Summary
Detta protokoll beskriver en metod för att effektivt transfektera siRNA i färsk isolerade humana villösa cytotrofoblaster genom att använda mikroporation och identifiera DNA-protein-komplex i dessa celler. Transfekterade celler kan övervakas med Western blot och EMSA-analyser under 4-dagars odling tid.
Protocol
Den UQAM etiska kommittén har godkänt dessa protokoll, som är i enlighet med de riktlinjer den etiska kommittén i St-Luc Hospital i Centre Hospitalier Universitaire de Montréal (Montréal, Kanada). Deltagarna undertecknat ett informerat samtycke formulär.
1. Medium framställning och isolering av primära villi cytotrofoblaster
- Förbereda odlingsmedium för humana primära villösa cytotrofoblaster genom att komplettera Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) med 25 mM HEPES, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin. Filtrera beredda mediet genom sterilt 0,22 pm filter och förvara i en -20 ° C frys i portioner om 50 ml.
- Isolera primära villösa cytotrofoblaster från färska moderkakor följande standardprotokoll 3.
- Med en tång, ta bort fosterhinna från vävnaden genom att försiktigt skrapa bort det, samtidigt som noga med att inte ta bort villi vävnad. Skäråterstående placenta villi i kuber av omkring 3 x 3 cm med hjälp av skalpell och sax. Tvätta med vatten innehållande 0,9% NaCl för att avlägsna moderns blod.
- Håller varje kub med tång, försiktigt bort villösa vävnad från återstående fartygen och fibrösa vävnad med sax.
- I 15 till 30 mg av villous vävnad, smälta fyra gånger i Hanks balanserade saltlösning (HBSS) innehållande trypsin (från 9,6 x 10 5 till 1,8 x 10 6 U; slutkoncentration 1,2 mg / ml) och deoxiribonukleas I (DNas I) ( slutkoncentration 200 ^ g / ml) under 30 min vid 37 ° C i ett vattenbad under kontinuerlig skakning.
Obs: Använd 150 ml totalvolym för första matsmältning, 100 ml för andra matsmältning och 75 ml för de två återstående digere.
- Samla in supernatanten innehållande dispergerade celler och centrifugera vid 1250 xg under 15 min utan broms. Avlägsna supernatanten och de återsuspendera cellerna i 1 ml förvärmd DMEM innehållande1% penicillin / streptomycin.
- Layer de dispergerade cellerna på toppen av en diskontinuerlig 5% - 70% polyvinylpyrrolidon-belagd kiseldioxid-gradient (se tabell 1 för gradient framställning) och centrifugera i 23 min vid 507 x g utan broms. Ta tätheten skiktet mellan 1,017-1,033 genom aspiration och samla lagren mellan 40% och 50% i gradienten med en ny pipett. Tvätta cellerna i stor omfattning med 10 ml förvärmd DMEM innehållande 1% penicillin / streptomycin.
Obs: Den uppsamlade fraktionen motsvarar densiteter mellan 1,048 och 1,062, vilket hyser trofoblaster. - Räkna cellerna med användning av en hemocytometer. Kortfattat, blanda cellerna och tillsätt 10 | il i ett nytt mikrocentrifugrör. Tillsätt 10 | il av trypanblått och blanda försiktigt igen. Upprätta cellsuspensionen och fylla hemocytometern kamrarna. Räkna cellerna under 10X mål.
- Placera 1 x 10 6 och 4,5 x 10 6 celler i separata rör för användning i avsnitten 1.3 och 2, respektively. Ympa de kvarvarande cellerna vid en densitet av 1,5 x 10 6 celler / brunn i kompletterat DMEM-medium och odling vid 37 ° C och 5% CO2 under maximalt 4 dagar för andra experiment.
- Med en tång, ta bort fosterhinna från vävnaden genom att försiktigt skrapa bort det, samtidigt som noga med att inte ta bort villi vävnad. Skäråterstående placenta villi i kuber av omkring 3 x 3 cm med hjälp av skalpell och sax. Tvätta med vatten innehållande 0,9% NaCl för att avlägsna moderns blod.
- Utvärdering av renheten hos isolerade primära villösa cytotrofoblaster
- Spin 1 x 10 6 i nyisolerade cytotrofoblaster i mikrocentrifugrör vid 300 x g. Kasta bort supernatanten och tillsätt 1 ml av förvärmd fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera cellerna vid 300 xg och ta bort PBS genom aspiration.
- Tillsätt 1 ml kall metanol till celler och inkubera vid -20 ° C under 20 min. Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min och avlägsnande av metanol genom aspiration.
Varning: Använd kapsel mask, skyddsglasögon och gummihandskar vid hantering metanol. - Tillsätt 1 ml PBS vid rumstemperatur för att rehydrera celler, centrifugera vid 300 xg och avlägsnande av PBS genom aspiration.
- Inkubera cellerna i PBS innehållande FBS (1:50 [v / v] utspädning) och FcRblockeringsreagens (01:10) i 45 min vid rumstemperatur för att eliminera ospecifik bindning.
- Tvätta två gånger med 500 fil av rumstemperatur PBS, Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min och avlägsnande av PBS genom aspiration. Resuspendera cellerna i 100 | il rumstemperatur PBS.
- Inkubera cellerna med en mus monoklonal fluoresceinisotiocyanat (FITC) -konjugerad anti-human cytokeratin-7-antikropp klon LP5K (1: 200) eller en kontroll isotypmatchad icke-specifik antikropp i PBS innehållande 0,2% BSA under 45 min vid rumstemperatur i mörkret. Tvätta cellerna i PBS.
- Analysera cellerna genom flödescytometri 3. Använd cellberedningar, som visar minst 96% CK-7-positiva celler med flödescytometri för ytterligare experiment.
2. siRNA Transfektion av humana primära villi cytotrofoblaster
- Transfektion av humana primära villösa cytotrofoblaster med hjälp av en Mikroporationsanordningen
- Förbered sex-brunnars plattor innehållande2 ml kompletterat DMEM-medium för inkubation av microporated celler.
- Efter isolering av primära cytotrofoblaster (se avsnitt 1.2), ta en delmängd av celler i suspension och bestämma mobilnummer med hjälp av en hemocytometer.
- Överför 1,5 x 10 6 celler till ett mikrocentrifugrör och Pelletera celler genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med 1 ml Dulbeccos PBS (DPBS) (Mg2 +, Ca2 + -fri) och pelletera cellerna genom centrifugering vid 300 xg under 5 min vid rumstemperatur.
- Avlägsna supernatanten och suspendera cellerna försiktigt i 100 pl resuspension buffert.
Obs: Undvik att hålla cellsuspensionen längre än 15-30 minuter vid rumstemperatur, för att maximera cellviabiliteten och transfektionseffektivitet. - Tillsätt 300 ng Syncytin-2 siRNA (eller kontroll förvrängd siRNA) till 1,5 ml mikrocentrifugrör och aspirera cell siRNA blandning med hjälp av en 100 ^ transfektion pipett. Föra inpipetten in stationen (se lista över material) och utsätta cellerna till en 1300 V enda puls av 30 ms.
- Omedelbart överföra celler till 6-brunnars plattor (framställda i steg 2.1.1) innehållande 37 ° C förvärmda kompletterat medium för att undvika cellskador.
- Upprepa steg 2.1.5 och 2.1.6 för de återstående proverna.
- Skaka plattan under 30 sekunder för att säkerställa jämn fördelning av cellerna. Inkubera plattan vid 37 ° C i en fuktad CO2-inkubator under 24 till 48 timmar. Uppdatera odlingsmedium 24 timmar efter transfektion.
- Utvärdera transfektion effektivitet genom Western blot-analys (se steg 3-6).
- Lipofektion av siRNA i mänskliga primära cytotrofoblaster
- Efter isolering av villösa cytotrofoblaster, ympa cellerna vid en densitet av 1,5 x 10 6 celler per brunn i 6-brunnars plattor i 2 ml odlingsmedium och inkubera under 18 timmar.
- Späd 300 ng Syncytin-2-specifika siRNA (eller kontroll oordningsiRNA) och 5 | il av lipid-baserade transfektionsreagens i separata 1,5 ml rör i en total volym av 10 | il av antibiotika och serumfritt medium. Inkubera i 5 min.
- Blanda de utspädda reagenser och inkubera under ytterligare 20 min vid rumstemperatur för att bilda transfektionsblandningen komplex. Lägg 90 pl av antibiotika och serumfritt medium till blandningen till en slutlig volym av 100 | il.
- Ta bort odlingsmedium från 6-brunnsplattor (steg 2.2.1). Tillsätt 2 ml av färskt medium och 100 | j, l transfektionsblandning till varje brunn. Inkubera cellerna vid 37 ° C i en CO2-inkubator under 24 till 48 timmar. Uppdatera odlingsmedium 24 timmar efter transfektion.
- Utvärdera transfektion effektivitet genom Western blot-analys (se steg 3-6).
3. Beredning av Lysat från Whole Cell Culture
- Ta bort media och skölj varje brunn (från steg 2.1.8 och 2.2.4) med hjälp av förvärmda DPBS (Mg 2+, Ca2 + fri). Aspirera DPBS och tillsätt 500 | il av 0,25% trypsin / etylendiamintetraättiksyra (EDTA). Inkubera under 1-3 min vid 37 ° C i en CO2-inkubator. Stoppa trypsin behandling genom att tillsätta 500 pl serum innehållande tillväxtmedier.
Obs: Använd lämpliga medier volym beroende på vilken typ av kolven / skål: 1 ml per 10 7 celler / 100 mm skål / 150 cm 2 kolv; 0,5 ml per 5 x 10 6 celler / 60 mm skål / 75 cm2 kolv. - Överför celler till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, Pelletera celler genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med DPBS (Mg2 +, Ca2 + -fri) och pellets celler genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid rumstemperatur.
- Försiktigt bort supernatanten utan att störa pelleten. Placera röret på is. Resuspendera pelleten i 50-200 ul iskall Radio-Immunoprecipitation analys (RIPA) buffert (se tabell 2 för buffertsammansättning) innehållande nyligen tilled proteas och fosfatasinhibitorer på en 1x slutlig koncentration. I korthet, virvel röret och lämna på is under 30 minuter.
- Centrifugering vid 16.000 xg under 20 min vid 4 ° C. Placera försiktigt röret på is. Med hjälp av en pipett, överföra supernatanten till ett nytt förkyld mikrocentrifugrör på is. Kassera pellet.
4. Framställning av nukleära extrakt från odlade celler
- För varje brunn (steg 1.2.5), tvätta odlade cytotrofoblaster två gånger med 1 ml förvärmda DPBS (Mg 2+, Ca2 + gratis). Aspirera DPBS och tillsätt 500 pl 0,25% trypsin / EDTA. Inkubera under 1-3 min vid 37 ° C i en CO2-inkubator och stoppa trypsinbehandling genom tillsats av 500 | il av serum innehållande tillväxtmedia.
- Överför celler till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör, Pelletera celler genom centrifugering vid 300 xg under 2 minuter vid rumstemperatur. Tvätta cellerna med DPBS (Mg2 +, Ca2 + -fri) och pellets cellerna genom centrifugeringvid 300 xg under 2 minuter vid rumstemperatur. Försiktigt bort alla supernatanten utan att störa pelleten och placera röret på is.
- Utvinna kärn protein enligt tillverkarens instruktioner. Bestämma proteinkoncentrationen i varje prov med användning av protein kvantifiering analys (Bradford eller bicinkoninsyra analys (BCA)).
5. Provberedning och elektrofores
- Bestämma proteinkoncentrationen för varje cellextrakt med användning av en protein kvantifiering analys (t.ex. Bradford 8 eller BCA 9).
- Enligt tillverkarens instruktioner (om antikroppar skulle kunna användas i reduktions och denatureringsförhållanden), tillsätt en lika stor volym 2x Laemmli provbuffert (tabell 2) till 20 till 30 | j, g av totalt protein.
- Koka cellysat vid 100 ° C under 5 min. Alikvotera 50-100 pl av lysat för att undvika upprepade frysning / upptiningscykler och lagra de återstående rören vid -20 ° C för framtida bruk. Medan proverna upphettning, förbereda ett L av 1x körningsbuffert (tabell 2).
- Snurra proverna vid 16.000 xg under några sekunder och placera dem på is.
- Belastning som motsvarar mängden protein i varje brunn i en 12% SDS-PAGE-gel (se tabell 2 för gelkompositionen), tillsammans med en molekylviktsmarkör. Köra gelén under 1 till 2 h vid 100 V.
6. Överföring av protein från gel till membran
- Aktivera polyvinylidenfluorid (PVDF) membran med metanol i 1 min och skölj med 1x överföringsbuffert / 10% metanollösning. Enligt tillverkarens instruktioner, överföra under 30 min till 1 h beroende på proteinstorleken.
Obs: Transfer effektivitet kan bedömas med hjälp av Ponceau Red färgning innan blockeringssteget.
7. Antikropp Färgning
- Blockera membranet under 1 timme i rumstemperatur eller över natten vid 4 ° C med användning av 5% blockeringslösning.
- Inkubera membranet med anti-Syncytin-2-antikroppar (4 | j, g / ml; 1: 5000) 6 eller med anti-glyceraldehyd-3-fosfatdehydrogenas (GAPDH; 0,4 | j, g / ml; 1: 500) i 5% blockeringslösningen över natten vid 4 ° C (anti-Syncytin-2), eller för 45 min vid rumstemperatur. Tvätta membranet tre gånger i Tris-buffrad saltlösning Tween (TBST; se tabell 2 för buffertsammansättning) under 5 min.
- Inkubera membranet med lämpliga pepparrotsperoxidas (HRP) -konjugerad anti-kanin eller anti-mus-antikropp (1: 10000) i 5% blockeringsbuffert i TBST vid rumstemperatur under 1 timme. Tvätta membranet tre gånger i TBST under 5 min och skölj sedan i TBS. Detektera signaler med hjälp av kemiluminescens-baserad blotting substrat.
8. Radiomärkning av Single oligonukleotid
- fosforyleringsreaktionen
- I ett mikrocentrifugrör, tillsätt 50 ng av en framåt oligonukleotid tillsammans med 1x T4 polynukleotidkinas buffert, ett UT4 polynukleotidkinas och 20 ^ Ci (γ- 32 P) ATP och späd reaktionsvolymen till 20 | j, l med nukleasfritt vatten.
- Inkubera vid 37 ° C under 30 min. Stoppa reaktionen genom tillsats av 5 pl av 0,5 M EDTA. Gör upp volymen till 50 pl med nukleasfritt vatten.
- Borttagning av unincorporated nukleotider från oligonukleotider
- Framställa en G-25-kolonn jämviktad med TE-buffert (Tabell 2) genom att följa tillverkarens instruktioner. Placera kolonnen i en fräsch DNas-fritt 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Tillsätt långsamt 50 pl prob (från steg 8.1.2) över hartset, försiktigt så att inte störa hartsbädden. Snurra i 2 min vid 350 xg för att samla in det renade provet i 1,5 ml mikrocentrifugrör. Tvätta G-25-kolonn med 36 | il av nukleasfritt vatten och centrifugera i 2 min vid 350 xg för att samla in det i mikrocentrifugrör.
- Hybridisering med den komplementära strängen oligonucleotide
- Överföra den radiomärkta sonden (86 | il) till en 1,5 ml mikrocentrifugrör och tillsätt 200 ng av den omvända oligonukleotiden och 1x av pamingsbuffert (tabell 2). Värme 5 min vid 95 ° C och låt stå över natten vid rumstemperatur för kylning.
- Framställa icke-radioaktiva dubbelsträngade oligonukleotider genom att tillsätta 50 ng av omärkt framåt och bakåt oligonukleotider och 1x av glödgning buffert i en 1,5 ml mikrocentrifugrör. Gör upp volymen till 100 pl med nukleasfritt vatten. Värme och hålla rumstemperatur som beskrivs i steg 8.3.1.
9. Framställning av en icke-denaturerande polyakrylamidgel för EMSA
- Bered en 4% nativ gel (10 x 12 cm) med en 1,5 mm space-kam (se tabell 2 för gelkompositionen). Rengör alla glasplattor med hjälp av destillerat vatten.
Obs: Det är kritiskt att plattorna vara helt fri från jonisk detergent, såsom SDS. - omedelbart pvår lösningen akrylamid i mellan plattorna och tillåta polymerisationen att fortsätta (ca 30 min).
- Montera elektroforesapparaten och fylla tanken med 0,5x TBE. Pre-run gelén under 30 min till 1 h vid 150 V före provladdning.
10. DNA-bindningsreaktionen
- I en 1,5 ml mikrocentrifugrör, tillsätt 10 ^ g av nukleärt extrakt (steg 4,3) i 1 x Gel Shift Bindningsbuffert (tabell 2) och späd den slutliga volymen till 10 | il med nukleasfritt vatten. Som en kontroll, förbereda ett rör utan någon kärnextrakt. För konkurrensreaktion, tillsätt 1 pl kall ospecifik eller specifik dubbelsträngad oligonukleotid (steg 8.3.2).
- Tillsätt 1 l av radioaktivt sond från steg 8.3.1 till varje reaktion. Inkubera reaktionen vid rumstemperatur under 20 min. Tillsätt 1 pl 10x gelladdningsbuffert per reaktion och ladda varje prov på gelén som framställts i avsnitt 9.
- Kör gelen för en halv till två timmar vid 150 V. Efter migreringen linda gelén och glaset i en plastfolie och ställning i en exponeringskassett under en fosforskärm. Lämna kassetten vid 4 ° C under 24 h.
- Ta bort skärmen från exponerings kassetten och sätt i fosforavbildningsanordningen för skanning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Färska placentor från sikt graviditeter användes för att isolera humana primära villösa cytotrofoblaster att utföra uppsättning experiment som presenteras i protokollet sektion. Efter deras isolering, först analyserade vi renheten av cytotrofoblaster genom användningen av cytokeratin-7 markör (figur 1). Cellpreparationer har således färgades med användning av en monoklonal anti-cytokeratin-7-antikropp. Figur 1 representerar resultat från ett typiskt experiment efter rening av primära villösa cytotrofoblaster, analyserades med standard flödescytometri. Efter densitetsgradient steget> 97% celler (i detta fall, 99%) positivt färgas för cytokeratin-7 i standard experiment, vilket visar en mycket hög grad av effektivitet vid rening av denna celltyp.
Efter deras isolering, kan humana primära cytotrofoblaster användas direkt för transfection. Två olika protokoll utvärderades, dvs mikroporation och lipid-baserade transfektion. Båda protokollen testades med siRNA specifik för Syncytin-2-mRNA och jämfördes med en kodad siRNA (negativ kontroll). Transfektionseffektivitet var nästa utvärderades genom Western blot-analys. Resultaten bekräftade att Syncytin-2 expression var signifikant tystas i cytotrofoblast-härledda extrakten upon mikroporation (Figur 2). Å andra sidan kunde ingen signifikant ljuddämpning noterades när siRNA transfekterades genom lipid-baserade transfektionsreagens.
Vi genomförde också EMSA experiment på nyligen isolerade cytotrofoblaster. En radioaktivt märkt sond som har sitt ursprung från en Syncytin-2-promotorregionen syntetiserades. Den syntetiserade sonden (benämnd WT; 5'-CTCTAGGAACACCTGACTGATAAGGGAAAAATGTC-3 ') har tidigare visats binda CREB relaterade transkriptions 7 faktorer. I närvaro av kärn extr akter från 24 och 48 h odlade villösa cytotrofoblaster, den Syncytin-2-promotor-härledd sond visade närvaron av två DNA-proteinkomplex. Tillsats av 100x kalla WT oligonukleotid konkurrerade för bildandet av komplexet, medan ingen liknande konkurrens med överskott av en kall obesläktad oligonukleotid (mus Neural Crest Enhancer 2, 5'-GATCCTGTGATTTTCGTCTTGGGTGGTCTCCCTCG-3 ') observerades, vilket bekräftar specificiteten av båda signalerna ( Figur 3).
Figur 1. Utvärdering av renheten av primära villösa cytotrofoblaster genom flödescytometri. Nyligen isolerade preparat av villösa cytotrofoblaster först permeabiliserades och märktes sedan med isotyp kontrollantikropp (röd linje) eller monoklonal antikropp specifik för cytokeratin-7 (svart linje). Celler analyserades genom flödescytometri. les / ftp_upload / 53.995 / 53995fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Jämförelse av siRNA transfektion effektivitet mellan lipid-baserade transfektion och mikroporation. Nyligen isolerade villösa cytotrofoblaster transfekterades med 300 ng Syncytin-2-specifika siRNA mot en kodad styr siRNA använder lipidbaserade reagens eller mikroporation. (A) Western blot analyser utfördes på cellextrakt från varje transfektion villkor med hjälp av anti-Syncytin-2 och anti-GAPDH antikroppar. (B) Syncytin-2-proteinnivåer från Western blöt analyser kvantifieras i termer av bandintensitet efter normalisering med motsvarande GAPDH signaler (Felstaplar definieras som SD, *** p <0,001).5 / 53995fig2large.jpg "target =" _ blank "> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. DNA-proteinkomplex identifierats av EMSA-analys. Kärnextrakt från primära villösa cytotrofoblaster odlade under 24 eller 48 h inkuberades med en WT-prob motsvarande en promotorregion av Syncytin-2 med eller utan överskott (100x) av specifik eller icke-specifik kalla oligonukleotider. DNA-proteinkomplex separerades vid migrering på en nativ gel. Specifika signaler och fritt prober är indikerade på den högra sidan av gelén. WT sond inkuberades i frånvaro av nukleärt extrakt användes också som en negativ kontroll. CT NE = cytotrofoblast kärnextrakt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| % Av Percoll slutliga | Volym av Percoll (90%) (ml) | Volym av HBSS (ml) |
| 70 | 2,33 | 0,67 |
| 65 | 2,17 | 0,83 |
| 60 | 2,00 | 1,00 |
| 55 | 1,83 | 1,17 |
| 50 | 1,67 | 1,33 |
| 45 | 1,50 | 1,50 |
| 40 | 1,33 | 1,67 |
| 35 | 1,17 | 1,83 |
| 30 | 1,00 | 2,00 |
| 25 | 0,83 | 2,17 |
| 20 | 0,67 | 2,33 |
| 15 | 0,50 | 2,50 |
| 10 | 0,33 | 2,67 |
| 5 | 0,17 | 2,83 |
Tabell 1. 5% -70% polyvinylpyrrolidon-belagd kiseldioxid gradient inställning.
| Buffert | Sammansättning | Kommentarer / Beskrivning |
| PBS 1x | 0,9 mM CaCl2, 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 0,5 mM MgCl2, 136,9 mM NaCl och 0,8 mM Na 2 HPO 4 | |
| RIPA-buffert | 150 mM NaCl, 1,0% NP-40 eller 0,1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxicholat, 0,1% SDS (natriumdodecylsulfat), 50 mM Tris-HCl pH 8,0 | |
| Laemmli provbuffert | 4% SDS, 10% 2-mercaptoethanol, 20% glycerol, 0,004% bromfenolblått, 0,125 M Tris-HCl, pH 6,8 | |
| 10x kör buffert | 25 mM Tris-bas, 190 mM glycin, 0,1% SDS | |
| 10x överföringsbuffert | 25 mM Tris-bas, 192 mM Glycin | |
| TBST 1x buffert | 10 mM Tris-HCl, 15 mM NaCl, 0,05% Tween 20 vid pH 7 | Blanda väl och filtrera. Underlåtenhet att filtret kan leda till "spotting" av membranet. |
| blockeringsbuffert | 5% mjölk eller BSA (bovint serumalbumin) sattes till TBST 1x buffert | |
| TE-buffert | 10 mM Tris-HCl (pH 8,0), 1 mM EDTA | |
| pamingsbuffert | 1 M NaCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,5, 100 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 1 mM DTT | |
| 5x Gel Shift Binding Buffer | 20% glycerol, 5 mM MgCl2, 2,5 mM EDTA, 2,5 mM DTT, 250 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl (pH 7,5) och 0,25 mg / ml poly (dl-dC). | |
| laddningsbuffert | 250 mM Tris-HCl (pH 7,5), 0,2% bromfenolblått och 40% glycerol | |
| TBE 5x | Lös upp 54 g Tris-bas och 27,5 g borsyra i 1 L avjoniserat vatten, som innehåller 20 ml 0,5 M EDTA, pH 8 | |
| 4% nativ gel | TBE 5x buffert | 6,0 ml |
| 29: 1 akrylamid / bisakrylamid (30% vikt / volym) | 10 ml | |
| 40% akrylamid (w / v) | 0,75 ml | |
| 100% glycerol | 1,5 ml | |
| Destillerat vatten | 41,5 ml | |
| Ammoniumpersulfat 25% | 250 ml | |
| TEMED | 75 ml | |
| 4% Stacking Gel (6 ml) för SDS-PAGE | DDH 2 O | 4,1 ml |
| 30% Akrylamid | 1,0 ml | |
| 1,0 M Tris | 0,75 ml | |
| 10% SDS | 60 ^ | |
| 10% APS | 60 ^ | |
| TEMED | 6 | il | |
| 12% separationsgel (10 ml) för SDS-PAGE | DDH 2 O | 3,3 ml |
| 30% Akrylamid | 4,0 ml | |
| 1,5 M Tris | 2,5 ml | |
| 10% SDS | 100 ^ | |
| 10% APS | 100il | |
| TEMED | 4 | j, l |
Tabell 2. Sammansättning av buffertar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Studier av humant placenta funktion och utveckling har förbättrats avsevärt av protokoll som syftar till att optimera isolering av olika moderkakan cellpopulationer. En av de bäst studerade placenta cellpopulationen fortfarande de villösa cytotrofoblaster, studiet av vilka har stor nytta av optimerade protokoll tillåter effektiv och pålitlig isolering. Detta har ytterligare tillåtit ett antal experiment, såsom transfektion och promotorstudier. Med hjälp av en tidigare beskrivna protokollet 3, kan rena populationer av primära villösa cytotrofoblaster erhållas. CK-7 är ett intermediärt filamentprotein, vilket uttrycks i cytotrofoblaster. Monoklonala antikroppar mot detta protein används för att bestämma renheten hos denna trofoblasten befolkningen efter deras isolering från placenta 10. Förberedelserna definieras att vara ren när 96% av cellerna är positiva för CK-7. Celler kan därefter användas direkt för transfektion. transfektion protokollinvolverar lipidbaserade tillvägagångssätt är i stort sett används för att överföra nukleinsyror i primära celler 11,12. Men blir toxiciteten av lipid formulering i vissa celler en nackdel. Mikroporation är en elektro teknik som använder en pipettspets som en elektro utrymme, vilket genererar minimal värme, metalljoner upplösning, pH-variation och oxidbildning; vilka samtliga kan vara skadliga för cellerna. Baserat på de data som presenteras häri representerar mikroporation en mer effektiv strategi för siRNA delivery än lipidbaserade transfektion protokoll, att döma av Western blot-analyser. Med användning av en EMSA tillvägagångssätt, en sond utformad mot ett valt område av det Syncytin-2-promotorn som är känd för att binda viktiga faktorer för dess aktivitet 7 testades. Sonden inkuberades med nukleärt extrakt från isolerade cytotrofoblaster. Enligt figur 3, var specifika signaler erhölls.
De olika protokoll som beskrivs häri have optimerats under senare år. Men de alla är beroende av hög kvalitet cytotrofoblast preparat, som är beroende av ett visst antal kritiska steg. Först och främst, efter födelsen, moderkakor måste hållas i en buffertlösning och celler måste isoleras från dem inte mer än fem timmar efter att nedsänkt i lösningen. Trypsin och DNas behandlingar är också av stor betydelse och bör noggrant göras för att maximera kvaliteten på cytotrofoblast preparat. Omfattande skrubbning av moderkakan villi och minskning av den tid som behövs för deras isolering är båda ytterligare förbättringar, vilket starkt kan uppgradera effektiviteten av antalet celler isolering. Utbytet av detta protokoll beror vidare optimal centrifugering under densitetsgradient steg, som bör övervakas noga. Underlåtenhet att korrekt balansera rören kommer också att leda till en snedvridning av gradienten och allvarligt minska cellantalet.
Transfektionen protokollet beskrivad häri har testats under flera år. Även förutsättningarna för mikroporation är i allmänhet okomplicerad, är optimering av transfektion för de olika primära cellerna ändå krävs. Detta innebär också att optimera mängden transfekterad nukleinsyra (siRNA eller plasmid-DNA). Således, för det protokoll som beskrivs här, optimering av olika siRNA koncentrationer rekommenderas att identifiera en effektiv förtränga siRNA. Tillsats av en lämplig suspensionsvolymen till cellpelleten före mikroporation och totalt upphävande av cellerna är ytterligare faktorer som påverkar transfektionseffektivitet.
EMSA experiment har också krävt optimering. Med tanke på den heterogenitet i samband med placenta givare och varierande cytotrofoblast isoleringseffektivitet och renhet, EMSA experiment måste upprepas upp till 5 gånger för att bekräfta resultaten. Dessutom är det viktigt att ha höga cellantal för att säkerställa tillräcklig protei nivåer i nukleära extraktberedningar och efterföljande detektering av protein / DNA-komplex. Dessutom bör högradioaktivt oligonukleotidsonder framställas, och bör beredas på nytt från nyligen köpt radioaktiv ATP.
En serie av begränsningar måste understrykas i den presenterade protokollet. Det måste först betonas att flödescytometri analyser inte kan bedöma potentialen närvaro av syncytiotrofoblast fragment i cellpreparat. Andra protokoll har föreslagits för att lösa detta problem, såsom sortering med hjälp av flödescytometri eller användning av antikroppsbundna magnetiska pärlor 13,14. Det bör dock nämnas att dessa fragment inte normalt håller sig till cellkulturbrunnar och är ofta avlägsnas efter celltvättningssteget. En annan begränsning för den presenterade protokollet är att primära villösa cytotrofoblaster har en mycket begränsad överlevnadstid i cellkultur. Hence, oberoende av den valda metoden, stabil transfektion av vilLous cytotrofoblaster förblir ouppnåeligt. EMSA-analyser, som beskrivs i detta protokoll, har också vissa begränsningar. Även lätt kan bedömas specificitet av signalerna från konkurrensexperiment med överskott omärkta oligonukleotider, kan bundna faktorer endast identifieras med hjälp av antikroppar mot specifika transkriptionsfaktorer som resulterar i supershifted signaler. EMSA experiment dessutom fortfarande begränsad eftersom det studier i DNA-protein in vitro interaktioner. Experiment med flera representativa inställningar, såsom ChIP analys, och senare in vivo-protokoll behövs för att ytterligare bekräfta EMSA resultat.
De protokoll som beskrivs häri för cytotrofoblast isolering och transfektion har viktiga tillämpningar för studier där det behövs övergående tysta eller överuttryck av specifika gener för att förstå deras roll i funktion, proliferation eller differentiering av en specifik trofoblasten celltyp. Dessutom, vid transfektion, tagged versioner av uttryckta proteiner kommer att vara lämpliga för intracellulär spårning och analys genom standardtekniker, såsom konfokal mikroskopi och flödescytometri. EMSA protokoll kan användas för att studera intrikata detaljer som hänför sig till promotorreglering och inblandade transkriptionsfaktorer. Dessutom kommer detta experimentella tillvägagångssätt tillåter forskare att identifiera faktorer som är inblandade i utvecklingen av vissa sjukdomar relaterade till placentation brist och förändrad reglering av gener som uttrycks i villösa cytotrofoblaster.
Sammanfattningsvis kan humana primära cytotrofoblaster lätt isoleras från moderkakor och är mottagliga för standardprotokoll, såsom siRNA transfektion och EMSA. Även om olika transfektionsmetoder förfaranden, såsom lipofektion 15 och nucleofection 16 är tillgängliga, verkar mikroporation en mycket effektiv metod för siRNA transfektion av isolerade villösa cytotrofoblaster, som erbjuder ett tillvägagångssätt med begränsad cell death och relativt låga kostnad. Inom ramen för villösa cytotrofoblaster, bör detta tillvägagångssätt tillåter tysta olika gener och bedömningen av deras inblandning i olika funktioner eller egenskaper celltyp. Dessutom är också möjligt att använda detta protokoll transfektion av expressionsvektorer och kommer att ge kompletterande data till siRNA-synsätt. När det gäller byrån, ger denna teknik en snabbare och enklare metod för att utvärdera protein-DNA-komplex jämfört med alternativa metoder, såsom DNase footprinting, metylering störningar analys kromatin immunoprecipitation och kromatin konformaanalyser. Därför denna teknik är fortfarande värdefulla i standard promotor analyser eller tester av andra förstärkare / suppressor-innehållande DNA-regioner. Vår demonstration av dess tillförlitlig användning för villösa cytotrofoblaster är viktigt, eftersom det lägger till information om reglering av gener, med potentiella konsekvenser på funktionell nivå. trots derasbegränsad tid i odling, primära villösa cytotrofoblaster är lämpliga för standardstudier och bör kunna anpassas till nyare liksom informativa metoder.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National vetenskaplig och teknisk forskning Council of Canada (NSERC) (# 298.527) (BB). CT stöddes av en institutionell FARE stipendium. AV stöddes av en NSERC Graham Bell Ph.D. stipendium. BB höll en Canada Research Chair i Human Retrovirology (Tier 2). Tack vare Beatrix Beisner för hjälp med att revidera texten.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| HBSS without Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | #14060-057 | |
| DMEM High Glucose without Hepes | Gibco | #12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | #15630-080 | |
| Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x) | Gibco | #15640-055 | |
| Amphotericin B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Fetal bovine serum | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | For density gradient |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life technologies | #AM16708 | |
| Scrambled siRNA | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Trypsine, type I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfection reagents | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| Anti-rabbit IgG, HRP-linked antibody | Cell Signaling | #7074 | |
| BM Chemiluminescence Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polynucleotide Kinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | #A9099 | |
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Ammonium Persulfate | Sigma | #A3678 | |
| Anti-human cytokeratin-7 antibody clone LP5K, FITC conjugated | Millipore | CBL194F | Dilution 1:200 |
| FcR blocking reagent | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Dilution 1:10 |
| Flow Cytometer BD Acuri system | Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 apparatus | Digital Bio | ||
| Resuspension Buffer R (Neon Transfection System 100 µl Kit) | Life technologies | MPK10096 | |
| PVDF membrane | Millipore | IPVH00010 | Activate with methanol |
| Anti-human GAPDH antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit antibody or anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-mouse antibody | Cell Signalling | #7076 | 1:10,000 |
| NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction Reagent | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 column | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Chemiluminsescence and fluorescence imaging device | Montréal Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% native gel | Home made | ||
| PBS | Home made | 1x | |
| Personal Molecular Imager (PMI) System | BioRad |
References
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
- Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
- Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
- Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
- Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
- Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468 (2015).
- Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
- Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
- Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
- Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
- Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
- Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
- Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).
