Summary
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.
Protocol
Die UQAM Ethikkommission hat diese Protokolle genehmigt, die in Übereinstimmung mit den Richtlinien der Ethikkommission von St-Luc-Krankenhaus des Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Kanada) sind. Die Teilnehmer unterzeichneten eine Einwilligungserklärung.
1. Medium Herstellung und Isolierung von primären Villöse Cytotrophoblasten
- Bereiten Kulturmedium für menschliche primäre villous Zytotrophoblasten von Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM) mit 25 mM HEPES ergänzt, 10% Fetal Bovine Serum (FBS) und 1% Penicillin / Streptomycin. Filtern Sie das fertige Medium durch sterile 0,22-um-Filter und Speicher in einem -20 ° C Gefrierschrank in Aliquots von 50 ml.
- Isolieren primäre villous Cytotrophoblasten aus frischen Plazenten nach Standardprotokollen 3.
- Mit einer Zange, entfernen Sie die fötalen Membran aus dem Gewebe durch leichtes Kratzen aus, während man aufpassen, nicht Zottengewebe zu entfernen. Schneide dasRest Plazentazotten in Würfel von ca. 3 x 3 cm unter Verwendung von Skalpell und Schere. Gründlich mit Wasser waschen, die 0,9% NaCl mütterlichen Blut zu entfernen.
- jeden Würfel mit einer Zange festhalten und vorsichtig die Zottengewebe aus verbleibenden Schiffe und Fasergewebe mit einer Schere entfernen.
- 15 bis 30 mg Zottengewebe, verdauen viermal in Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) , enthaltend Trypsin (von 9,6 x 10 5 bis 1,8 x 10 & sup6 ; U; Endkonzentration 1,2 mg / ml) und Desoxyribonuclease I (DNase I) ( Endkonzentration 200 ug / ml) für 30 min bei 37 ° C in einem Wasserbad unter kontinuierlichem Schütteln inkubiert.
Hinweis: Verwenden Sie 150 ml Gesamtvolumen für die erste Verdauung, 100 ml für die zweite Verdauung und 75 ml für die beiden verbleibenden Aufschlüsse.
- Die überstehende Flüssigkeit enthält, dispergiert Zellen und Zentrifuge bei 1250 × g für 15 min ohne Bremse. Entfernen des Überstandes und Resuspendieren der Zellen in 1 ml vorgewärmtem DMEM, enthaltend1% Penicillin / Streptomycin.
- Schicht die dispergierten Zellen auf einem diskontinuierlichen 5% - 70% Polyvinylpyrrolidon beschichtetes Siliciumdioxid - Gradienten (siehe Tabelle 1 für Gradienten Vorbereitung) und Zentrifuge für 23 min bei 507 xg ohne Bremse. Entfernen Sie die Dichte Schicht zwischen 1,017-1,033 durch Absaugen und sammeln die Schichten zwischen 40% und 50% in der Steigung mit einer neuen Pipette. Waschen Zellen extensiv mit 10 ml vorgewärmtem DMEM, enthaltend 1% Penicillin / Streptomycin.
Hinweis: Die gesammelte Fraktion entspricht Dichten zwischen 1,048 und 1,062, die Trophoblasten birgt. - Zählen Sie die Zellen mit einer Zählkammer. Kurz gesagt, Zellen mischen und 10 & mgr; l in einem neuen Reaktionsgefäß hinzu. In 10 ul Trypanblau und mischen wieder sanft. Zeichnen Sie die Zellsuspension und füllen die Hemocytometer Kammern. Zählen Sie die Zellen unter 10X-Objektiv.
- Platzieren 1 x 10 6 und 4,5 x 10 6 Zellen in separate Röhren für die Verwendung in den Abschnitten 1.3 und 2, jeweilsly. Samen der verbleibenden Zellen in einer Dichte von 1,5 x 10 6 Zellen / Vertiefung in ergänztem DMEM - Medium und die Kultur bei 37 ° C und 5% CO 2 für maximal 4 Tage für andere Experimente.
- Mit einer Zange, entfernen Sie die fötalen Membran aus dem Gewebe durch leichtes Kratzen aus, während man aufpassen, nicht Zottengewebe zu entfernen. Schneide dasRest Plazentazotten in Würfel von ca. 3 x 3 cm unter Verwendung von Skalpell und Schere. Gründlich mit Wasser waschen, die 0,9% NaCl mütterlichen Blut zu entfernen.
- Bewertung der Reinheit der isolierten primären villous Cytotrophoblasten
- Spin 1 x 10 6 der frisch isolierten Zytotrophoblasten in Mikrozentrifugenröhrchen bei 300 x g. Überstand verwerfen und 1 ml vorgewärmtem phosphatgepufferter Salzlösung (PBS). Centrifuge Zellen bei 300 g und entfernen PBS durch Absaugen.
- 1 ml kaltem Methanol zu den Zellen und inkubiere bei -20 ° C für 20 min. Zentrifugen Zellen bei 300 xg für 5 min und Methanol durch Absaugen entfernen.
Achtung: Verwenden Sie Kanister Maske, Schutzbrille und Gummihandschuhe, während Umgang mit Methanol. - 1 ml PBS bei Raumtemperatur Zellen, Zentrifuge bei 300 g rehydrieren und entfernen PBS durch Absaugen.
- Inkubiere Zellen in PBS, enthaltend FBS (01.50 [v / v] Verdünnung) und einen FcRBlockierungsreagenz (1:10) für 45 min bei Raumtemperatur nicht-spezifische Bindung zu eliminieren.
- Zweimal waschen mit 500 ul Raumtemperatur PBS, Zentrifuge Zellen bei 300 g für 5 min und entfernen PBS durch Absaugen. Die Zellen in 100 & mgr; l Raumtemperatur PBS.
- Inkubiere Zellen mit einem monoklonalen Maus-Fluorescein-Isothiocyanat (FITC) -konjugiertem anti-human Cytokeratin-7-Antikörper-Klon LP5K (1: 200) oder ein Steuer Isotyp-nicht-spezifischen Antikörper in PBS 0,2% BSA für 45 min bei Raumtemperatur enthält, in die Dunkelheit. Waschen Zellen in PBS.
- Analyse der Zellen mittels Durchflusszytometrie 3. Verwenden Zellpräparationen, die mindestens 96% CK-7-positive Zellen mittels Durchflusszytometrie für weitere Experimente demonstrieren.
2. siRNA-Transfektion von primären humanen Villöse Cytotrophoblasten
- Die Transfektion von primären humanen villous Cytotrophoblasten eine Mikroporationseinrichtung mit
- Bereiten 6-well-Platten, enthaltend2 ml des ergänzten DMEM-Medium für die Inkubation von Zellen microporated.
- Nach der Isolierung von primären Cytotrophoblasten, nehmen Sie eine aliquote Menge von Zellen in Suspension (siehe Abschnitt 1.2) und die Zellzahl unter Verwendung einer Zählkammer bestimmen.
- Übertragen 1,5 x 10 6 Zellen in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur. Waschen der Zellen mit 1 ml Dulbeccos PBS (DPBS) (Mg 2+, Ca 2+ -frei) , und die Zellen durch Zentrifugation bei 300 xg für 5 min bei Raumtemperatur pelletieren.
- Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren die Zellen vorsichtig in 100 ul Resuspensionspuffers.
Hinweis: Vermeiden Zellsuspension länger als 15-30 Minuten bei Raumtemperatur gehalten wird, die Lebensfähigkeit der Zellen und die Transfektionseffizienz zu maximieren. - In 300 ng Syncytin-2 siRNA (oder Kontrollschlüsselten siRNA) in die 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und absaugen Zell-siRNA Mischung 100 ul Transfektion Pipette. Einfügendie Pipette in die Station (siehe Materialliste) und die Zellen zu einem 1300 V einzigen Impuls von 30 ms unterziehen.
- Sofort übertragen die Zellen zu Platten mit 6 Vertiefungen (hergestellt in Schritt 2.1.1), die 37 ° C vorgewärmten ergänztem Medium Zellschäden zu vermeiden.
- Wiederholen Sie die Schritte 2.1.5 und 2.1.6 für die restlichen Proben.
- Schütteln Sie die Platte für 30 Sekunden eine gleichmäßige Verteilung der Zellen zu gewährleisten. Inkubieren der Platte bei 37 ° C in einem befeuchteten CO 2 -Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Aktualisieren Kulturmedium 24 Stunden nach der Transfektion.
- Transfektionseffizienz durch Western-Blot-Analyse auswerten (siehe Schritte 3 bis 6).
- Lipofektion von siRNA in menschliche primäre Cytotrophoblasten
- Nach der Isolierung von Zotten - Zytotrophoblasten, die Zellen bei einer Dichte von 1,5 x 10 6 Zellen pro Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen in 2 ml Kulturmedium Saatgut und 18 Stunden inkubieren.
- Verdünnen 300 ng Syncytin-2-spezifische siRNA (oder SteuerschlüsseltensiRNA) und 5 ul Lipidbasis Transfektionsreagenz in getrennten 1,5 ml-Röhrchen in einem Gesamtvolumen von 10 ul antibiotika und serumfreien Medium. Inkubieren für 5 min.
- Mischen der verdünnten Reagenzien und Inkubation für weitere 20 min bei Raumtemperatur der Transfektionskomplex zu bilden. Hinzufügen 90 ul antibiotika und serumfreies Medium zur Mischung bis zu einem Endvolumen von 100 ul.
- Entfernen Kulturmedium von den Platten mit 6 Vertiefungen (Schritt 2.2.1). 2 ml frischem Medium und 100 & mgr; l Transfektionsgemisch zu jeder Vertiefung. Inkubieren der Zellen bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator für 24 bis 48 Stunden. Aktualisieren Kulturmedium 24 Stunden nach der Transfektion.
- Transfektionseffizienz durch Western-Blot-Analyse auswerten (siehe Schritte 3 bis 6).
3. Herstellung von Lysaten aus Vollzellkultur
- Entfernen Sie die Medien und spülen jede Vertiefung (aus den Schritten 2.1.8 und 2.2.4) unter Verwendung von vorgewärmten DPBS (Mg 2+, Ca 2+ frei). Saugen Sie das DPBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin / Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA). Inkubieren für 1-3 min bei 37 ° C in einem CO 2 -Inkubator. Stop Trypsin-Behandlung durch Zugabe von 500 & mgr; l serumhaltigen Nährmedien.
Hinweis: Verwenden Sie geeignete Datenträger nach der Art von Kolben / Schale: 1 ml pro 10 7 Zellen / 100 mm Schale / 150 cm 2 Kolben; 0,5 ml pro 5 x 10 6 Zellen / 60 mm - Schale / 75 cm 2 -Kolben. - Transfer-Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen, Pellets Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -frei) und Pellet Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur.
- Entfernen Sie vorsichtig Überstand, ohne das Pellet zu stören. Das Röhrchen auf Eis. Das Pellet in 50-200 ul eiskalter Radio Immunopräzipitation - Assay (RIPA) Puffer (Tabelle 2 für die Pufferzusammensetzung sehen) mit frisch hinzufügened-Protease und Phosphatase-Inhibitoren bei einer 1x Endkonzentration. Kurz gesagt, verwirbeln das Rohr und für 30 min auf Eis belassen.
- Spin bei 16.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Legen Sie das Röhrchen auf Eis. Mit einer Pipette den Überstand in ein frisches vorgekühlte Mikrozentrifugenröhrchen auf Eis gehalten. Entsorgen Sie das Pellet.
4. Herstellung von Kernextrakten aus kultivierten Zellen
- Für jede Vertiefung (Schritt 1.2.5), waschen kultiviert Cytotrophoblasten zweimal mit 1 ml vorgewärmtes DPBS (Mg 2+, Ca 2+ frei). Absaugen DPBS und fügen 500 ul 0,25% Trypsin / EDTA. Inkubieren für 1-3 min bei 37 ° C in einem CO 2 Inkubator und Trypsin - Behandlung zu stoppen durch Zugabe von 500 & mgr; l Serum , das Wachstumsmedium.
- Transfer-Zellen in ein 1,5 ml Mikrozentrifugen-Röhrchen, Pellets Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Zellen mit DPBS (Mg 2+, Ca 2+ -frei) und Pellet Zellen durch Zentrifugationbei 300 × g für 2 min bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig alle Überstand, ohne das Pellet zu stören und das Röhrchen auf Eis legen.
- Extrahieren Kernprotein nach den Anweisungen des Herstellers. Bestimmen der Proteinkonzentration jeder Probe unter Verwendung von Proteinquantifizierung Assay (Bradford oder Bicinchoninsäure (BCA)).
5. Probenvorbereitung und Elektrophorese
- Bestimmung der Proteinkonzentration für jeden Zellextrakt unter Verwendung eines Protein - Quantifizierungsassay (zB Bradford 8 oder 9 BCA).
- Gemäß den Anweisungen des Herstellers (wenn Antikörper in Reduktion und Denaturierung Bedingungen verwendet werden könnte), ein gleiches Volumen von 2 × Laemmli Probenpuffer (Tabelle 2) auf 20-30 & mgr; g Gesamtprotein.
- Boil Zelllysaten bei 100 ° C für 5 min. Aliquotieren 50-100 ul Lysat wiederholt Frost / Tau-Zyklen zu vermeiden, und speichern Sie die restlichen Röhrchen bei -20 ° C für die zukünftige Verwendung. Während die Proben erhitzt, bereiten 1 l 1x Laufpuffer (Tabelle 2).
- Drehen Sie die Proben bei 16.000 × g für ein paar Sekunden und legen Sie sie auf Eis.
- Last gleich Menge an Protein in jeder Vertiefung einer 12% SDS-PAGE - Gel (siehe Tabelle 2 für Gelzusammensetzung), zusammen mit einem Molekulargewichtsmarker. Führen des Gels über 1 bis 2 Stunden bei 100 V.
6. Übertragung des Proteins aus dem Gel auf die Membran
- Aktivieren Polyvinylidenfluorid (PVDF) -Membran mit Methanol für 1 min und Spülen mit 1x Transferpuffer / 10% Methanol-Lösung. Nach den Anweisungen des Herstellers, Transfer für 30 min bis 1 Stunde in Abhängigkeit von der Proteingröße.
Hinweis: Die Übertragungswirksamkeit beurteilt werden kann, mit Ponceau-Rot-Färbung vor dem Blockierungsschritt.
7. Antikörper-Färbung
- Blockieren die Membran für 1 Stunde bei Raumtemperatur oder über Nacht bei 4 ° C mit 5% Blockierungslösung.
- Inkubieren der Membran mit anti-Syncytin-2 - Antikörper (4 ug / ml; 1: 5.000) 6 oder mit anti-Glyceraldehyd-3-phosphat - Dehydrogenase (GAPDH; 0,4 & mgr; g / ml; 1: 500) in 5% Blockierungslösung über Nacht bei 4 ° C (anti-Syncytin-2) oder für 45 min bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Membran dreimal in Tris-gepufferter Saline Tween (TBST; siehe Tabelle 2 für die Pufferzusammensetzung) für 5 min.
- Inkubieren der Membran mit geeigneten Meerrettich-Peroxidase (HRP) -konjugiertem anti-Kaninchen- oder anti-Maus-Antikörper (1: 10.000) in 5% für 1 Stunde in TBST-Puffer bei Raumtemperatur blockiert. Waschen Sie die Membran dreimal in TBST für 5 min und dann in TBS spülen. Ermitteln Sie Signale, die die Chemilumineszenz-basierte Blotting Substrat verwendet wird.
8. Die radioaktive Markierung von Einzel Oligonukleotids
- Phosphorylierungsreaktion
- In einem Reaktionsgefäß werden 50 ng eines Forward-Oligonukleotid zusammen mit 1x T4 Polynukleotidkinase Puffer, 1 UT4 - Polynucleotidkinase und 20 & mgr; Ci (γ- 32 P) ATP und bilden das Reaktionsvolumen auf 20 ul mit Nuklease-freies Wasser.
- für 30 min bei 37 ° C inkubieren. Die Reaktion durch Zugabe von 5 ul 0,5 M EDTA. Machen Sie das Volumen auf 50 ul mit Nuklease-freies Wasser.
- Die Entfernung von nicht eingebauten Nukleotiden von Oligonukleotiden
- Bereiten einer G-25 - Säule , äquilibriert mit TE - Puffer (Tabelle 2) nach den Anweisungen des Herstellers. Die Säule in einem frischen DNase-freies 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen.
- Langsam 50 ul Sonde (aus Schritt 8.1.2) über das Harz, wobei darauf geachtet, nicht das Harzbett zu stören. Spin 2 min bei 350 xg das gereinigte Probe in 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen zu sammeln. Waschen Sie die G-25-Säule mit 36 ul Nuklease-freies Wasser und Spin 2 min bei 350 xg es im Reaktionsgefäß zu sammeln.
- Die Hybridisierung mit dem komplementären Strang oligonucleotide
- Übertragung der radiomarkierten Sonde (86 ul) in ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen und mit 200 ng des Reverse - Oligonukleotids und 1x Annealing - Puffer (Tabelle 2). Hitze 5 min bei 95 ° C und lässt über Nacht bei Raumtemperatur für die Kühlung.
- Vorbereitung nicht-radioaktive doppelsträngigen Oligonucleotide durch Zugabe von 50 ng unmarkierter Vorwärts- und Rückwärts Oligonukleotiden und 1x von Anelierungspuffer in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Machen Sie das Volumen auf 100 ul mit Nuklease-freies Wasser. Wärme und halten bei Raumtemperatur, wie in Schritt 8.3.1 beschrieben.
9. Herstellung eines nicht-denaturierendes Polyacrylamidgel für EMSA
- Bereiten Sie eine 4% nativen Gel (10 x 12 cm) mit einem 1,5 mm platz Kamm (Tabelle 2 für Gelzusammensetzung sehen). Reinigen Sie alle Glasplatten mit destilliertem Wasser.
Hinweis: Es ist wichtig, daß die Platten aus ionischen Detergens vollständig frei sein, wie SDS. - unmittelbar punsere die Acrylamidlösung in zwischen den Platten und erlauben Polymerisation (ca. 30 min), um fortzufahren.
- Montieren Sie die Elektrophorese-Vorrichtung und füllen den Tank mit 0,5x TBE. das Gel für 30 Minuten bis 1 Stunde bei 150 V Vor dem Probenvorlauf.
10. DNA-Bindungsreaktion
- In einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen, mit 10 ug Kernextrakt (Schritt 4.3) 1x Gel Shift Bindungspuffer (Tabelle 2) und das Endvolumen auf 10 ul mit Nuklease-freiem Wasser bilden. Als Kontrolle wurde ein Rohr ohne Kernextrakt herzustellen. Für die kompetitive Reaktion nach Zugabe von 1 & mgr; l kaltem unspezifischen oder spezifischen doppelsträngigen Oligonukleotids (Schritt 8.3.2).
- In 1 ul radioaktive Sonde aus Schritt 8.3.1 zu jeder Reaktion. Inkubieren der Reaktion bei Raumtemperatur für 20 min. In 1 ul 10x Gelladepuffer pro Reaktion und laden jede Probe auf dem in Abschnitt vorbereitet Gel 9.
- Führen Sie das Gel für 1 1/2 bis 2 Stunden bei 150 V. Nach der Migration, wickeln Sie das Gel und das Glas in einer Plastikfolie und Position in einer Belichtungskassette unter einen Phosphorschirm. Verlassen Kassette bei 4 ° C für 24 Std.
- Entfernen Sie den Bildschirm von der Belichtungskassette und legen Sie in der Phosphor-Bildgerät zum Scannen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Frische Plazenten von Begriff Schwangerschaften wurden verwendet, um menschliche primäre villous Cytotrophoblasten zu isolieren, die Reihe von Experimenten im Protokoll Abschnitt vorgestellt zu leiten. Nach ihrer Trennung analysierten wir zunächst die Reinheit des Cytotrophoblasten durch die Verwendung des Cytokeratin-7 - Marker (Abbildung 1). Zellpräparate wurden so gefärbt einen monoklonalen anti-Cytokeratin-7 - Antikörper verwendet wird . Abbildung 1 ergibt sich aus einem typischen Experiment stellt der primären villous Cytotrophoblasten nach der Reinigung, Zytometrie durch Standardfluss analysiert. Nach dem Dichtegradienten Schritt> 97% der Zellen (in diesem Fall 99%) für Cytokeratin-7 in Standardexperimenten positiv gefärbt, was einen sehr hohen Wirkungsgrad bei der Reinigung dieses Zelltyps zeigt.
Nach der Isolierung können menschliche primäre Cytotrophoblasten direkt für tra verwendet werdennsfection. Zwei unterschiedliche Protokolle wurden ausgewertet, dh, Mikroporation und lipidbasierte Transfektion. Beide Protokolle wurden mit siRNA spezifisch für Syncytin-2-mRNA getestet und im Vergleich zu einem verwürfelten siRNA (negative Kontrolle). Die Transfektionseffizienz wurde als nächstes durch Western-Blot-Analyse ausgewertet. Die Ergebnisse bestätigten , dass Syncytin-2 - Expression signifikant in Cytotrophoblast abgeleitete Extrakte auf Mikroporierung (Abbildung 2) zum Schweigen gebracht wurde. Auf der anderen Seite wurde keine signifikante silencing festgestellt, wenn siRNAs durch die Lipidbasis Transfektionsreagenz transfiziert wurden.
Wir haben auch EMSA Experimente an frisch isolierten Cytotrophoblasten. Eine radiomarkierte Sonde, die von einem Syncytin-2-Promotor-Region stammt, wurde synthetisiert. Die synthetisierte Sonde (WT bezeichnet; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') wurde CREB bezogenen Transkriptionsfaktoren zu binden , die zuvor 7 gezeigt. In Gegenwart von Kern extr Handlungen von 24 und 48 h kultiviert villöse Zytotrophoblasten zeigte die Syncytin-2-Promotor-abgeleitete Sonde, die die Anwesenheit von zwei DNA-Protein-Komplexe. Zugabe von kaltem 100x WT Oligonucleotid konkurrierten um die Bildung des Komplexes, während keine ähnlichen Konkurrenz mit überschüssigem eines kalten nicht verwandten Oligonucleotid (Maus Neuralleiste Enhancer 2; 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') beobachtet wurde, bestätigt die Spezifität der beiden Signale ( Abbildung 3).
Abbildung 1. Beurteilung der Reinheit des primären villous Cytotrophoblasten durch Durchflusszytometrie. Frisch isolierte Präparate von Villi Cytotrophoblasten wurden zuerst permeabilisiert und dann mit Isotypkontrollantikörper (rote Linie) oder monoklonale Antikörper , der spezifisch für Cytokeratin-7 (schwarze Linie) markiert. Die Zellen wurden mittels Durchflusszytometrie analysiert. les / ftp_upload / 53995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Vergleich von siRNA Transfektionseffizienzen zwischen Lipid-basierte Transfektion und Mikroporierung. Frisch isolierte villous Cytotrophoblasten wurden mit 300 ng Syncytin-2-spezifischen transfizierten siRNA gegen ein gestörtes Kontroll - siRNA unter Verwendung der Lipid-basierten Reagens oder Mikroporierung. (A) Western - Blot - Analysen wurden auf Zellextrakten aus jeder Transfektion Bedingung durchgeführt , unter Verwendung von Anti-Syncytin-2 und anti-GAPDH - Antikörper. (B) Syncytin-2 - Proteinspiegel von Western - Blot - Analysen wurden in Bezug auf die Bandintensität folgende Normalisierung quantifiziert mit GAPDH Signalen entsprechen (Fehlerbalken werden als SD definiert, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Figur 3. DNA-Protein - Komplexe durch EMSA - Analyse identifiziert. Kernextrakte aus primären villöse Zytotrophoblasten für 24 oder 48 Stunden wurden mit einer Sonde entsprechenden WT inkubiert einer Promotorregion von Syncytin-2 mit oder ohne Überschuß (100 - fach) spezifische oder unspezifische Kälte-Oligonukleotide. DNA-Protein-Komplexe wurden bei der Migration auf einem nativen Gel aufgetrennt. Spezifische Signale und freien Sonden sind auf der rechten Seite des Gels angegeben. WT-Sonde in Abwesenheit von Kernextrakt inkubiert wurde ebenfalls als negative Kontrolle verwendet. CT NE = Cytotrophoblast Kernextrakten. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| % Percoll Finale | Volumen von Percoll (90%) (ml) | Volumen HBSS (ml) |
| 70 | 2.33 | 0,67 |
| 65 | 2.17 | 0,83 |
| 60 | 2.00 | 1,00 |
| 55 | 1,83 | 1.17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1.50 | 1.50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1.17 | 1,83 |
| 30 | 1,00 | 2.00 |
| 25 | 0,83 | 2.17 |
| 20 | 0,67 | 2.33 |
| 15 | 0,50 | 2,50 |
| 10 | 0,33 | 2,67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Tabelle 1 : 5% bis 70% Polyvinylpyrrolidon beschichtete Silica - Gradienten - Einstellung.
| Puffer | Zusammensetzung | Kommentare / Beschreibung |
| PBS 1x | 0,9 mM CaCl 2, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM MgCl 2, 136,9 mM NaCl und 0,8 mM Na 2 HPO 4 | |
| RIPA-Puffer | 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 oder 0,1% Triton X-100, 0,5% Natriumdesoxycholat, 0,1% SDS (Natriumdodecylsulfat), 50 mM Tris-HCl pH 8,0 | |
| Laemmli Probenpuffer | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% Glycerin, 0,004% Bromphenolblau, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x Laufpuffer | 25 mM Tris-Base, 190 mM Glycin, 0,1% SDS | |
| 10x Transferpuffer | 25 mM Tris-Base, 192 mM Glycin | |
| TBST 1x Puffer | 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 bei pH 7 | Gut mischen und filtern. Nicht Filter kann auf "Spek" der Membran führen. |
| Blockierungspuffer | 5% Milch oder BSA (Rinderserumalbumin) zugesetzt 1x Puffer TBST | |
| TE-Puffer | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA | |
| Annealing-Puffer | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl 2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| 5x Gel Shift Buffer Binding | 20% glycerol, 5 mM MgCl 2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) und 0,25 mg / ml Poly (dI-dC). | |
| Ladepuffer | 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% Bromphenolblau und 40% Glycerin | |
| TBE 5x | Man löst 54 g Tris-Base und 27,5 g Borsäure in 1 l VE-Wasser, das 20 ml 0,5 M EDTA enthält, pH 8 | |
| 4% nativen Gel | TBE 5x Puffer | 6,0 ml |
| 29: 1 Acrylamid / Bisacrylamid (30% w / v) | 10 ml | |
| 40% Acrylamid (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% Glycerol | 1,5 ml | |
| Destilliertes Wasser | 41,5 ml | |
| Ammoniumpersulfat: 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacking Gel (6 ml) für SDS-PAGE | ddH 2 O | 4,1 ml |
| 30% Acrylamide | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 & mgr; l | |
| 10% APS | 60 & mgr; l | |
| TEMED | 6 ul | |
| 12% Trenngel (10 ml) für SDS-PAGE | ddH 2 O | 3,3 ml |
| 30% Acrylamide | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 ul | |
| 10% APS | 100ul | |
| TEMED | 4 ul |
Tabelle 2. Zusammensetzung der Puffer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studien über die menschliche Plazentafunktion und Entwicklung wurden durch Protokolle stark verbessert bei der Optimierung Isolierung verschiedener Plazenta-Zellpopulationen gerichtet. Eines der besten erforschten Plazenta Zellpopulation bleibt die Villi Cytotrophoblasten, die Studie davon aus optimierte Protokolle ermöglicht eine effiziente und zuverlässige Isolation stark profitiert hat. Dies hat ferner eine Anzahl von Experimenten, wie Transfektion und Promotorstudien erlaubt. Unter Verwendung eines zuvor beschriebenen Protokolls 3, reine Populationen von primären villöse Zytotrophoblasten erhalten werden. CK-7 ist ein Zwischen Filament-Protein, das in Zytotrophoblasten exprimiert wird. Monoklonale Antikörper gegen dieses Protein verwendet , um die Reinheit dieses Trophoblasten Population nach ihrer Isolierung aus der Plazenta 10 zu bestimmen. Die Vorbereitungen sind definiert rein zu sein, wenn 96% der Zellen positiv sind für CK-7. Zellen können anschließend direkt zur Transfektion verwendet werden. TransfektionsprotokolleLipid-basierte Ansätze beinhalten , sind im Großen und Ganzen zu übertragen Nukleinsäuren in Primärzellen 11,12 verwendet. Jedoch wird die Toxizität von Lipid-Formulierung, die in einigen Zellen ein Nachteil. Mikroporierung ist eine Elektroporation Technologie, um eine Pipettenspitze als Elektroporation Raum verwendet, die Metallionen-Auflösung, pH Variation und Oxidbildung minimale Wärme erzeugt; von denen alle schädlich für Zellen sein. Basierend auf den hierin vorgelegten Daten repräsentiert Mikroporation einen effizienteren Ansatz für siRNA Lieferung als die lipidbasierten Transfektionsprotokolls, wie beurteilt durch Western-Blot-Analysen. Verwendung eines EMSA Ansatz, eine Sonde entwickelt , um gegen einen gewählten Bereich des Syncytin-2 Promotor, 7 wichtige Faktoren für seine Aktivität zu binden , ist bekannt , getestet. Die Sonde wurde mit Kernextrakt aus isolierten Cytotrophoblasten inkubiert. Wie in Figur 3 dargestellt, wurden spezifische Signale erhalten.
Die verschiedenen Protokolle hierin beschriebenen have in den letzten Jahren optimiert. Doch sie alle verlassen sich auf hohe Qualität Cytotrophoblast Zubereitungen, die auf einer bestimmten Anzahl von kritischen Schritte abhängen. In erster Linie nach der Geburt, müssen Plazenten in einer Pufferlösung und Zellen gehalten werden, müssen von ihnen nicht mehr als 5 Stunden nach der in der Lösung eingetaucht ist, isoliert werden. Trypsin und DNase-Behandlungen sind ebenfalls von großer Bedeutung und mit äußerster Sorgfalt vorgenommen werden sollte, um die Qualität der Cytotrophoblast Vorbereitung zu maximieren. Umfangreiche Schrubben der Plazenta Zotten und Reduzierung der Zeit für ihre Isolation erforderlich sind beide zusätzliche Verbesserungen, die stark die Effizienz der Zellzahl Isolation aktualisieren. Die Ausbeute dieses Protokoll hängt ferner von optimalen Zentrifugation während des Dichtegradienten Schritt, die eng überwacht werden soll. Eine nicht ordnungsgemäße die Rohre ausgleicht auch zu einer Verzerrung des Gradienten führen und stark Zellzahlen reduzieren.
Die Transfektion Protokoll beschreibend hier wurde über mehrere Jahre hinweg getestet. Obwohl die Bedingungen für Mikroporierung benötigt im Allgemeinen einfach sind, die Optimierung der Transfektion für die verschiedenen Primärzellen sind dennoch erforderlich. Dazu gehört auch die Optimierung der Menge der transfizierten Nukleinsäure (siRNA oder Plasmid-DNA). So kann das hier beschriebene Protokoll, die Optimierung der verschiedenen siRNAs Konzentrationen wird empfohlen, eine effiziente Unterdrückung siRNA zu identifizieren. Zugabe eines geeigneten Suspensionsvolumen zu dem Zellpellet vor Mikroporation und vollständige Suspension der Zellen sind zusätzliche Faktoren, die Transfektionseffizienz beeinflussen.
EMSA Experimente haben auch eine Optimierung notwendig. Da müssen die Heterogenität im Zusammenhang mit Plazenta Spender und die unterschiedlichen Cytotrophoblast Isolation Effizienzen und Reinheiten, EMSA-Experimente bis 5-mal wiederholt werden, um die Ergebnisse zu bestätigen. Darüber hinaus ist eine hohe Zellzahlen wichtig, dass genügend Prote, um sicherzustellen,in Ebenen in der Kernextraktzubereitungen und anschließender Detektion von Protein / DNA-Komplexe. Weiterhin hoch radioaktiven Oligonukleotid-Sonden sollten darauf vorbereitet sein, und sollte von kürzlich erworbenen radioaktiven ATP frisch zubereitet werden.
Eine Reihe von Einschränkungen müssen im vorliegenden Protokoll unterstrichen werden. Es muss zunächst betont werden, dass die Durchflusszytometrie Analysen können nicht die mögliche Anwesenheit von Synzytiotrophoblasten Fragmente in Zellpräparate beurteilen. Andere Protokolle sind vorgeschlagen worden , um dieses Problem zu lösen, wie beispielsweise Sortieren Durchflusszytometer oder die Verwendung von antikörpergebundenen magnetischen Kügelchen 13,14. Es sollte jedoch erwähnt werden, dass diese Fragmente zu Zellkulturvertiefungen normalerweise nicht anhaften und werden häufig nach dem Zellwaschschritt entfernt. Eine andere Einschränkung auf die dargestellten Protokoll ist, dass die primäre villöse Zytotrophoblasten eine sehr begrenzte Lebenszeit in Zellkultur haben. Somit, unabhängig von der gewählten Methode, stabile Transfektion von vilLous Cytotrophoblasten werden unerreichbar bleiben. EMSA-Analysen, wie in diesem Protokoll beschrieben, weisen auch gewisse Einschränkungen auf. Obwohl die Spezifität der Signale leicht durch Kompetitionsexperimente mit überschüssigem unmarkierten Oligonukleotiden beurteilt werden können, können gebunden Faktoren nur Antikörper gegen spezifische Transkriptionsfaktoren identifiziert werden unter Verwendung von in supergeshiftet Signalen resultiert. EMSA Experimente weiterhin begrenzt bleiben , wie es in vitro DNA-Protein - Wechselwirkungen untersucht. Experimente mit repräsentativen Einstellungen wie ChIP - Test und neuere in vivo - Protokolle sind erforderlich , um die EMSA Ergebnis bestätigen.
Die Protokolle hierin beschriebenen Cytotrophoblast Isolierung und Transfektion haben wichtige Anwendungen für Studien, in denen transiente Silencing oder Überexpression bestimmter Gene benötigt wird, ihre Rolle in der Funktion, Proliferation oder Differenzierung eines bestimmten Trophoblastenzelle Art zu verstehen. Darüber hinaus bei der Transfektion tagged Versionen von exprimierten Proteine werden für die intrazelluläre Tracking- und analysiert durch Standardtechniken, wie konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie geeignet sein. Die EMSA-Protokoll kann verwendet werden, komplizierten Details Faktoren im Zusammenhang mit Promotor Regulierung und die Transkription verwickelt zu studieren. Darüber hinaus wird diese experimentellen Ansatz Forscher ermöglichen Faktoren bei der Entwicklung bestimmter Krankheiten placentation Mangel und die veränderte Regulation von Genen in villöse Zytotrophoblasten ausgedrückt bezogen beteiligt zu identifizieren.
Abschließend kann menschliche primäre Zytotrophoblasten leicht isoliert aus Plazenten und sind zugänglich für Standardprotokolle, wie siRNA-Transfektion und EMSA. Obwohl verschiedene Transfektionsverfahren, wie Lipofektion 15 und Nukleofektion 16 verfügbar sind, scheint Mikroporationseinrichtung eine sehr effiziente Methode zur siRNA - Transfektion von isolierten villöse Zytotrophoblasten, einen Ansatz mit begrenzten Zelle de anbietetath und relativ niedrigen Kosten. Im Zusammenhang mit der Villi Cytotrophoblasten sollte dieser Ansatz die Silencing verschiedener Gene erlauben und die Bewertung ihrer Auswirkungen in verschiedenen Funktionen oder Eigenschaften des Zelltyp. Zusätzlich Transfektion von Expressionsvektoren ist auch denkbar, die dieses Protokoll verwenden und ergänzende Daten an die siRNA-basierten Ansatz ergeben. Im Hinblick auf die EMSA, bietet diese Technik eine schnellere und einfachere Methode von Protein-DNA-Komplexe Auswertung zu alternativen Ansätzen verglichen, wie DNase I-Footprinting, Methylierung Interferenz-Test, Chromatinimmunpräzipitation und Chromatinkonformation analysiert. Daher bleibt diese Technik wertvolle in Standard-Promotor Analysen oder Tests von anderen Enhancer / Suppressor-enthaltende DNA-Regionen. Unsere Demonstration seiner zuverlässigen Einsatz für villous Cytotrophoblasten ist wichtig, da es Informationen über die Regulation von Genen, mit möglichen Auswirkungen auf funktionaler Ebene hinzufügt. Trotz ihrerbegrenzte Zeit in Kultur, sind primäre villous Cytotrophoblasten für Standarduntersuchungen geeignet und sollte auf neuere sowie informative Methoden angepasst werden können.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von der National Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (# 298527) (BB) unterstützt. CT wurde von einem institutionellen FARE Stipendium unterstützt. AV wurde durch einen NSERC Graham Bell Ph.D. unterstützt Stipendium. BB hielt einen Canada Research Chair in Menschen Retrovirology (Tier 2). Dank Beatrix Beisner um Hilfe bei der Überarbeitung des Textes.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
