The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Sigarettrøyk (CS) er en viktig risikofaktor for hjerte- og lungesykdommer. Fordi CS er et komplekst aerosol som inneholder mer enn 7000 kjemikalier en det er utfordrende å vurdere bidragene fra den enkelte ingrediens til sin generelle toksisitet. Toksikologiske profiler av individuelle bestanddeler samt blandinger kan imidlertid etablert in vitro, ved å bruke høy gjennomstrømning screening verktøy, som gjør det mulig for profilering av skadelige og potensielt skadelige bestanddeler (HPHCs) av tobakksrøyk, som definert av US Food and Drug Administration (FDA). 2
For en innledende vurdering, ble en impedans basert instrument som brukes for en real-time, etikett-fri vurdering av forbindelsens toksisitet. Instrumentet avlesning er avhengig av celle adhesjon, levedyktighet og morfologi som sammen gir en oversikt over cellen status. En dimensjonsløs parameter, kalt celle index, blir brukt for kvantifisering. Et sett med diflige flekker protokoller ble utviklet for en fluorescens bildebehandling basert undersøkelse og en HCS plattformen ble brukt for å få mer detaljert informasjon om hva slags cytotoksisitet utløst av hver HPHC.
Av de 15 testede bestanddeler, bare fem ble valgt for HCS-baserte analyser som de er registrert, en Computable LD 50 (<20 mm). Disse inkluderte en-aminonaphtalene, arsen (V), krom (VI), Crotonaldehyde og Fenol. Basert på deres virkning i HCS, kan en-aminonaphtalene og Fenol bli identifisert til å indusere mitokondriell dysfunksjon, og, sammen med krom (VI) som genotoksiske basert på den økte histone H2AX fosforylering. Crotonaldehyde ble identifisert som en oksidativt stress indus og Arsen som en stress kinase vei aktivator.
Denne studien viser at en kombinasjon av impedans-baserte og HCS-teknologi gir et robust verktøy for in vitro-evaluering av CS bestanddeler.
Toksikologisk risikovurdering har historisk basert på bruk av dyremodeller som, selv om grunnleggende i biovitenskap, er også knyttet til mangler som inkonsekvent translatability til mennesker og høye kostnader. Videre har det vært en økende innsats for å finne alternativer til dyreforsøk i ånden av "The 3R" 2 (erstatning, reduksjon og raffinement). Dette arbeidet har blitt akselerert de siste årene, ikke bare på grunn av nylige fremskritt som high-throughput teknikker og systemer biologi tilnærminger, men også på grunn av lovgivning som begrenser bruken av dyreforsøk, spesielt i EU.
Kompleksiteten av cellulære signalveier som regulerer responsen på toksiske fornærmelser gjør det klart at ved hjelp av enkle toksikologiske endepunkter vil ikke være tilstrekkelig til å beskrive den toksikologiske grunnlag av visse forbindelser. For dette samspillet mellom hundrevis av samspill proteins som bidrar til et biologisk nettverk må også tas i betraktning. For å studere virkningen av giftstoffer på disse nettverkene, et system toksikologi tilnærming kombinert med fenotypiske middels- og high-throughput screening-analyser er nyttig for å utlede potenser og samtidig gi mer informasjon om virkningsmekanismen til de enkelte giftstoffer.
I denne studien benyttet vi HCS som et kraftig screeningverktøy, som er sammensatt av en automatisert mikroskop og et biologisk program, som kan skaffe, bearbeide og analysere bildedata som stammer fra bestemte fluorescens-basert cellulære tester. Dette gjør det mulig for visuelle endringer innenfor en celle som skal kvantifiseres, ved en enkelt celle eller subcellulære nivå, og mange parametere som skal analyseres samtidig. 3. For eksempel, ble DNA-dobbeltstrengbrudd evaluert ved anvendelse av en antistoffbasert identifikasjon av histon H2AX fosforylering og reaktive oksygenarter (ROS) ble kvantifisert ved anvendelse av en celle-permeable superoksid sensitive fargestoff.
Fordi lunge epitelceller representerer første biologisk barriere mot inhalerte miljøgifter, blant annet sigarettrøyk, benyttet vi primære bronkiale epitelceller som en in vitro modell for å profilere effekten av HPHCs utgitt av United States Food and Drug Administration. 4 Manuskriptet er en oppfølging -opp på en tidligere studie 5 der vi evaluerte den biologiske effekten av en annen undergruppe av HPHCs.
Som en del av vår arbeidsflyt for å vurdere cytotoksisitet in vitro, vi først evaluert potenser av et utvalg av 15 HPHC tallet, ved hjelp av en impedans-basert sanntids cellulær analyse (RTCA) system som tillater oss å etablere doseområder, egnet for etterfølgende HCS analyse (figur 1). En toksikologisk HCS vurderingen ble deretter utført ved hjelp av ni multi-paraendepunktene for cellulær toksisitet, hver overvåket på to tidspunkter (4 og 24 hr). Markørene som ble benyttet var en indikasjon på mitokondriell toksisitet, DNA-skade, stress-kinase, reaktive oksygenarter (ROS), glutation (GSH) -innhold, caspase 3 – 7-aktivitet, cytokrom C frigivelse og cellemembranen permeabilitet, som beskrevet i tabell 1.
Vår tilnærming aktivert identifikasjon og karakterisering av virkningen av sigarettrøk bestanddeler gjennom dose- og tidsavhengig sampling. Til syvende og sist, denne produsert en in vitro toksikologisk profil for hver HPHC. Multi-omics tilnærmingsmåter kan også brukes for ytterligere å utfylle HCS analyse. Dette vil til slutt også gi en dypere forståelse av virkningene på cellesignalisering og / eller transkripsjonsnivået.
Behovene for alternativer til dyreforsøk og for nye høy gjennomstrømning testing tilnærminger har vært mye diskutert de siste årene. Dette har ført forskere og myndigheter for å undersøke alternative metoder for standard toksisitetstesting, utnytte cellulære tester som tett etterligner fysiologi av målet vev. I denne studien har vi vist anvendbarheten av å kombinere en real-time celle analysator (RTCA) med et høyt innhold screening (HCS) plattform for å vurdere effekten av eksponering for enkelt CS bestanddeler på humane lunge epitelceller. Dette oppsettet kan være analogt brukes til å vurdere cytotoksisitet indusert av diverse andre luftbåren forurensing, luftbårne partikler og nanopartikler. Videre kan de oppnådde resultatene sammenliknes med de fra hel-genom transcriptomics og beregningsmetoder basert på årsaks biologiske nettverk. Som tidligere rapportert, denne tilnærmingen tillot oss å underbygge data på molekylær veiforstyrrelse på CS eksponering 5 med HCS endepunkter, ta opp disse pathway forstyrrelser også fenotypisk.
Som et flytdiagram analysen, gir sanntids celle analyse av cellenes levedyktighet relatert informasjon på en dose- og tidsavhengig oppløsning, noe som gir bedre beslutninger som dose og eksponeringstid punktet kan være fordelaktig for nedstrøms analyse 14. Prinsippet om analysatoren er avhengig av endringer i elektrisk impedans som dannes av cellene som de skal festes, og spredt på en kultur brønnoverflaten er dekket med et gull microelectrode. Impedansen blir omdannet til en dimensjonsløs parameter kalt celle-indeksen, som kan brukes til å overvåke celle adhesjon, spredning, morfologi og til slutt celleviabilitet. Selv om denne teknikken ikke gi informasjon om cytotoksiske mekanismer, muliggjør deteksjon av morfologiske celleforandringer selv ved svært lave doser ved hvilke HCS er ikke informativt dens følsomhet (data ikke vist). Basert på Previlige eksperimenter, har vi registrert at RTCA metodikken er i stand til å oppdage morfologiske endringer ved lavere doser sammenlignet med de HCS endepunkter.
Etter innledende screening med sanntids celle analysator, ble en HCS plattform brukes for å få mer detaljert informasjon om hva slags cytotoksisitet utløst av hver HPHC. HCS analysen panel lov til å profilere HPHCs mot deres potensielle innvirkning på cellulære avdelinger / organeller, samt å identifisere de som utløste gentoksisitet eller oksidativt stress. Analysen avdekket tydelige profiler der de valgte HPHCs induserer cytotoksisitet i NHBE celler. Generelt er alle forbindelser som, bortsett fra fenol, ble funnet å indusere nekrose ved den høyeste testede doser. I samsvar med en potensiell rolle i utviklingen av kreft 1-aminonaphtalene indusert fosforylering av H2AX som en markør for genotoksisitets- imidlertid HCS-panelet også avdekket aktivitet av denne HPHC i mitokondriell toksisitet avlesning (masse økes og cytokrom C releaSE) og oksidativt stress (GSH depletion). På samme måte som tidligere beskrevet, Fenol ble identifisert til å indusere mitokondriell dysfunksjon, og føre til DNA-skade, så vel som GSH uttømming. Krom (VI), en av forbindelsene klassifisert som gruppe I kreftfremkallende, og Crotonaldehyde ble også begge identifisert som genotoksiske, spesielt krom (VI) også apoptose (caspase kaskade aktivering) og Crotonaldehyde forårsaket øket ROS generasjon. Endelig arsen (V), ble funnet å indusere cJun fosforylering som er en markør for stress-kinasereaksjonsveien aktivering.
I denne studien, benyttet vi NHBE celler som en modell for lunge-epitelceller in vitro. Ved hjelp av disse cellene i en HCS innstillingen er enestående og aktivert etterforskningen av et bredere spekter av endepunkter, inkludert gentoksiske og oksidativt stress markører. Både levende celle og faste cellefarging tilnærminger ble beskrevet i våre protokoller, demonstrerer fleksibiliteten i den generelle teknikken. i fhandling, kan de samme protokoller påføres et bredere spekter av mål, som kan løses ved bruk av en hvilken som helst fluorescerende fargestoff eller antistoff. For en vellykket gjennomføring av de levende farge protokollene, er det viktig å respektere inkubasjonstid, som noen av de fargestoffer som har en begrenset halveringstid og fluorescens-signalet kan reduseres før bildeinnlastingen er fullført. Det er også viktig å tenke på at hvis en annen celletype som brukes, alle flekker forhold bør vurderes på nytt, da den optimale fargekonsentrasjons og inkubasjonstiden kan være forskjellig.
I dagens papir har vi beskrevet et scenario der kun fem forbindelser hvor screenet med HCS metodikk. Tatt i betraktning den tidligere beskrevne plate oppsettet, ble de dosert over 2 forskjellige platesett for en total av 24 plater (6-analyser og 2 tidspunkter) sikret antall plater kan også økes, for derved å tillate for samtidig screening av flere forbindelser eller de investigation av flere endepunkter. Før du gjør det, men bør man ta i betraktning at visse endepunkter (GSH og ROS) krever umiddelbar anskaffelse, og som en konsekvens, bør doseringen av platene skal utføres i en forskjøvet måte å tillate oppkjøpet av forrige plate. På den annen side, ved hjelp av en fast cellefarging protokoll representerer en fordel, da platene kan stables, avbryte protokollen ved hvilket som helst trinn etter fiksering, for gjennomføring av fargeprosedyre på et senere tidspunkt. Denne tilnærmingen, for eksempel, ville gi operatøren tid til å fullføre alle levende celle flekker plater uten at datakvalitet.
For ytterligere å optimalisere arbeidsflyt ved å redusere antall plater, ville det også være mulig å multiplekse flere endepunkter sammen. For eksempel i denne sammenheng DNA Damage og Stress kinase kan bli undersøkt sammen rett og slett å bruke to sekundære antistoff med fluorokromer emitting i annen channels. Kontinuerlig utvikling av HCS plattform, herunder fullt automatisert celle såing, forbindelsen fortynning, dosering og flekker, så vel som tilsetningen av nye endepunkter vil ytterligere utvide kapasiteten til HCS plattformen som en kraftig profilering verktøy for HPHCs for epitelisk og andre celletyper .
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker å takke Kårsta Luettich og Grégory Vuillaume for deres vurdering av manuskriptet.
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |