplossing en was plaat driemaal met 100 ul / putje wasbuffer.
- Voeg 100 ul / putje wasbuffer. Plate (s) is (zijn) nu klaar.
- Evalueer de plaat op de HCS-lezer binnen 1 uur.
- GSH inhoud Assay
- Bereid een voldoende volume (V) van Levende Cell Nuclear kleuroplossing volgens de volgende formule: volume medium (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten).
- Verdun de Nuclear kleurstof (Far Red) 1: 1000 Live Cell Nuclear kleuring Solution.3.4.6.3). Voeg 50 ul van live cell Nuclear kleurstofoplossing aan elk putje van de aangewezen "GSH gehalte" platen. NIET verwijderen celkweekmedia en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
- Bereid een voldoende volume (V) van live cell GSH kleuroplossing volgens devolgende formule: volume van HBSS (pl) V = 50 x B x 1.2 (W aantal putten)
- Verdun het GSH kleurstof in live cell GSH kleuroplossing volgens de instructies leverancier.
- Zuig het medium en de nucleaire kleuroplossing en was plaat driemaal met 100 ul / putje medium.
- Aspireren medium en voeg 100 ul / putje live cell GSH kleurstofoplossing aan elk putje van de plaat (platen).
- Incubeer gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur in het donker. Plate (s) is (zijn) nu klaar.
- Evalueer plaat (s) op de HCS Reader binnen 1 uur.
- apoptosis Assay
- Bereid een voldoende volume (V) van live cell kleuroplossing volgens de volgende formule: volume medium (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten).
- Verdun het caspase kleurstof 1: 300 Live Cell kleuroplossing.
- Verwijderen celkweekmedia, voeg 50 ul live cell kleurstofoplossing aan elk putje van tHij (platen) aangeduid met "apoptose" en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C, 5% CO2.
- Bereid een voldoende volume (V) van Levende Cell Nuclear kleuroplossing volgens de volgende formule: Volume van Fix oplossing (pl) V = 50 x B x 1,2 (w aantal putten).
- Verdun de Nuclear kleurstof 1: 1000 Live Cell Nuclear kleuroplossing.
- Verwijder de levende cellen kleuroplossing, voeg 100 ul / putje live cell Nuclear kleurstofoplossing aan elk putje van de plaat (en) en incubeer gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Zuig het fixeermiddel / nucleaire kleurstofoplossing en was (platen) driemaal met 100 ul / putje wasbuffer.
- Voeg 100 ul / putje wasbuffer. Plate (s) is (zijn) nu klaar.
- Evalueer plaat (s) op de HCS-lezer.
- Voorbereiding voor alle Testen
- Data Analysis HCS
- Export ruwe gegevens als Excel (.xls-bestand). Opmerking: Ruwe cel indexwaarden zijn georganiseerd in een vorm met 96 putjesbij (mirroring plaat en distributie) en zijn voorzien voor elke eindpunten op een bepaald tijdstip na de dosering.
- Normaliseren van de waarden met de volgende vergelijking:
waarbij i het gemeten ruwe signaal waarde van een goed,
Het voertuig is de mediaan van het gemeten signaal waarden voor het voertuig putten op een bord,
CR is de gewenste gemiddelde genormaliseerde waarde voor het voertuig (0%) en
SC is de gewenste gemiddelde genormaliseerde waarde voor de positieve controles (100),
OPMERKING: Aan het eind van deze stap, een dataset wordt verkregen dat bevat, voor elke positie i in de put plaat 96, een concentratie c i (logaritmische eenheden) die is aangebracht op het monster in stand / well i en corresponderende genormaliseerde signaal N (i). - Plot en monteer de (c i, N (i)) - waarden met behulp van een 4-parameters Hill-vergelijking.
waarbij Zero Activity S 0 = activiteitenniveau op nul concentratie van testverbinding
Infinite Activiteit S inf = Activity niveau oneindig concentratie,
AC50 = concentratie waarbij de activiteit 50% van de maximale niveau bereikt,
Hill-coëfficiënt n = Maatregel van de helling in AC50, en
c = concentratie in logaritmische eenheden die overeenkomen met de waarden op de x-as van de dosis-responscurve plot.
OPMERKING: AC50 is een maat voor de sterkte waar lage waarden wijzen op een grote sterkte.
Representative Results
RTCA
Omdat de HCS eindpunten niet informatief is wanneer er geen toxisch effect waargenomen, die verbindingen niet weergegeven cellevensvatbaarheid tot de hoogste concentratie in het RCTA niet door HCS (Figuur 3b, c, d, g, k, l, m getest , p). Verbindingen showing cellevensvatbaarheid op slechts de hoogste concentratie (Figuur 3e, o) ook gedeselecteerd voor HCS. Tenslotte alleen de bestanddelen met een berekenbare LD 50 (<20 mM) worden geselecteerd voor verdere analyse HCS (figuur 3a, f, h, j, n). HPHCs aan bovenstaande criteria zijn: 1-aminonaphtalene, arseen (V), chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol.
HCS
Als Quality Check (QC), positieve controles zijn fieerst geanalyseerd dat kleuring procedure correct uitgevoerd verzekeren. Representatieve Foto positieve controle behandelde cellen worden getoond in Figuur 6. Gegeven waarden zijn genormaliseerd voertuig zoals eerder beschreven. Geen dosis-respons curves zijn uitgezet als slechts drie doses worden getest en niet alle drie doses worden overwogen bij elke keer dat-point. Positieve controle doses worden geselecteerd (gebaseerd op eerdere experimenten, gegevens niet getoond) zodat geschikte reacties zijn waargenomen voor elk eindpunt aan zowel 4 uur en 24 uur. Met name doses 1 en 2 worden gebruikt om het effect te evalueren 4 uur terwijl doses 2 en 3 worden gebruikt om het effect van 24 uur geëvalueerd. Platen worden weggegooid als er geen antwoord wordt waargenomen voor de positieve controle doses. Merk op dat voor alle eindpunten, behalve mitochondriale membraanpotentiaal en GSH, toegenomen intensiteit van het signaal verwacht wordt.
Alle verbindingen behalve fenol, induceerde een necrotische fenotype type gebaseerd op verhoogde celmembraan permeabiliteit (Figuur 7a, f, h, l). 1-aminonaphtalene, chroom (VI), Crotonaldehyde en fenol werden geïdentificeerd als genotoxisch gebaseerd op verhoogde fosforylering van histon H2AX (figuur 7e, j, n, p). Fenol en 1-aminonaphtalene bleken ernstige mitochondriale dysfunctie (figuur 7b, o) die met 1-aminonaphtalene, leidde tot een verhoogde afgifte cytochroom C (Figuur 7c) induceren. Detectie van verhoogde caspase 3/7 activiteit bewijs geleverd van apoptotische evenement bij blootstelling chroom. Oxidatieve stress inductie (ROS of GSH) werd ook gedetecteerd bij behandeling met 1-aminonaphtalene, Crotonaldehyde en fenol (figuur 7d, m, q). Tenslotte Arseen induceert celstress zoals blijkt uit de toegenomen fosforylering van de transcriptiefactor cJun (figuur 7g).
load / 53987 / 53987fig1.jpg "/>
Figuur 1. Verbinding Tox-Profiler workflow. A) Schema van de workflow ook in dit onderzoek. Eerst werd een dosis-range vinden met behulp van de RTCA platform om de juiste doses te selecteren voor de volgende HCS om de verbinding-specifieke toxiciteit profielen. B) experimentele opzet van de studie te karakteriseren. 24 uur na het zaaien, werden de cellen gedoseerd en impedantiewaarden continu bewaakt over de volgende 24 uur, terwijl de HCS-eindpunten werden onderzocht 4 en 24 uur na toediening. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. RTCA Exposure Plate. Compound meester plaat wordt eerst gegenereerd door het uitvoeren van een vijf stappen 01:10 seriële verdunning. Elke verbinding,waaronder de mediumcontrole (dosis 0) toegevoegd in drievoud aan de plaatbelichter met medium en Staurosporine als controles. Merk op dat de doses volgorde wordt gehandhaafd bij de overdracht, de hoogste doses zijn in rij nummer 1 terwijl de bedieningsorganen van het voertuig zijn in rij nummer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3. Representatieve resultaten RTCA levensvatbaarheid van de cellen. A) 1-aminonaphtalene, b) 2-nitropropaan, c) aceetamide, d) Aceton, e) acrylamide, f) Arseen (V), g) benzeen, h) Chroom (VI) , j) Crotonaldehyde, k) methylethylketon, l) Nickel (II), m) nitrobenzeen, n) fenol, o) chinoline p) Tolueen. Op 24 uur na dosering, oppervlak onder de curve (AUC) werd berekend voor elke dosis (inclusief positieve en medium) en genormaliseerd in een traject van 0 tot -100% activiteit (y-as), waarbij 0 weerspiegelt de activiteit van het voertuig en -100 van de positieve controle. Waarden werden vervolgens uitgezet en voorzien met een vier parameter Hill-vergelijking en, indien mogelijk, LD50 werd berekend. Concentraties worden uitgedrukt op een logaritmische schaal (x-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. Verwatering Regeling voor Positive Control verbindingen voor HCS Testen. A) Toevoeging van de positieve controles en vechine naar de seriële verdunning plaat. b) Seriële verdunning van de positieve controles. c) 200X positieve controles doses. de) verdunning van de 200x positieve controles doses in medium (01:40) naar de positieve controle plaat met de 5x doses te genereren. Merk op dat elke dosis wordt verdund in drievoud aan de uiteindelijke lay-out in de belichting plaat weer te geven). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5. HCS Exposure Plate. Compound meester plaat wordt eerst gegenereerd door het uitvoeren van een vijf stappen verdunning. Elke verbinding, omvattende het toezicht voertuig (dosis 0) toegevoegd in drievoud aan de plaatbelichter met de positieve controles. Merk op dat de doses orde wordt gehandhaafd bij de overdracht,hoogste doses zijn in rij nummer 1 terwijl de bedieningsorganen van het voertuig zijn in rij nummer 7. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6. Vertegenwoordiger Fluorescent Foto's van antilichaam of Dye-gekleurde cellen a) Nuclear parameters - Nucleaire kleurstof. Een permeabel kleurstof die bindt aan DNA in levende of gefixeerde cellen. Deze kleurstof wordt gebruikt om individuele cellen te labelen nucleair gebied identificeren b) Necrose - celmembraan permeabiliteit kleurstof. Dye-gebaseerde detectie van celmembraanintegriteit. Reagens intrinsiek ondoorlaatbaar celmembraan. Tijdens necrose, het membraan permeabel en de kleurstof gaat de cel en bindt aan DNA produceert sterke fluorescente s. ignal c) Apoptosis - Cytochroom C: Antilichaam-gebaseerde detectie van cytochroom C release, een bekend kenmerk van vroege apoptose. Bij inductie van apoptose wordt cytochroom c vrijgelaten uit de mitochondriën en diffundeert naar de kern d) DNA Damage - pH2AX:.. Antilichaam-gebaseerde detectie van fosforylatie van histon H2AX, een bekend kenmerk van dubbelstrengige DNA breuken e) Stress Kinase - cJun. antilichaam-gebaseerde detectie van fosforylatie van Ser-73 van cJun, een bekend kenmerk van cellulaire stress f) Oxidatieve stress - DHE: Dye gebaseerde detectie van superoxide radicalen. Dihydroethidium zelf fluoresceert blauw in het cytoplasma, terwijl de geoxideerde vorm ethidium fluoresceert rood op DNA intercalatie g) GSH - mBcl:. Dye-gebaseerde detectie van vrij GSH moleculen. mBcl reageert met GSH tegenereren van een sterk fluorescerend product h) Apoptosis - caspase 3/7 activering:. Dye-gebaseerde detectie van caspase 3/7 activiteit. Reagens niet fluorescerende met een vier aminozuur peptide dat remt DNA-binding. Bij caspase-3/7 activering wordt het peptide gesplitst waardoor de kleurstof aan DNA te binden en produceren een heldere, fluorogene reactie. Panels BH tonen positieve controle behandelde cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7. Representatieve resultaten HCS. 1-aminonaphtalene (ae), arseen (V) (f en g), chroom (VI) (HK), Crotonaldehyde (ln) en fenol (OQ). 4 uur (blauwe lijn) en24 uur (oranje lijn) signalen werden berekend voor elke dosis en genormaliseerd tot het voertuig activiteit (0%). Waarden die niet zijn opgenomen in de curve-fitting berekeningen worden grijs weergegeven. Concentraties worden uitgedrukt op een logaritmische schaal (x-as). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| analyse | Endpoint # | biologische eindpunt | cellulair compartiment | Output feature |
| cytotoxiciteit | 1 | Mitochondriale massa 6 | Cytoplasma | Spot gemiddelde oppervlakte |
| 2 | Mitochondriale membraanpotentiaal 6 | Cytoplasma | Spot gemiddelde intensiteit | |
| 3 | Cytochroom C vrijlating | Kern | gemiddeld intensiteit | | |
| 4 | Celmembraan permeabiliteit 8 | Kern | gemiddeld intensiteit | |
| DNA-schade | 5 | fosfo-H2AX 9 | Kern | gemiddeld intensiteit |
| Stress Kinase | 6 | fosfo-cJun 10 | Kern | gemiddeld intensiteit |
| ROS | 7 | ROS 11 | Kern | gemiddeld intensiteit |
| GSH inhoud | 8 | GSH 12 | Cytoplasma | Spot gemiddelde intensiteit |
| apoptose | 9 | Caspase 3 13 | Cytoplasma | Spot gemiddelde intensiteit |
Tabel 1. Lijst van HCS eenssays en eindpunten.
| Voertuig | RTCA doses (uM) | LD 50 | HCS doses | |||||||||||
| Cellevensvatbaarheid geselecteerd (uM) | 3R4F (nM) | |||||||||||||
| 1-Aminonaphtalene | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 280 uM | 2000 | 500 | 200 | 150 | 0.27 | |
| 2-nitropropaan | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| aceetamide | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Aceton | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| acrylamide | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Arseen (V) | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 160 uM | 200 | 100 | 50 | 25 | <td> 0,17||
| benzine | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Chroom (VI) | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 20 uM | 100 | 50 | 20 | 10 | 0.06 | |
| crotonaldehyde | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 200 uM | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2000 | |
| Methylethylketon | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | >20 mM | ||||||
| Nikkel | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| nitrobenzeen | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
| Fenol | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | 2300 uM | 5000 | 2000 | 1000 | 500 | 240 | |
| chinoline | EtOH | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 0.2 | > 20 mM | |||||||
| Tolueen | Water | 20.000 | 2000 | 200 | 20 | 2 | 0.2 | > 20 mM | ||||||
Tabel 2. Lijst van Getest HPHC Verbindingen met een relatieve LD 50 bij 24 uur van de behandeling. Verbindingen geselecteerd voor HCS analyse worden gemarkeerd in oranje en geteste doseringen worden ook gegeven. De dosis 3R4F komt overeen met de hoeveelheid van deze aanwezig is in de rook van een stok van de referentie sigaret 3R4F.
| analyse | samenstelling | voorraadoplossing | solvent Dosis (s) (uM) | |||
| cellevensvatbaarheid | staurosporine | 10 mM | DMSO | 50 | ||
| cytotoxiciteit | Valinomycin | 10 mM | DMSO | 50 | 20 | 5 |
| DNA-schade | paraquat | 100 mM | DMSO | 500 | 200 | 50 |
| Stress Kinase | anisomycin | 2 mM | DMSO | 10 | 4 | 1 |
| ROS | rotenon | 200 mM | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| GSH inhoud | etacrynezuur | 200 mM | DMSO | 1000 | 400 | 100 |
| apoptose | staurosporine | 40 mM | DMSO | 200 </ Td> | 50 | 20 |
Tabel 3. Lijst van positieve controles en gebruikte concentraties voor elke test.
Discussion
De behoefte aan alternatieven voor dierproeven en voor nieuwe high throughput testen benaderingen zijn uitvoerig besproken in de afgelopen jaren. Dit heeft ertoe geleid dat wetenschappers en regelgevende instanties om alternatieve methoden voor standaard testen van de toxiciteit, met behulp van cellulaire assays die nauw nabootsen de fysiologie van doelweefsels te onderzoeken. In deze studie hebben we de toepassing van een combinatie van een real-time cell analyzer (RTCA) met een hoog gehalte screening (HCS) platform om de effecten van blootstelling aan één CS bestanddelen menselijke longepitheelcellen beoordelen aangetoond. Deze opstelling kan analoog worden toegepast op cytotoxiciteit geïnduceerd door diverse andere zwevende stoffen, zwevende deeltjes en nanodeeltjes evalueren. Bovendien kunnen de verkregen resultaten worden vergeleken met die van hele genoom transcriptomics en computationele werkwijzen op basis van causale biologische netwerken. Zoals eerder gemeld, deze aanpak konden we gegevens over de moleculaire route bevestigenverstoring bij CS blootstelling 5 met HCS eindpunten, het aanpakken van deze route verstoringen ook fenotype.
Als een flowchart assay, real-time cel analyse geeft cel-levensvatbaarheid-gerelateerde informatie op een dosis- en tijdsafhankelijke resolutie, die een betere besluitvorming welke dosis en blootstelling tijdstip gunstig voor downstream-analyse 14 kan zijn toelaat. Het principe van de analyse is gebaseerd op veranderingen in elektrische impedantie die door de cellen als ze hechten en verspreid over een kweekputje oppervlak bedekt met een gouden micro-elektrode. De impedantie wordt omgezet in een dimensieloze parameter genaamd cel-index, die kan worden gebruikt om celadhesie te controleren, verspreiding, morfologie en uiteindelijk cellevensvatbaarheid. Hoewel deze techniek geen informatie over cytotoxische mechanismen, de gevoeligheid maakt detectie van morfologische cellulaire veranderingen, zelfs bij zeer lage doses waarbij de HCS niet informatief (gegevens niet getoond). Gebaseerd op Previlende experimenten, hebben we vastgesteld dat RTCA methode kan morfologische veranderingen bij lagere doses dan de HCS eindpunten detecteren.
Na de eerste screening van de real-time cell analyzer, werd een HCS platform gebruikt om meer gedetailleerde informatie over de aard van cytotoxiciteit opgewekt door elke HPHC krijgen. De HCS assay panel mag HPHCs profileren ten opzichte van hun potentiële impact op cellulaire compartimenten / organellen, alsmede aan die welke genotoxiciteit of oxidatieve stress te identificeren. Hierbij bleek verschillende profielen waarbij de geselecteerde HPHCs induceren cytotoxiciteit NHBE cellen. In het algemeen zijn de verbindingen, behalve fenol, bleken necrose bij de hoogste geteste dosis. Consistent met een potentiële rol in tumorigenese 1-aminonaphtalene geïnduceerde fosforylering van H2AX als een marker voor genotoxiciteit, maar de HCS paneel ook onbedekt activiteit van dit HPHC in de mitochondriale toxiciteit uitlezing (massa toe en cytochroom C release) en oxidatieve stress (GSH uitputting). Evenzo, zoals hiervoor beschreven, fenol werd geïdentificeerd als mitochondriale disfunctie veroorzaken en leiden tot DNA-schade en GSH uitputting. Chroom (VI), één van de verbindingen ingedeeld in groep I carcinogenen en Crotonaldehyde werden geïdentificeerd als zowel genotoxisch, met name chroom (VI) ook geïnduceerde apoptose (caspase cascade activering) en Crotonaldehyde veroorzaakt verhoogde ROS generatie. Tenslotte Arseen (V), bleek fosforylering cJun dat een merker van stress kinase pathway activatie induceren.
In deze studie hebben we gebruik gemaakt NHBE cellen als model voor long epitheelcellen in vitro. Met behulp van deze cellen in een HCS omgeving is ongekend en stelde het onderzoek van een breder scala van eindpunten, waaronder genotoxiciteit en oxidatieve stress markers. Zowel levende cellen en vaste cel kleuring methoden beschreven in onze protocollen demonstreren de flexibiliteit van de algehele techniek. in fact, kan precies dezelfde protocollen worden toegepast op een breder scala van doelstellingen die door het gebruik van een fluorescente kleurstof of antilichaam kan worden gericht. Voor het succesvol uitvoeren van de levende kleuringsprotocollen, is het belangrijk om de incubatietijd te respecteren, zoals sommige van de kleurstoffen hebben een beperkte halfwaardetijd en het fluorescentiesignaal afnemen vóór de beeldverwerving is voltooid. Het is ook belangrijk om te overwegen dat als een ander celtype wordt gebruikt, alle omstandigheden de kleuring opnieuw moet worden geëvalueerd, de optimale kleurstof concentratie en de incubatietijd kan verschillen.
In de huidige papieren hebben we een scenario waarin slechts vijf verbindingen waarbij gescreend met de HCS methodologie beschreven. Gezien de hiervoor beschreven plaatindeling, werden ze gedoseerd via 2 verschillende sets plaat voor een totaal van 24 platen (6 assays en 2 tijdstippen) .Het aantal platen kan ook worden verhoogd, waardoor het gelijktijdig screenen van verbindingen of meer de invesderzoek van meer eindpunten. Alvorens dit te doen, echter, moet men rekening mee houden dat bepaalde eindpunten (GSH en ROS) vereisen onmiddellijke overname, en als gevolg daarvan, moet de dosering van de platen worden uitgevoerd in een gespreide manier aan de overname van de vorige plaat mogelijk te maken. Anderzijds, met een vaste cel kleuring protocol vormt een voordeel als de platen kunnen worden gestapeld, onderbreken protocol naar elke stap na de fixatie, voor de voltooiing van de kleuring procedure later. Deze aanpak, bijvoorbeeld, zou de operator te voorzien van de tijd om alle levende cel kleuring platen te voltooien, zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens.
De workflow verder te optimaliseren door het verminderen van het aantal platen, zou het ook mogelijk zijn om meer eindpunten samen multiplexen. Bijvoorbeeld in deze context DNA Schade en Stress Kinase samen konden worden onderzocht eenvoudig met behulp van twee secundaire antilichaam met fluorochromen emitterende in verschillende channels. Continue ontwikkeling van de HCS-platform, waaronder volledig geautomatiseerde cel enten verbinding verdunning dosering en kleuring, evenals de toevoeging van nieuwe eindpunten zullen het vermogen van de HCS platform verder uitbreiden als een krachtig profiling instrument HPHCs op epitheel- en andere celtypen .
Disclosures
Alle auteurs zijn medewerkers van Philip Morris International. Philip Morris International is de enige bron van financiering en sponsor van dit project.
Acknowledgments
De auteurs willen graag karsta Luettich en Grégory Vuillaume bedanken voor hun herziening van het manuscript.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
- Rodgman, A., Perfetti, T. A. The chemical components of tobacco and tobacco smoke. , CRC Press. Boca Raton, FL. (2013).
- Russell, W. M. S., Burch, R. L. The Principles of Humane Experimental Technique. , Methuen, London. (1959).
- Zock, J. M. Applications of high content screening in life science research combinatorial chemistry & high throughput screening. Comb. Chem. High. Throughput. Screen. 132 (9), 870-876 (2009).
- US Food and Drug Administration. Harmful and potentially harmful constituents in tobacco products and tobacco smoke; established list, federal register. , 20034-20037 (2012).
- Gonzalez-Suarez, I. Systems Biology Approach for Evaluating the Biological Impact of Environmental Toxicants in Vitro. Chem. Res. Toxicol. 27 (3), 367-376 (2014).
- Camilleri-Broet, S., Vanderwerff, H., Caldwell, E., Hockenbery, D. Distinct alterations in mitochondrial mass and function characterize different models of apoptosis. Exp. Cell. Res. 239 (2), 277-292 (1998).
- Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates and apoptotic protease cascade. Cell. 91 (4), 479-489 (1997).
- Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. Double strand breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J. Biol. Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
- Westwick, J. K., Weitzel, C., Minden, A., Karin, M., Brenner, D. A. Tumor necrosis factor α stimulates AP-1 activity through prolonged activation of the c-jun kinase. J. Biol. Chem. 269 (42), 26396-26401 (1994).
- Bindokas, V. P., Jordán, J., Lee, C. C., Miller, R. J. Superoxide production in rat hippocampal neurons: selective imaging with hydroethidine. J. Neurosci. 16 (4), 1324-1336 (1996).
- Barhoumi, R., Bailey, R. H., Burghardt, R. C. Kinetic analysis of glutathione in anchored cells with monochlorobimane. J. Cytometry. 19 (3), 226-234 (1994).
- Huang, T. C., Lee, J. F., Chen, J. Y. Pardaxin an antimicrobial peptide, triggers caspase-dependent and ROS-mediated apoptosis in HT-1080 Cells. Mar. Drugs. 9 (10), 1995-2009 (2011).
- Bao, S., Knoell, D. L. Zinc modulates cytokine-induced lung epithelial cell barrier permeability. Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 291 (6), L1132-L1141 (2006).
- Xia, M., et al. Compound Cytotoxicity Profiling Using Quantitative High-Throughput Screening. Environ Health Perspect. 116 (3), 284-291 (2008).
