Abstract
담배 연기 (CS)은 심혈관 및 폐 질환의 주요 위험 인자이다. CS는 전반적인 독성 개별 구성 요소의 기여를 평가하기 위해 도전 1 7,000 개 이상의 화학 물질을 포함하는 복잡한 에어로졸이기 때문이다. 미국 식품의 약국에 의해 정의 된 개별 구성 요소뿐만 아니라 혼합물의 독성 프로파일 그러나, 관통 넣어 담배 연기의 유해 및 잠재적으로 유해한 구성 성분 (HPHCs)의 프로파일 링을 가능하게 선별 도구, 높은 적용하여, 시험관 내에서 설정 될 수있다 청 (FDA). (2)
초기 평가, 임피던스 기반 장비가 화합물의 독성을 실시간으로, 라벨없는 평가에 사용 하였다. 기기의 판독은 모두 함께 세포 상태의 개요를 제공하는 세포 접착, 생존 및 형태에 의존합니다. 셀 인덱스라는 차원 매개 변수는, 정량에 사용됩니다. DIF의 집합ferent 염색 프로토콜은 형광 이미징 기반 조사 개발 및 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다.
그들은 계산 가능한 LD 50 (<20 mm)를 등록 된 시험 15 성분 중 다섯은 HCS 기반 분석을 위해 선정되었다. 이들은 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드 및 페놀을 포함했다. HCS에 미치는 영향에 기초하여, 1 aminonaphtalene 페놀이 증가 히스톤 H2AX 인산화에 기초 유전 독성과 같은 크롬 (VI)와 함께, 미토콘드리아의 기능 장애를 유도하는 것으로 확인 될 수있다. 크로톤은 스트레스 키나아제 경로 활성제로서 산화 스트레스 유발 비소로 확인되었다.
본 연구는 임피던스 기반 HCS 기술의 조합 CS 성분의 시험 관내 평가를위한 강력한 수단을 제공한다는 것을 보여준다.
Introduction
독성 위험 평가는 역사적 생명 과학에 기초하지만, 또한 인간과 고비용으로 일관 번역 가능성 단점으로 연결되며, 동물 모델의 사용에 의존 하였다. 또한,는 "3RS"이 (대체, 감소 및 정제)의 정신에서 동물 실험의 대안을 찾을 수 증가 노력이 있었다. 이러한 노력은 지난 몇 년 동안 가속화되었다뿐만 아니라 때문에 특히 유럽 연합 (EU)의 높은 처리량 기술과뿐만 아니라, 때문에 동물 실험의 사용을 제한하는 법률의 시스템 생물학 접근 방식으로 최근의 진보,의.
욕설 독성에 대한 반응을 조절 세포 신호 전달 경로의 복잡성은 하나의 독성 엔드 포인트를 사용하여 특정 화합물의 독성 학적 근거를 설명하는 데 충분하지 않을 것이라는 것이 명백한다. 이를 위해 상호 P 수백 상호생물학적 네트워크에 기여 roteins도 고려 될 필요가있다. 이러한 네트워크에서 독성 물질의 효과를 연구하기 위해, 표현형 중간 및 높은 처리량 스크리닝 분석과 결합 시스템 독성 접근 역가를 추정 함과 동시에 각각의 독성 물질의 작용 기전에 대한 추가 정보를 제공하는 것이 유용하다.
본 연구에서는 취득 처리 및 특정 형광 기반 세포 분석으로부터 유도 된 화상 데이터를 분석 할 수있는 자동화 현미경 및 생물학적 소프트웨어 애플리케이션 구성되어 강력한 선별 도구으로 HCS를 사용. 이 단일 세포 또는 세포 내 수준에서 정량 셀 내의 시각적 인 변화를 허용하고, 다수의 파라미터가 동시에 분석한다. (3) 예를 들어, DNA 이중 가닥 나누기 히스톤 H2AX 인산화의 항체 - 기반 식별자를 사용하여 평가하고, 반응성 산소 종 (ROS)은 셀 파마하여 정량화eable 슈퍼 옥사이드 민감한 염료.
폐 상피 세포가 담배 연기를 포함하여 흡입 독성 물질,에 대해 첫 번째 생물학적 장벽을 나타 내기 때문에, 우리는 미국 식품의 약국 (FDA)에 의해 출판 HPHCs의 효과를 프로파일 체외 모델 1 차 기관지 상피 세포를 이용했다. 4이 원고의 후속이다 우리가 HPHCs의 다른 부분 집합의 생물학적 영향을 평가하는 이전의 연구 5 - 최대.
체외에서 세포 독성을 평가하는 워크 플로우의 일환으로, 우리는 처음에 우리가 다음 HCS에 적합한 용량 범위를 설정할 수 (RTCA) 시스템 임피던스 기반의 실시간 세포 분석을 사용하여, 15 HPHC의의 선택의 효능을 평가 분석 (그림 1). 다음 세포 독성 구 파라 메트릭 다중 엔드 포인트를 이용하여 수행 하였다 HCS 독성 평가는, 각각 두 개의 시점 (4 및 24 시간)에서 모니터. 표 1에 기재된 바와 같이 7 활성, 시토크롬 C 분리와 세포막 투과성 - 사용 된 마커는 미토콘드리아 독성, DNA 손상, 스트레스 키나아제 활성 산소 종 (ROS), 글루타치온 (GSH) 함량, 카스파 제 3 지시 하였다.
우리의 접근 가능 식별 및 투여 량 및 시간 의존적 샘플링 통해 담배 연기 성분의 효과의 특성화. 궁극적으로, 이것은 각 HPHC 대한 시험 관내 독성 프로파일을 만들었다. 멀티 오 믹스 방식은 상기 HCS 분석을 보완 할 수있다. 이것은 결국에는 세포 신호 및 / 또는 전사 수준에서의 효과의 깊은 이해를 제공한다.
Protocol
1. 수확 정상적인 인간의 기관지 상피 세포 (NHBEs)
- 예비 가온 세포 배양 배지 (기관지 상피 세포 성장 배지 보충 된 배지), 37 ℃에서 수조에서 HEPES, 트립신, 트립신 중화 용액 (TNS)에.
- 80 % 합류에 도달하면 세포 수확.
주 : 조건 시드 다음 NHBE 세포 배양 배지 20 ㎖ 코팅 T75 플라스크에서 최적의 합류를 획득하는데 사용될 수있다 :- 3 일간 배양 한 세포 × 106, 4 일 배양 용 0.5 × 106 세포와 5 일 배양 0.25 × 106 세포를 시드. 세포가 영양분을 새로 고침 문화에있을 때 2 일마다 중간 변경합니다. 배양 37 ℃에서 세포를 5 % CO 2.
- 플라스크 (들)에서 상층 액을 제거하고 세포를 씻어 HEPES를 추가 (예., 75 cm2로 플라스크 3 ㎖). HEPES 졸와 세포 단일 층을 충당하기 위해 각 플라스크를 회전의 ution.
- HEPES 솔루션을 제거하고 트립신 솔루션을 추가 (예., 75 cm2로 플라스크 3 ㎖). 트립신 용액으로 세포 단일 층을 포함하는 플라스크를 회전합니다.
- 37 ± 2 ℃에서 5 분 동안 플라스크를 품어. 현미경으로 세포의 분리를 모니터링하고 필요한 경우, 더 이상 품어 부드럽게 남아있는 부착 세포를 분리합니다 플라스크를 누릅니다.
- 반응을 정지 TNS 추가 (예., 75 cm2로 플라스크 3 mL) 및 15 ㎖의 튜브에 세포 현탁액을 전송.
- 5 분 동안 300 × g에서 세포 현탁액을 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 균일 한 세포 현탁액을 수득 부드럽게 혼합 한 새로운 배지 10ml에 세포 펠렛을 다시 일시.
- 세포 응집체를 제거하고 계산 100 μM 세포 여과기를 통하여 세포 현탁액을 필터. 주 : 실험실에서 전계 다중 채널 셀 카운팅 시스템은 정확하고 일관성 viabl을 평가 하였다전자 셀 번호입니다.
2. 실시간 세포 분석기 (RTCA)의 투여 량 범위 찾기 (DRF) 기반
주 : 1) 2)는 상기 화합물 선택 HCS에 의해 조사되도록, 화합물의 독성을 평가 3) HCS 적절한 투여 량을 선택 임피던스 기반 측정 시스템을 사용 하였다. RCTA 플레이트의 NHBE 세포를 각 웰에 100 ㎕의 배지에 존재하는 시험 화합물 희석액 25 μl를 첨가하여 투여한다. 따라서, 모든 시험 용액을 5 배 (배)을 원하는 최종 농도로 제조한다.
- 시드 NHBE 셀
- 임피던스 측정 횟수 및 기간을 정의하기 위해 기기를 프로그램. 이 연구에서, 데이터는 48 시간 동안 15 분마다 기록 하였다 (24 시간에서 ± 2 시간 전 및 시험 제제와 함께 세포를 투여 후 24 시간).
- 96 웰 RTCA 플레이트의 각 웰에 예열 배지 50 ㎕를 피펫 팅하여 플레이트 배경을 측정한다. 참고 :이 단계는 기술적 요구 사항을 나타냅니다악기를 위해 그 셀 기반 계산을위한베이스 라인 기준으로 사용되는 배지의 전기 저항을 산출한다.
- 50 μL가 / 웰의 배지 이미 구 배경 첨가되는 RTCA 플레이트의 각 웰 (7,200 세포 / 웰) 144,000 세포 / ㎖ (± 5 %)의 농도로 세포 현탁액을 준비하고, 50 ㎕의 세포 현탁액을 추가 측정.
- 세포 (세포의 균일 한 분포를 향상시키기 위하여)을 RTCA 크래들로 배치하기 전에 실온에서 30 분 동안 부착하자. 인큐베이터 (37 ℃, 5 % CO 2)에서 RTCA 크래들에 RTCA 판 부화 투여 전에 다음 24 ± 2 시간 동안의 데이터를 기록하기 시작한다.
- HPHCs 및 양성 대조군의 희석
- 긍정적 인 제어 희석
- 스타 우로 스포린 원액 DMSO (10 mM)을 1:10와 D의 5 μl를 추가 (표 3 참조) 희석매체의 195 μL에 ilution은 5 배 작업 용액을 얻었다.
- HPHC 희석
- / 녹이고 1 M 스톡 용액을 생성하도록 상기 차량 (표 2)의 각 HPHC 희석. 100 mM의 솔루션을 생성하는 매체에 각 HPHC 원액 1:10 희석.
- 5 배 작업 용액 (도 2)을 얻었다 배지 + 10 %의 차량을 이용하여 5 단계 1시 10분 일련의 희석을 수행하여 "마스터 화합물 판"을 생성한다. 참고 : 궁극적으로 최종 용량이 될 것입니다 : 0.2 μM, 2 μM, 20 μM, 0.2 밀리미터, 2 밀리미터, 20 밀리미터입니다. 또한,이 단계에서, 상기 단 차량에 대응 도즈 0을 준비한다.
- 분배
- RTCA 악기를 일시 정지 판을 제거 할 수있는 크래들을 엽니 다.
- 플레이트를 제거하고 외부 RTCA 실험 절차 동안 RTCA 플레이트의 온도를 안정화시키기 위해 설계된 RTCA 판 온도 도구 (에 배치역)는 임피던스 측정에 영향을 줄 수있는 세포를 피 냉각한다.
- (그림 2) (행 번호 7의 맨 윗줄 차량 제어에 가장 높은 용량)을 복합 마스터 판과 동일한 투여 순서를 유지 세중의 셀에 "화합물 마스터 판"에서 25 μl의 5 배 솔루션을 추가합니다. 기존 (100 μL) 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오.
- 기존의 배지를 제거하지 않고 아래 행 (반 오른쪽)의 셀에 25 μl의 5 배 긍정적 인 제어 솔루션을 추가합니다. 기존의 세포 배양 배지를 제거하지 않고 아래쪽 행 (하프 좌측)에있는 셀에 25 ㎕의 배지를 추가한다.
- 판 실러와 함께 접시를 밀봉합니다. 다시 RTCA 크래들에 접시를 놓고 잠급니다. 소망의 노출 시간에 대한 데이터의 기록을 다시 시작 (예., 24 시간). 참고 :이 봉지 필름의 사용은 잘 - 투 - 잘 교차 오염을 포함한 잠재적 인 오염을 방지하는 것이 좋습니다.
- <강한> 데이터 분석 RTCA와 LD (50) 계산
- 텍스트 (.txt)로 또는 Excel (.XLS) 파일로 내보내기 원시 데이터. 주 : 파일 플레이트 레이아웃 (화합물, 투여 잘 위치)에 관한 모든 정보를 포함 할 것이다. 원시 셀 인덱스 값은 96 웰 포맷 (미러 판 웰 분포)이 구성되고, 기록이 발생하는 때마다 포인트를 제공한다. 시간 t에서 96 웰 플레이트의 위치 I에서의 CI 값을 t (I)로 표시된다.
- 정규화으로 확인하고 96 웰 플레이트의 각 위치 내가 (에 대한 투여하기 전에 최신 시점을 참조 예를 들어, 셀 인덱스 23 시간 50 분 위치 전, CI의 t (I) = 23에서 00 초에서 50 : 00 = CI REF (I)). 주 : 투약을 수행 할 때이 정보는 주석 첨부되어야한다.
- 분할은 또한베이스의 정규화를 참조하여 각 시점 값은 투여시 모든 값을 정규화한다. 하여 위치 될에서 정규화 된 값NI는 시간 t에서 96 웰 플레이트에서의 NCI t (I)으로 표시되고, 따라서 모든 t에 대한 NCI의 t (I)의 CI = t (I) / CI REF (I)에 의해 정의된다.
- 24 시간의 곡선 (AUC) 아래의 면적을 계산 긍정적 인 제어 및 차량의 위치를 포함, (96 웰 플레이트에 위치 ⅰ) 각 샘플 난에 대한 사후 투여.
- 나는 각 사각형의 영역을 합산하여 얻어지는 위치에서 AUC를 확보,이 시점들 사이에있는 각각의 사각형은 t k에와 t 리터 (t K <t 리터)로 표시; X = t 리터로의 X * y를 사용하여 각 직사각형 영역을 계산 - t k는 두 시점들 및 Y 두 시점들 (Y = (NCI의 TK (I) + NCI의 TL (I))의 활성의 평균 인 사이의 거리 인 / 2).
참고 : AUC는 24 시간에 내가 AUC (I)로 표시되는 위치를 후 투여. 모든 조건을 삼중 웰에 플레이 팅 된 바와 같이 세 개의 값의 평균이 사용된다.
<리> 다음 식을 이용하여 값을 정규화 : - 나는 각 사각형의 영역을 합산하여 얻어지는 위치에서 AUC를 확보,이 시점들 사이에있는 각각의 사각형은 t k에와 t 리터 (t K <t 리터)로 표시; X = t 리터로의 X * y를 사용하여 각 직사각형 영역을 계산 - t k는 두 시점들 및 Y 두 시점들 (Y = (NCI의 TK (I) + NCI의 TL (I))의 활성의 평균 인 사이의 거리 인 / 2).
어디 AUC가 24 시간 후 투여에 계산하는 96 웰 플레이트에서의 위치는,
차량은 24 시간 후 투여에서 접시에 차량 우물의 AUC 값의 평균이다
양성 대조군은 24 시간 후 투여에서 접시에 긍정적 인 제어 우물의 AUC 값의 평균이다
CR은 차량 (0 %)에 대한 원하는 중간 정규화 값이고,
SC는 긍정적 인 컨트롤을 원하는 중간 정규화 된 값입니다 (-100 %)
주 :이 단계의 끝에서, 데이터 세트는 또한 I 및 그 대응 / 위치에 포함되는 시료에 적용된다 (로그 단위)를 96 웰 플레이트의 농도 (CI)에서의 각각의 위치 나 위해 포함되어 있음을 수득 24 시간이 AUC_normaliz을 후 투여에서 정규화 AUCED (I). - 플롯과 맞는 (난, AUC_normalized (i)는 C) 4 매개 변수 힐 방정식을 사용하여 -values. 가능하면, 또한 LD (50)을 계산한다.
여기서 Y = AUC_normalized,
시험 화합물의 농도가 0에서 제로 활동 S = 0 활동 수준,
무한 농도 무한 활동 S INF = 활동 수준,
활성이 최대 수준의 50 %에 도달하는 AC50 = 농도
힐 계수 N = AC50에서 기울기의 측정 및
용량 반응 곡선은 그래프의 X 축상의 값에 대응하는 로그 단위 C = 농도.
참고 : AC50은 LD 50 (세포 독성 분석)에 해당한다. 그것은 낮은 값이 높은 효능을 나타내는 힘의 척도이다.
- 긍정적 인 제어 희석
3. HCS에 의한 독성 효과 측정
참고 : 여섯 가지 분석에서 분류 독성의 구 멀티 파라미터 마커, 총은 HCS 플랫폼 (표 1)를 사용하여 측정한다. RTCA 세포 생존 분석 기준 (제 2), 각 성분의 투여 량 범위가 정의되고 3R4F 기준 용량도 포함한다. 기준 용량은 기준 담배 3R4F에서 한 스틱의 연기에 HPHC 존재하는 양에 해당합니다.
- 시드 NHBE 셀
- (12,000 세포 / 웰) 120,000 세포 / ㎖ (± 5 %)에서의 세포 현탁액을 제조하고, 96 웰 HCS 플레이트의 각 웰에 100 ㎕의 세포 현탁액을 추가한다. 모든 분석 (세포 독성, DNA 손상, 스트레스 키나제, ROS, GSH 함량 및 세포 사멸)과 시점들 (4 및 24 시간)의 평가를위한 충분한 접시를 준비합니다.
- 셀 웰에 부착 한 다음 3 부화 할 수 있도록 30 분 동안 실온에서 HCS 판 남기기7 ° C와 이전 투여에 24 ± 2 시간 동안 5 % CO 2.
- HCHPs 및 양성 대조군의 희석
주 : HCS 판의 NHBE 세포를 각 웰에 이미 존재하는 배지 100 ㎕를 시료 용액 25 μl를 첨가하여 투여한다. 따라서 모든 용량은 5 배 원하는 최종 농도로 제조된다.- 긍정적 인 컨트롤 희석 (긍정적 인 제어 플레이트)
- 각각 양성 대조군의 스톡 용액을 40 μL 분주 열 # 2 (도 4a, 붉은 음영 웰)에서 (표 3 참조). 열 # 3, # 5 (도 4a, 밝은 파란색 음영 우물) 및 열 # 4 차량의 40 μL (그림 4a, 밝은 파란색 음영 우물)에서 차량의 20 μl를 분배.
- 열 # 2에있는 우물에서 12 μl를 철회 열 # 3의 우물에 분배 혼합 (그림 4B)얻어진 각 양성 대조군 화합물 (도 4c) 3 투여 량 (D1, D2, 및 D3)와, 차량 (V)와 최종 직렬 희석 될 때까지 계속한다. 양성 대조군 플레이트를 생성하려면, 미디어 (그림 4D)의 화합물의 1시 40분 희석을 준비합니다.
- HPHC 희석 (화합물 마스터 플레이트)
참고 : HCS에 대한 HPHCs의 선택 용량 범위는 표 2에 나열되어 있습니다.- 100 mm의 농도에 대한 매체의 각 HPHC 주식 솔루션 (1 M) 1:10 희석. 각 HPHC 대해 선택된 5 배 용량을 얻기 위해 10 % 비히클 매체를 이용하여 희석을 수행한다.
- 긍정적 인 컨트롤 희석 (긍정적 인 제어 플레이트)
- 분배
- (그림 5) (행 번호 7의 맨 윗줄 차량 제어에 가장 높은 용량)을 복합 마스터 판과 동일 투여 순서를 유지 중으로 세포에 복합 마스터 플레이트에서 5 배 솔루션의 25 μl를 추가합니다. 전자를 제거하지 마십시오xisting (100 μL) 세포 배양 배지.
- 양성 대조군 플레이트 (도 5)와 동일한 투여 순서를 유지 하단 행의 셀에 양성 대조군 플레이트를 5 배 용액 25 μL를 추가한다. 기존 (100 μL) 세포 배양 배지를 제거하지 마십시오. 참고 : 각 분석은 특정 긍정적 인 제어 할 수있다; 표 3. 원하는 노출 시간 (4 또는 24 시간) 동안 37 ° C, 5 % CO 2의 판을 품어 참조하십시오.
- 더럽히는 것
- 모든 분석 실험을위한 준비
- 세척 버퍼 (PBS) 37 ° C에서 솔루션을 미리 따뜻하게.
- 37 ℃에서 세척 완충액 사전 따뜻하게의 89.19 10.81 ml를 가하여 37 %의 포름 알데히드를 첨가 고정 용액 (4 % 포름 알데히드 용액)을 준비한다.
- 37 ℃에서 세척 완충액 사전 따뜻하게 90 ml의 10 배 permeabilization 완충액 10 ㎖를 첨가하여 Permeabilization 버퍼를 준비한다.
- BLO 준비37 ° C에서 세척 버퍼와 사전 따뜻한 그것의 90 ml의 버퍼를 차단 10 배 10 ㎖를 추가하여 요리하는 버퍼.
- 37 ℃에서 세포 배양 배지를 미리 가온.
- 4 및 24 시간 노출 시간에 도달하면 인큐베이터에서 HCS 플레이트를 제거하고 각 분석에 대해 다음과 같은 특정 프로토콜을 수행합니다.
- 세포 독성 분석
- 다음 식에 따라 라이브 세포 얼룩 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 중간의 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 X (우물 W 번호) W
- 벤더의 지시에 따라 생균 염색 액에 미토콘드리아 염료 희석. 벤더의 지시에 따라 생균 염색 액의 막 투과성 염료 희석.
- "세포 독성 분석"지정된 플레이트 (들)의 각 웰에 50 μl의 라이브 세포 얼룩 솔루션을 추가합니다. 세포 배양 배지를 제거하고 37 ° C, 5 % CO에서 30 분 동안 배양 DO NOT
- 다음 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 플레이트 (들)를 부화 부드럽게 매체 염색 액을 흡인하고 각 웰에 고정 용액 100 ㎕ / 웰을 추가한다.
- 조심스럽게 고정 솔루션을 대기음 잘 버퍼를 씻어 / 100 ㎕를 한 번 씻는다.
- 세척 완충액을 제거한 후 각 웰에 100 μL / 웰 1X permeabilization 버퍼를 추가하고 어두운 곳에서 실온에서 10 분 동안 배양한다.
- 대기음 permeabilization 버퍼와 세척 접시 두 번 100 μL / 웰의 세척 버퍼입니다.
- 대기음는 버퍼를 각 웰에 1X 블로킹 완충액 100 ㎕를 추가하고, 어두운 곳에서 실온에서 15 분간 배양하고 세척 하였다.
- 다음 식에 따라 차 항체 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 버퍼 (μL) V 차단의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×. 항 - 시토크롬 C 항체 (마우스) (1) 희석 : 250 차 항체 용액에.
- 기음 버퍼 차단각 웰에 50 μL / 웰 차 항체 용액을 첨가하고, 어둠에서 실온에서 60 분 동안 배양 거라고.
- 다음 식에 따라 이차 항체와 핵 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 버퍼 (μL) V 차단의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×. 항 마우스 항체 (1) 희석 : 500 차 항체 및 핵 해결에. 핵 염료 1을 희석 : 1,000 이차 항체 및 핵 해결에.
- 기음 차 항체 솔루션 및 세척 판 (100) μL / 웰의 세척 버퍼가 접시 세척기를 사용하여 3 회.
- 대기음 완충액 50 μL / 웰의 이차 항체를 추가하고, 플레이트 (들)의 각 웰에 핵 용액 및 어둠 속에서 실온에서 60 분간 배양하고 세척 하였다.
- 기음 차 항체 및 핵 해결 및 세척 판 (100) μL / 웰의 세척 버퍼가 접시 세척기를 사용하여 3 회. 100 μL / 세척 버퍼의 잘을 추가합니다. 지금 플레이트 (들) (임)된다준비는 HCS 리더 평가한다.
- DNA의 손상 분석
- 조심스럽게 "DNA 손상을"지정 판에서 매체를 대기음.
- - 3.4.2.8 3.4.2.4을 : 서열과 동일한 단계를 수행한다. 이 경우에, 단지 중간 단계 3.4.2.4 동안 제거합니다.
- 다음 식에 따라 차 항체 용액의 충분한 부피 (V)를 제조 : 버퍼 블로킹 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 × (W의 웰 번호) W
- 안티 - 포스의 H2AX 항체 (마우스) 1을 희석 : 1 차 항체 솔루션에서 2,000.
- 3.4.2.10과 동일한 공정을 수행한다.
- 다음 화학식에 따른 이차 항체 및 핵 용액의 충분한 부피 (V)를 제조 : 버퍼 블로킹 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 × (W의 웰 번호) W
- 항 마우스 항체 (1) 희석 : 500 차 항체 및 핵 해결에.
- Nuclea 희석R 염료 1 차 항체 및 핵 해결에 1,000.
- 서열과 동일한 단계를 수행 3.4.2.12-3.4.2.14한다.
- 스트레스 키나제 분석
- 조심스럽게 "스트레스 키나제"를 지정 판의 각각의 매체를 대기음.
- - 3.4.2.8 3.4.2.4을 : 서열과 동일한 단계를 수행한다. 이 경우에, 단지 중간 단계 3.4.2.4 동안 제거합니다.
- 다음 식에 따라 차 항체 용액의 충분한 부피 (V)를 제조 : 버퍼 블로킹 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 × (W의 웰 번호) W
- 항 - 포스 포 cJun 항체 (토끼) 한 희석 : 200 차 항체 용액에.
- 3.4.2.10과 동일한 공정을 수행한다.
- 다음 화학식에 따른 이차 항체 및 핵 용액의 충분한 부피 (V)를 제조 : 버퍼 블로킹 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 × (W의 웰 번호) W
- 항 - 토끼 항체 (1) 희석 : 500 차 항체 및 핵 해결한다.
- 핵 염료 1을 희석 : 1,000 이차 항체 및 핵 해결에.
- 서열과 동일한 단계를 수행 3.4.2.12-3.4.2.14한다.
- ROS 분석
- 다음 식에 따라 라이브 세포 얼룩 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 중간 (μL) V의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×.
- 공급 업체의 지시에 따라 라이브 셀 얼룩 솔루션에서 ROS 염료를 희석
- 핵 염색 한 희석 : 1,000 라이브 셀 염색 Solution.3.4.5.4에서) "ROS를"지정된 각 웰 플레이트에 50 ㎕의 라이브 세포 얼룩 솔루션을 추가하는 단계; 세포 배양 배지를 제거하고 어두운 곳에서 실온에서 30 분 동안 배양 마십시오.
- 조심스럽게 매체와 염색 솔루션을 대기음 100 μL / 웰 매체 접시를 세 번 씻는다.
- _ (100)를 추가 매체를 기음6; l / 웰 고정 웰 각각 용액 및 어둠 속에서 실온에서 20 분 동안 플레이트를 배양한다.
- 조심스럽게 고정 솔루션을 대기음 잘 버퍼를 씻어 / 100 ㎕의 접시를 세 번 씻는다.
- 100 μL / 잘 씻어 버퍼를 추가합니다. 플레이트 (들) 준비가되었습니다 (이다).
- 1 시간 이내에 HCS 리더에 접시를 평가합니다.
- GSH 내용 분석
- 다음과 같은 공식에 따라 라이브 셀 핵 염색 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 중간 (μL) V의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×.
- 1000 라이브 세포 핵 염색 Solution.3.4.6.3에서) : 핵 염료 (파 레드) 1을 희석. "GSH 콘텐츠"를 지정 플레이트의 각 웰에 라이브 세포 핵 염색 용액 50 μl를 추가합니다. 세포 배양 배지를 제거하고 37 ° C, 5 % CO 2에서 30 분 동안 배양하지 마십시오.
- 에 따라 라이브 셀 GSH 염색 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비다음 식 : HBSS의 볼륨 (μL) V = 50 X 1.2 X (우물 W 번호) W
- 공급자의 지시에 따라 라이브 셀 GSH 염색 용액 중의 GSH 염료 희석.
- 조심스럽게 매체와 핵 염색 액을 기음 100 μL / 웰 매체 접시를 세 번 씻는다.
- 대기음 매체와 잘 플레이트 (들)을 각각 100 μL / 웰의 라이브 셀 GSH 염색 솔루션을 추가합니다.
- 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 인큐베이션. 플레이트 (들) 준비가되었습니다 (이다).
- 1 시간 이내에 HCS 리더 접시 (들)을 평가합니다.
- 세포 사멸 분석
- 다음 식에 따라 라이브 세포 얼룩 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 중간 (μL) V의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×.
- 카스파 염료 1을 희석 : 300 라이브 셀 염색 솔루션에.
- 세포 배양 배지를 제거 t의 각 웰에 50 μl의 라이브 세포 얼룩 솔루션을 추가그는 판 (들) "고사"지정, 37 ° C에서 30 분 동안 품어, 5 % CO 2.
- 다음과 같은 공식에 따라 라이브 셀 핵 염색 솔루션의 충분한 볼륨 (V)를 준비 : 수정 용액 (μL) V의 볼륨 = 50 x 폭 1.2 (우물 W의 수) ×.
- 핵 염료 1을 희석 : 1,000 라이브 세포 핵 염색 솔루션에.
- 라이브 세포 염색 용액을 제거 판 (들)의 각각의 웰에 100 μL / 웰의 살아있는 세포의 핵 염색 용액을 첨가하고, 어둠에서 실온에서 30 분 동안 배양한다.
- 정착액 / 핵 염료 솔루션을 대기음 및 세탁 판 (들) 100 μL / 잘 씻어 버퍼로 3 회.
- 100 μL / 잘 씻어 버퍼를 추가합니다. 플레이트 (들) 준비가되었습니다 (이다).
- HCS 리더 접시 (들)을 평가합니다.
- 모든 분석 실험을위한 준비
- 데이터 분석 HCS
- 엑셀 (.XLS) 파일로 내보내기 원시 데이터. 주 : 원시 셀 인덱스 값이 96 웰 형태로 구성되는(미러링 판 잘 분배)에서 주어진 시점 이후의 투여에 모든 엔드 포인트를 제공한다.
- 다음 식을 이용하여 값을 정규화 :
어디 잘의 측정 된 원시 신호 값이고,
차량은 접시에 차량 우물 측정 신호 값의 중앙값 인
CR은 차량 (0 %)에 대한 원하는 중간 정규화 값이고,
SC는 양성 대조군 (100)의 원하는 중간 정규화 값
주 :이 단계의 끝에서, 데이터 세트의 위치에 포함 된 시료에인가 된 96 웰 플레이트의 각 위치 I (로그 단위) 농도 C I 들면 포함 얻어 / 웰 I 및 해당 정규화 된 신호의 N (I)에 대응. - 플롯 및 피팅 (c를 I, N (I)) - 4- 파라미터 힐 방정식을 이용하여 값.
여기서 시험 화합물의 농도가 0에서 제로 활동 S = 0 활동 수준,
무한 농도 무한 활동 S INF = 활동 수준,
활성이 최대 수준의 50 %에 도달하는 AC50 = 농도
힐 계수 N = AC50에서 기울기의 측정 및
용량 반응 곡선은 그래프의 X 축상의 값에 대응하는 로그 단위 C = 농도.
참고 : AC50 낮은 값이 높은 효능을 나타내는 힘의 척도이다.
Representative Results
RTCA
독성 효과가 감지되지 않을 때 HCS 엔드 포인트가 유익하지 않기 때문에, 표시되지 화합물은 HCS (그림 3b, C, D, G, K, L, m에 의해 테스트되지 않은 RCTA에서 가장 높은 농도로 세포 생존 능력의 최대 감소 쪽). 화합물 보여주는 만 높은 농도에서 세포 생존 능력을 감소 (그림 3E는 오)도 HCS에 대한 선택이 취소됩니다. 마지막으로, 계산 가능한 LD 50 (<20 mM)을 가진 성분 만 더 HCS 분석 (도 3a, F, H, J, N)에 대해 선택된다. 위의 기준을 충족 HPHCs은 다음과 같습니다 : 1 aminonaphtalene, 비소 (V), 크롬 (VI), 크로톤 알데히드와 페놀.
HCS
품질 검사 (QC)으로, 양성 대조군은 파이입니다RST 정확하게 수행되는 오염 절차를 보장하기 위해 분석 하였다. 양성 대조군 처리 된 세포의 대표적인 이미지가도 6에 도시한다. 데이터 값은 상술 한 바와 같이 차량에 대해 정규화된다. 어떤 용량 - 반응 곡선은 세 가지 용량이 테스트로 그려되지 않고 모든 세 가지 용량마다 시간이 시점에서 고려하지. 적절한 반응은 4 시간에서 24 시간 모두에서 각 포인트에 대해 관찰되도록 양성 대조군 용량이 선택 (이전 실험에 기초하여, 데이터는 도시하지 않음). 특정 투여 량으로도 1 및도 2는 용량 (2, 3)은 24 시간의 효과를 평가하기 위해 사용되는 동안 4 시간의 효과를 평가하기 위해 사용된다. 응답이 양성 대조군 투약 관찰되지 않으면 플레이트는 파기된다. 미토콘드리아 막 전위 및 GSH 함량을 제외한 모든 엔드 포인트에 대한 신호 강도의 증대가 예상되고 있습니다.
페놀을 제외한 모든 화합물은,하는 괴사 pheno을 유도 유형 증가 세포막 투과성 (도 7a, F, H, L)에 기초하여. 1 aminonaphtalene, 크롬 (VI)을, 크로톤 알데히드 및 페놀 증가 히스톤 H2AX의 인산화 (도 7E, J, N, P)에 기초하여 유전 독성 인 것으로 확인되었다. 페놀과 1 aminonaphtalene은 심각한 미토콘드리아 기능 장애 1 aminonaphtalene으로 증가 시토크롬 C 릴리스 (그림 7C)되었다 (도 7b, 오)를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 증가 카스파 3/7 활동의 검출은 크롬 노출시 세포 사멸 사건의 증거를 제공했다. 산화 스트레스 유도 (ROS 또는 GSH)도 1 aminonaphtalene, 크로톤 알데히드와 페놀 (그림 7D, m, Q) 치료에 검출되었다. 전사 인자 cJun (도 7g)의 인산화 증가에 의해 입증 된 바와 같이 마지막으로, 비소 세포 스트레스를 유발한다.
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그림 1. 화합물 독극물-프로파일 러는 워크 플로우.가) 워크 플로우의 도식은이 연구에서 따랐다. 우선, 용량 범위 연구 결과는 후속 HCS는 화합물 특이 적 독성 프로파일. b) 연구 실험 설계를 특성화하기위한 적절한 투여 량을 선택 RTCA 플랫폼을 이용하여 수행 하였다. HCS 엔드 포인트는 4 조사하고 24 시간 투여 후. 한 반면, 24 시간 시딩 후, 세포를 투여하고, 임피던스 값은 계속해서 다음 24 시간 동안 모니터링 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 2 RTCA 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 1시 10분 일련의 희석을 수행하여 생성된다. 각 화합물,(용량 0) 차량 제어를 포함하는 다음 컨트롤과 같은 매체 및 스타 우로 스포린과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. 차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 순서가 전송에 유지되는 용량은 최고 용량은 행 번호 1 참고 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 3 주제 RTCA 세포 생존 결과. a) -1- aminonaphtalene, b) -2- 니트로 프로판, C) 아세트 아미드, d) 아세톤, E) 아크릴 아미드, F) 비소 (V), g) 벤젠, h)에 크롬 (VI) , j)의 크로톤 알데히드, k)를 메틸 에틸 케톤, L) NickeL (II), m) 니트로 벤젠, N) 페놀, O) 퀴놀린, P)을 톨루엔. 24 시간 후 투여에서, 곡선 (AUC) 아래의 면적은 0 내지 0의 활성을 반영 -100 % 활성 (Y 축)에 대한 범위 및 정규화 (양성 대조군 및 비히클 포함) 각 용량에 대해 계산 된 비히클 및 양성 대조군의 -100. 값들은 플롯하고 4- 파라미터 힐 방정식 가능한, LD (50)는 계산을 이용하여 부착 하였다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4. HCS 분석 실험에 대한 긍정적 인 제어 화합물에 대한 희석 계획. 긍정적 인 컨트롤) 추가 및했습니다시리얼 희석 판. b)는 양성 대조군 용액을 희석. c) 200X 양성 대조군 투약. DE) 배지 (1시 40분의 200X 양성 대조군 량의 희석)에 hicle는 5 배 용량을 포함하는 양성 대조군 플레이트를 생성한다. ) 각각의 투여가 노출 판의 최종 레이아웃을 반영하기 위해 삼중에 희석되어 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 HCS 노출 접시. 화합물 마스터 플레이트는 제 5 단계 희석을 행함으로써 생성된다. 차량 제어 각각 포함하는 화합물 (복용량 0) 후 양성 대조군과 함께 노광 판 중으로 첨가 하였다. , 복용량의 주문이 전달에 유지합니다차량 컨트롤이 행 번호 7에있는 동안 가장 높은 용량은 행 번호 1에있는 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
항체 또는 염료 염색 된 세포의 그림 6. 대표 형광 사진 A) 핵 매개 변수 - 핵 염료 :. 라이브 또는 고정 세포에서 DNA에 결합하는 투과 염료. 이 얼룩 핵 영역 라벨링 개별 셀을 식별하기 위해 사용된다 b) 괴사 - 세포막 투과성 염료 :. 세포막 무결성 염료 계 검출. 시약 세포막에 본질적으로 불 투과성이다. 괴사 동안, 멤브레인은 투과되고 염료 셀 들어가 강한 형광의 제조 DNA 결합. ignal C) 세포 사멸 - 사이토 크롬 C : 시토크롬 C의 출시 초기 세포 사멸의 잘 알려진 특징의 항체 기반의 탐지. 세포 사멸의 유도에 따라, 시토크롬 C는 미토콘드리아에서 해제되고 핵 D) DNA 손상에 확산 - pH2AX :.. 히스톤 H2AX의 인산화의 항체 기반의 탐지, 이중 가닥 DNA 나누기의 잘 알려진 특징 전자) 스트레스 키나제 - cJun :. 빼앗아-73 cJun의 세포 스트레스의 잘 알려진 특징에서 인산화의 항체 기반 탐지 f)의 산화 적 스트레스 - DHE : 슈퍼 옥사이드 라디칼의 염료 기반 탐지. . 무료 GSH 분자의 염료 기반 감지 : mBcl - 산화 된 형태의 에티 디움은 DNA 인터 g에 따라 빨간색 형광 동안 Dihydroethidium 자체는 GSH) 세포질에서 파란색 형광. mBcl는에 GSH와 반응. 카스파 제 3/7 활동의 염료 기반 감지 : 카스파 3/7 활성화 - 높은 형광 제품 시간) 세포 사멸을 생성합니다. 시약은 DNA 결합을 저해하는 네 개의 아미노산 펩티드와 비 형광등이다. 카스파 7분의 3 활성화되면, 펩티드는 DNA에 결합하여 밝은 형광 반응을 생성하기 위해 염료를 분해 가능하게되어있다. 패널은 긍정적 인 제어 처리 된 세포를 표시 BH. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7. 대표 HCS 결과. 1 aminonaphtalene (AE), 비소 (V)의 (f 및 g), 크롬 (VI) (홍콩), 크로톤 알데히드 (LN) 및 페놀 (OQ). 4 시간 (파란 선)과24 시간 (오렌지 라인)의 신호는 각각의 용량에 대해 계산 된 차량 활동 (0 %)로 정규화 하였다. 커브 피팅 계산에 포함되지 않은 값은 회색으로 표시됩니다. 농도를 로그 스케일 (x 축)에 표현된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 시험 | 엔드 포인트 # | 생물 엔드 포인트 | 셀룰러 구획 | 출력 기능 |
| 세포 독성 | 1 | 미토콘드리아 질량 (6) | 세포질 | 스팟 평균 면적 |
| 이 | 미토콘드리아 막 전위 (6) | 세포질 | 스팟 평균 강도 | |
| 삼 | 사이토 크롬 C 출시 | 핵 | 평균 강도 | | |
| 4 | 세포막 투과성 8 | 핵 | 평균 강도 | |
| DNA 손상 | (5) | 포스 H2AX 9 | 핵 | 평균 강도 |
| 스트레스 키나제 | 6 | 포스 cJun (10) | 핵 | 평균 강도 |
| ROS | (7) | ROS (11) | 핵 | 평균 강도 |
| GSH 콘텐츠 | 8 | GSH (12) | 세포질 | 스팟 평균 강도 |
| 세포 사멸 | 9 | 카스파 제 3 (13) | 세포질 | 스팟 평균 강도 |
HCS (a)의 표 1. 목록ssays 및 엔드 포인트.
| 차량 | RTCA 량 (μM) | LD (50) | HCS 량 | |||||||||||
| 세포 생존 선택 (μM) | 3R4F (㎚) | |||||||||||||
| 1 Aminonaphtalene | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | 280 μM | 2,000 | (500) | (200) | (150) | 0.27 | |
| 2- 니트로 프로판 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 아세트 아미드 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 아세톤 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 아크릴 아미드 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 비소 (V) | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | 160 μM | (200) | (100) | (50) | (25) | <TD> 0.17||
| 벤젠 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 크롬 (VI) | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | 20 μM | (100) | (50) | (20) | (10) | 0.06 | |
| 크로톤 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | 200 μM | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 2,000 | |
| 메틸 에틸 케톤 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | >20 mM의 | ||||||
| 니켈 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 니트로 벤젠 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
| 페놀 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | 2300 μM | 5,000 | 2,000 | 1,000 | (500) | (240) | |
| 퀴놀린 | EtOH로 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 0.2 | > 20 mM의 | |||||||
| 톨루엔 | 물 | 20000 | 2,000 | (200) | (20) | 이 | 0.2 | > 20 mM의 | ||||||
표 2. 치료의 24 시간에서 상대 LD (50) 테스트 HPHC 화합물의 목록입니다. HCS 분석을 위해 선택된 화합물은 주황색으로 강조하고 테스트 용량도 제공됩니다. 3R4F 용량은 기준 담배 3R4F에서 한 스틱의 연기 성분의 양은 동일합니다.
| 시험 | 화합물 | 원액 | 용제 투여 량 (들) (μM) | |||
| 세포 생존 | 스타 우로 스포린 | 10 mM의 | DMSO | (50) | ||
| 세포 독성 | 발리 노마 이신 (Valinomycin) | 10 mM의 | DMSO | (50) | (20) | (5) |
| DNA 손상 | 파라콰트 | 100 밀리미터 | DMSO | (500) | (200) | (50) |
| 스트레스 키나제 | 소마 이신 | 2 밀리미터 | DMSO | (10) | 4 | 1 |
| ROS | 로테 | 200 밀리미터 | DMSO | 1,000 | (400) | (100) |
| GSH 콘텐츠 | 에타 크린 산 | 200 밀리미터 | DMSO | 1,000 | (400) | (100) |
| 세포 사멸 | 스타 우로 스포린 | 40 mM의 | DMSO | 200 </ TD> | (50) | (20) |
각 분석에 사용 긍정적 인 통제와 농도 표 3. 목록.
Discussion
동물 실험의 대안에 대한 새로운 높은 처리량 테스트 방법에 대한 요구가 널리 지난 몇 년 동안 논의되어왔다. 이 밀접하게 표적 조직의 생리를 모방 세포 분석을 이용하여 표준 독성 시험에 대한 대체 방법을 조사하기 위해 과학자들과 규제 당국을 주도하고있다. 본 연구는 인간의 폐 상피 세포의 단일 CS 성분에 대한 노출의 영향을 평가하기 위해 고 함량의 스크리닝 (HCS) 플랫폼 실시간 세포 분석기 (RTCA)를 조합의 적용을 설명했다. 이 설정은 유사 각종 공기 오염, 부유 입자 및 나노 입자에 의해 유도 된 세포 독성을 평가하기 위해 적용될 수있다. 또한, 얻어진 결과는 인과 생물학적 네트워크에 기초하여 전체 게놈 transcriptomics 및 계산 방법의 것과 일치 할 수있다. 이전에보고 된 바와 같이,이 방법은 분자 경로에 대한 데이터를 확증하기 위해 우리를 허용HCS 엔드 포인트와 CS 노출 5시 섭동, 또한 표현형이 경로의 교란을 해결.
흐름도 분석으로 실시간 세포 분석 량과 노출 시점 하류 분석 (14)에 대한 바람직한 수있다 나은 의사 결정을 할 수있는 투여 량 및 시간 의존적 해상도에서 세포 생존과 관련된 정보를 제공한다. 분석기의 원리들은 금 미세 덮여 배양 웰의 표면 상에 부착 확산으로 세포에 의해 생성 된 온 저항의 변화에 의존한다. 임피던스 궁극적 형태 및 세포 생존, 확산, 세포 접착 성을 모니터링하는 데 사용할 수있는 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터로 변환된다. 이 기술은 세포 독성 기전에 대한 정보를 제공하지 않지만, 감도에도 HCS 유익하지 않은 아주 낮은 용량에서 세포 형태의 변화를 검출 가능하게 (데이터는 보이지 않음). previ을 바탕으로OU를 실험, 우리는 RTCA 방법은 HCS 엔드 포인트에 비해 낮은 용량에서 형태 학적 변화를 감지 할 수 있다고 지적했다.
실시간 세포 분석기 초기 스크리닝 다음하는 HCS 플랫폼은 각 HPHC 의해 유도 독성의 종류에 대한보다 상세한 정보를 얻기 위해 사용되었다. 세포 구획에 미치는 잠재적 인 영향으로 HPHCs을 프로파일 허용 HCS 분석 패널 / 세포 기관뿐만 아니라 유전 독성 또는 산화 스트레스를 유도 사람들을 식별하는. 분석은 선택 HPHCs가 NHBE 세포에서 세포 독성을 유도함으로써 서로 다른 프로파일을 밝혔다. 일반적으로, 모든 화합물은 페놀을 제외하고 가장 높은 시험 용량으로 괴사를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 잠재적 인 유전 독성에 대한 마커로 H2AX의 암 발생 1 aminonaphtalene에 의한 인산화의 역할, 그러나 미토콘드리아 독성 판독이 HPHC의도 폭로 활동 HCS 패널 (질량 증가 시토크롬 C의 relea과 일치SE) 및 산화 스트레스 (GSH 고갈). 전술 한 바와 마찬가지로, 페놀 미토콘드리아의 기능 장애를 유발하고, DNA 손상과 GSH의 고갈을 일으키는 것으로 밝혀졌다. 크롬 (VI), 그룹 I 발암 물질로 분류되는 화합물 중 하나, 및 크로톤은 모두 특히 크롬 (VI) 또한, 세포 사멸을 유도 (카스파 제 캐스케이드의 활성화) 및 크로톤에서 ROS 생성을 증가 야기 같은 유전 독성을 확인 하였다. 마지막으로 비소 (V)은, 스트레스 키나아제 경로의 활성화 마커 cJun 인산화를 유도하는 것으로 밝혀졌다.
본 연구는 시험관 내에서 상피 세포 폐암 모델로 NHBE 세포를 이용했다. HCS 설정에서이 세포를 사용하는 것은 전례가 및 유전 독성 및 산화 스트레스 마커를 포함하는 엔드 포인트의 넓은 범위의 조사를 활성화. 생균 고정 세포 염색 방법 모두 전반적인 기술의 유연성을 보여 우리 프로토콜에서 설명 하였다. F에서행위는, 아주 동일한 프로토콜은 형광 염료 또는 항체의 사용에 의해 해결 될 수있는 대상의 넓은 범위에 적용될 수있다. 라이브 염색 프로토콜을 성공적으로 실행하기 위해, 상기 염료 중 일부가 한정된 반감기와 화상 획득이 완료되기 전에 감소 할 수 형광 신호를 같이 배양 시간을 존중하는 것이 중요하다. 이는 다른 세포 유형이 사용되면, 모든 염색 조건에 최적의 염료 농도, 재평가되어야하며 배양 시간은 상이 할 수 있음을 고려하는 것도 중요하다.
현재 논문에서는 다섯 화합물은 HCS 방법으로 상영 시나리오를 설명했다. 전술 플레이트 배치를 고려하면, 그들은 이에 이상의 화합물 또는 동시 스크리닝 수 24 판 (6 세이 2 시간 점) 판 국지적 수는 증가 될 수있는 총 2 개 이상의 서로 다른 플레이트 세트를 투여했다 inves의이상의 엔드 포인트의 tigation. 그렇게하기에 앞서 하나의 특정 종점 (GSH 및 ROS)이 즉시 획득을 필요로하는 것이 고려되어야하고, 그 결과, 판의 투여 이전 판의 획득을 허용하는 지그재그 방식으로 수행되어야한다. 플레이트는 이후 단계에서 염색 절차를 완료하기 위해, 정착 후의 어떤 단계에서 프로토콜을 방해하는, 적층 될 수있는 반면에, 고정 된 세포 염색 프로토콜을 사용하는 장점을 나타낸다. 이러한 접근법은, 예를 들면, 데이터의 품질을 손상시키지 않고 모든 생균 착색 판을 작성하는 시간과 운전자에게 제공한다.
상기 판의 수를 감소시킴으로써 흐름을 최적화하기 위해, 또한 서로 이상의 엔드 포인트를 다중화하는 것이 가능하다. 이 상황에 맞는 DNA 손상과 스트레스의 예를 들어 키나제 다른 C에서 방출 형광 색소로 간단하게이 차 항체를 사용하여 함께 조사 할 수있다hannels. 연속 전자동 셀 시드 화합물 희석 투여 및 염색 포함하는 HCS 플랫폼의 개발뿐만 아니라, 새로운 엔드 포인트의 첨가는 또한 상피에 HPHCs 및 다른 유형의 세포에 대한 강력한 프로파일 링 툴로서 HCS 플랫폼의 기능을 확장 할 .
Disclosures
모든 저자 필립 모리스 인터내셔널의 직원입니다. 필립 모리스 인터내셔널은이 프로젝트의 자금 조달과 스폰서의 유일한 근원이다.
Acknowledgments
저자는 원고의 자신의 검토를 위해 Karsta Luettich과 그레고리 Vuillaume에게 감사의 말씀을 전합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
| xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
| Screener (HCS) | Genedata | NA | |
| CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
| e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
| RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
| RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
| Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
| Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
| BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
| ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
| Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
| Easy Flask filter cap 75 cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
| 96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
| Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
| Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
| Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
| ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
| ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
| ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
| GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
| GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
| Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
| Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
| Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
| Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
| Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
| Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
| Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
| 10x permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
| 4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
| 10x blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
| Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
| Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
| Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
| Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
| Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
| Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
| 1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
| 2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
| Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
| Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
| Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
| Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
| Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
| Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
| Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
| Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
| Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
| Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
| Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
| Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
| Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |
References
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