The objective of the study was to assess the biological impact of 15 cigarette smoke constituents using a combination of an impedance-based real time cell analyzer and a high-content screening (HCS)-based platform for toxicological assessment in vitro. This study provides information on effective doses, toxicity and modes of action of the tested compounds.
Сигаретный дым (CS) является основным фактором риска развития сердечно-сосудистых и легочных заболеваний. Поскольку CS представляет собой сложный аэрозоль , содержащий более 7000 химических веществ 1 она является сложной задачей , чтобы оценить вклад отдельных компонентов в своей общей токсичности. Токсикологические профили отдельных компонентов, а также смеси могут быть , однако установлено в лабораторных условиях , с применением высокой пропускной ставить скрининговых инструментов, которые позволяют профилирование вредных и потенциально вредных компонентов (HPHCs) табачного дыма, как это определено продуктами и лекарствами США (FDA). 2
Для первоначальной оценки, инструмент импеданса на основе использовался для реального времени, этикетки свободной оценки токсичности соединения в. Прибор считывания зависит от адгезии клеток, жизнеспособность и морфологию, что все вместе обеспечивают обзор состояния клеток. Безразмерный параметр, названный индекс ячейки, используется для количественной оценки. Набор дифпротоколы окрашивания гой был разработан для флуоресцентных изображений на основе расследования и HCS платформа была использована для получения более подробную информацию о виде цитотоксичности, вызываемой каждым HPHC.
Из 15 протестированных составных частей, были отобраны только пять для HCS на основе анализа , поскольку они зарегистрировали вычислимый LD 50 (<20 мм). К ним относятся 1-aminonaphtalene, мышьяк (V), хром (VI), Кротоновый и фенолов. На основании их эффекта в HCS, 1-aminonaphtalene и Фенол может быть идентифицирован, чтобы вызвать нарушение функции митохондрий, и, вместе с хром (VI), как генотоксичное основано на усилении гистона Н2АХ фосфорилирования. Кротоновый был идентифицирован как окислительного стресса индуктора и мышьяк в качестве пути активатора стресс-киназы.
Это исследование показывает , что сочетание импеданса на основе и из HCS технологий обеспечивает надежный инструмент для оценки в пробирке CS компонентов.
Токсикологическая оценка рисков исторически опиралась на использование животных моделей, которые, хотя и фундаментальна в науках о жизни, также связаны с недостатками, такие как непоследовательного переводимости для людей и высокой стоимостью. Кроме того, наблюдается увеличение усилий , чтобы найти альтернативы тестирования на животных в духе "The 3П" 2 (замена, восстановление, и уточнения). Эти усилия были ускорены в течение последних нескольких лет, а не только из-за последних достижений, таких как методы с высокой пропускной способностью и системной биологии подходов, но и из-за законодательства, ограничивающего использование испытаний на животных, особенно в Европейском Союзе.
Сложность клеточных сигнальных путей, регулирующих реакцию на токсичных инсультов делает очевидным, что использование одиночных токсикологическим не будет достаточно, чтобы описать токсикологическую основе определенных соединений. Для этого, взаимодействие сотен взаимодействующих рroteins, способствующие биологической сети также должны быть приняты во внимание. Для изучения влияния токсикантов на этих сетях, система токсикологии подход в сочетании с фенотипическими средне- и скрининговых анализов с высокой пропускной способностью полезно сделать вывод о потенции и в то же время предоставить более подробную информацию о механизме действия отдельных токсикантов.
В данном исследовании мы использовали HCS как мощный инструмент скрининга, который состоит из автоматизированного микроскопа и биологического применения программного обеспечения, которое может приобретать, обрабатывать и анализировать данные изображения, полученные из конкретных флуоресцентных на основе клеточных анализов. Это позволяет визуально изменения внутри ячейки должны быть определены количественно, в одной клетке или субклеточном уровне, и множество параметров , которые будут анализироваться одновременно. 3 , например, ДНК двухцепочечной разрывы были оценены с использованием идентификации на основе антител гистона Н2АХ фосфорилирования и активные формы кислорода (ROS) были определены количественно с использованием клеток-ПЕРМЬeable супероксид чувствительный краситель.
Из – за легкого эпителиальные клетки представляют собой первый биологический барьер против ингаляционных токсикантов, в том числе сигаретного дыма, мы использовали первичные бронхиальные эпителиальные клетки в качестве модели в пробирке для профилирования эффект HPHCs опубликованных по контролю за продуктами и лекарствами США. 4 Эта рукопись является продолжением -до на предыдущем исследовании 5 , в котором мы оценивали биологическое воздействие другого подмножества HPHCs.
В рамках нашего рабочего процесса для оценки цитотоксичности в лабораторных условиях , мы первоначально оценивали потенций выбор 15 HPHC, используя в режиме реального времени клеточного анализа импеданса на основе системы (RTCA) , что позволило нам установить доза-диапазоны, пригодные для последующего HCS анализ (рисунок 1). Токсикологическую оценку HCS затем была проведена с использованием девяти многопараметрических конечных точек клеточной токсичности, каждый контролируется в двух временных точках (4 и 24 ч), Маркеры , используемые свидетельствовали о митохондриальной токсичности, повреждения ДНК, стресс – киназы, активные формы кислорода (ROS), глутатион содержание (GSH), каспазы 3 – 7 активности цитохром с выпуском и проницаемости клеточных мембран, как описано в таблице 1.
Наш подход позволил идентификация и характеристика влияния сигаретного дыма через дозы и времени зависимой выборки. В конечном счете, это произвело токсикологический профиль в пробирке для каждого HPHC. Мульти-omics подходы также могут быть использованы для дальнейшего дополнить анализ HCS. Это, наконец, и обеспечить более глубокое понимание воздействия на клеточной сигнализации и / или транскрипционном уровне.
Потребности в альтернатив экспериментам на животных, а также для новых подходов к тестированию с высокой пропускной способностью широко обсуждались в течение последних лет. Это привело ученых и регулирующих органов, чтобы изучить альтернативные методы для стандартного тестирования токсичности, используя клеточные анализы, которые тесно имитирующие физиологии тканей-мишеней. В данном исследовании мы продемонстрировали применимость объединения анализатора клеток в режиме реального времени (RTCA) с высоким содержанием Скрининг (HCS) платформы для оценки последствий воздействия отдельных составных частей CS на клетки эпителия легкого человека. Эта установка может быть аналогично применены для оценки цитотоксичности, вызванной различными другими воздухе загрязняющих веществ, взвешенных в воздухе частиц и наночастиц. Кроме того, полученные результаты могут быть сопоставлены с теми, от всего генома транскриптомику и вычислительных методов, основанных на причинных биологических сетей. Как сообщалось ранее, этот подход позволил нам подтвердить данные о молекулярном путивозмущение по CS экспозиции 5 с HCS концами, обращаясь эти направления в возмущения также фенотипу.
В анализе блок – схемы, анализ в режиме реального времени клеток обеспечивает жизнеспособность клеток , связанных с информацией в дозы и времени зависит от разрешения, что позволяет лучше принятия решений , которые доза и время экспозиции точка может быть благоприятным для нисходящего анализа 14. Принцип работы анализатора основан на изменении электрического сопротивления, порожденного клетками, поскольку они придают и распространение на поверхности культуры хорошо покрыты золотой микроэлектродом. Импеданс преобразуется в безразмерный параметр с именем клеточно-индекс, который может быть использован для контроля адгезии клеток, распространяясь, морфологии и в конечном счете жизнеспособность клеток. Хотя этот метод не дает информации о цитотоксическими механизмами, его чувствительность позволяет обнаружить морфологических клеточных изменений, даже при очень низких дозах, при которых HCS не информативна (данные не показаны). На основе previленные эксперименты, мы заметили, что методология RTCA способна обнаружить морфологические изменения в более низких дозах по сравнению с HCS конечными точками.
После первоначального скрининга с анализатором в режиме реального времени ячейки, HCS платформа была использована для получения более подробную информацию о виде цитотоксичности, вызываемой каждым HPHC. HCS анализ позволил панель к профилю HPHCs в сторону их потенциального воздействия на клеточные компартменты / органеллы, а также для выявления тех, выявляя генотоксичность или оксидативный стресс. Проведенный анализ выявил различные профили в котором выбранные HPHCs индуцируют цитотоксичность в клетках NHBE. В общем, все соединения, за исключением того, фенолом, было обнаружено, вызывают некроз в самой высокой испытанной дозе. В соответствии с потенциальной роли в развитии рака 1-aminonaphtalene индуцированного фосфорилирования H2AX в качестве маркера для генотоксичности, однако HCS панель также непокрытой активность этого HPHC в считывании митохондриальной токсичности (масса увеличилась и цитохрома С releaSE) и окислительный стресс (истощение GSH). Точно так же, как было описано ранее, Фенол был идентифицирован, чтобы вызвать нарушение функции митохондрий, а также привести к повреждению ДНК, а также истощение GSH. Хром (VI), одно из соединений, классифицированных как группа I канцерогенов, и Кротоновый были также и идентифицированы как генотоксичное, в частности, хрома (VI) также индуцирует апоптоз (каспазы активации каскада) и Кротоновый вызвало увеличилось поколение ROS. Наконец мышьяк (V), было обнаружено, что индуцирует фосфорилирование cJun который является маркером активации пути стресс-киназы.
В этом исследовании мы использовали клетки NHBE в качестве модели для легких эпителиальных клеток в пробирке. С помощью этих клеток в условиях HCS является беспрецедентным и позволило исследование более широкого круга конечных точек, в том числе генотоксичности и окислительного стресса маркеров. Оба живой клетки и неподвижные подходы окрашивания клеток были описаны в наших протоколах, демонстрируя гибкость общей методики. В Fакт, те же самые протоколы могут быть применены к более широкому кругу задач, которые могут быть решены с использованием любого флуоресцентного красителя или антитела. За успешное выполнение протоколов живых окрашивания, важно соблюдать время инкубации, так как некоторые из красителей имеют ограниченный период полураспада и сигнал флуоресценции может уменьшаться до получения изображения завершена. Кроме того, важно учитывать, что, если используется другой тип клеток, все условия окрашивания должны быть пересмотрены, как концентрация оптимального красителя и времени инкубации может быть различной.
В настоящей работе мы описали сценарий, в котором только пять соединений, в которых скринингу с использованием методологии HCS. С учетом ранее описанной компоновки пластин, они были питателем более 2-х различных наборов пластин в общей сложности 24-луночных планшетах (6 анализов и 2 временные точки) .The количество пластин также может быть увеличена, тем самым позволяя для одновременного скрининга более соединений или в исдование более конечными точками. Перед этим, однако, следует принять во внимание, что определенные конечные точки (GSH и РОС) требуют немедленного приобретения, и, как следствие, дозирование пластин должны быть выполнены в шахматном порядке, чтобы обеспечить приобретение предыдущей пластины. С другой стороны, используя фиксированный протокол окрашивания клеток представляет собой преимущество, так как пластины могут быть уложены, прерывая протокол на любой стадии после фиксации, для завершения процедуры окрашивания на более поздней стадии. Такой подход, например, обеспечит оператору время для завершения всех живых окрашивания клеток пластины без ущерба для качества данных.
Для дальнейшей оптимизации рабочего процесса путем уменьшения количества пластин, также было бы возможно мультиплексирование более конечных точек вместе. Например, в этом контексте повреждения ДНК и стресс киназа можно исследовать вместе, просто используя две вторичные антитела с флюорохромами, испускающих в различных Channels. Непрерывное развитие HCS платформы, в том числе полностью автоматизированного посева клеток, разведения соединения, дозирования и окрашивания, а также добавление новых конечных точек будет способствовать дальнейшему расширению возможностей жилищно-коммунальной платформы как мощный инструмент профилирования для HPHCs на эпителиальные и других типов клеток ,
The authors have nothing to disclose.
Авторы хотели бы поблагодарить Карста Luettich и Grégory Вильом для их рассмотрения рукописи.
Cellomics ArrayScan VTI HCS Reader | Thermo | N01-0002B | |
xCelligence RTCA MP | ACEA | 05331625001 | |
Screener (HCS) | Genedata | NA | |
CASY counter TTC | Roche | 05 651 719 001 | |
e-Plates VIEW 96 | ACEA | 06 472 451 001 | |
RTCA Frame 96 | ACEA | 05232392001 | |
RTCA Cardio Temperature Tool | ACEA | 2801171 | |
Plate sealer breathseal | Greiner bio-one | 676051 | |
Normal Human Bronchial Epithelial cells (NHBE) | Lonza | CC-2540 | non-smoking 60-year-old Caucasian male donor |
BEGM BulletKit | Lonza | CC-3170 | Warm at 37 °C before use |
ReagentPack Subculture Reagents kit | Lonza | CC-5034 | Warm at 37 °C before use |
Penicillin/Streptomycin (100x) | Corning | 30-002-CI | |
Easy Flask filter cap 75cm2 | Thermo Scientific | 12-565-349 | |
96 well assay plate black | Corning | 3603 | |
Hoechst 33342 | Fisher Scientific | PI-62249 | |
Draq5 (For Far Red Nuclear Staining) | Biostatus | DR50200 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CMXRos | Life technologies | M-7512 | |
Mitochondrial Dye: MitoTracker Red CM-H2XRos | Life technologies | M-7513 | |
ROS Dye: Dihydroethidium | Sigma | D7008 | |
ROS Dye: CellROX | Life technologies | C10422 | |
ROS Dye: MitoSOX | Life technologies | M36008 | |
GSH Dye: Monochlorobimane | Sigma | 69899 | Toxic |
GSH Dye: Monobromobimane | Life technologies | M-1378 | Toxic |
Membrane permeability Dye: YO-PRO-1 | Life technologies | Y3603 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TO-PRO-1 | Life technologies | T3602 | Irritating |
Membrane permeability Dye: TOTO-1 | Life technologies | T3600 | Irritating |
Caspase Dye: Cellevent Caspase 3/7 green | Life technologies | C10423 | Irritating |
Anti-Cytochrome C antibody (Mouse) | Thermo | MA5-11823 | |
Anti-phospho-c-Jun antibody (Mouse) | Thermo | MA5-15889 | |
Anti-phospho-H2AX antibody (Mouse) | Thermo | MA1-2022 | |
Goat anti-Mouse IgG DyLight 650 | Abcam | ab96878 | |
10X permeabilization buffer | Fisher | 8408400 | |
4% Formaldehyde solution | Sigma | F1635 | Toxic |
10X blocking buffer | Fisher | 8408500 | |
Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline | Sigma | D8537 | |
Hanks' Balanced Salt solution | Sigma | H8264 | |
Staurosporine | Sigma | S4400 | Toxic |
Valinomycin | Sigma | V0627 | Toxic |
Paraquat | Sigma | 36541 | Toxic |
Anisomycin | Sigma | A9789 | Toxic |
Ethacrynic acid | Sigma | E4754 | Toxic |
1-Aminonaphthalene | Sigma | 34390 | Toxic |
2-Nitropropane | Sigma | 130265 | Toxic |
Acetamide | Sigma | 695122 | Toxic |
Acetone | Sigma | 650501 | Toxic |
Acrylamide | Sigma | A9099 | Toxic |
Arsenic (V) | Sigma | A6756 | Toxic |
Benzene | Sigma | 12540 | Toxic |
Chromium (VI) | Sigma | 216623 | Toxic |
Crotonaldehyde | Sigma | 262668 | Toxic |
Methyl ethyl ketone | Sigma | 34861 | Toxic |
Nickel | Sigma | 203866 | Toxic |
Nitrobenzene | Sigma | 48547 | Toxic |
Phenol | Sigma | P5566 | Toxic |
Quinoline | Sigma | 241571 | Toxic |
Toluene | Sigma | 34866 | Toxic |