Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

ईएससी व्युत्पन्न माउस श्वासनली उपकला decellularized फेफड़े Scaffolds का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: May 5, 2016 doi: 10.3791/54019
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Physiology and Experimental Medicine, Peter Gilgan Centre for Research and Learning, Hospital for Sick Children

Summary

इस प्रोटोकॉल कुशलता माउस भ्रूणीय स्टेम सेल व्युत्पन्न निश्चित एण्डोडर्म निर्देशन एयरवे उपकला कोशिकाओं परिपक्व करने के लिए। यह भेदभाव तकनीक 3 आयामी decellularized फेफड़ों मचानों का उपयोग करता है फेफड़ों के वंश विनिर्देश को निर्देशित करने के लिए, एक परिभाषित, सीरम मुक्त संस्कृति की स्थापना में।

Abstract

फेफड़े वंश भेदभाव जटिल पर्यावरण संकेत है कि वृद्धि कारक सिगनल, सेल सेल बातचीत और सेल मैट्रिक्स बातचीत में शामिल हैं के एकीकरण की आवश्यकता है। इस जटिलता के कारण, इन विट्रो में फेफड़ों के विकास का संक्षिप्त फेफड़ों उपकला कोशिकाओं को स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए चुनौती रहा है। इस प्रोटोकॉल में, decellularized फेफड़ों scaffolds फेफड़ों के 3-आयामी वातावरण की नकल और स्टेम सेल व्युत्पन्न एयरवे उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। माउस भ्रूणीय स्टेम सेल पहली activin ए एण्डोडर्म कोशिकाओं के साथ एक embryoid शरीर (ईबी) संस्कृति विधि का उपयोग करने के लिए एण्डोडर्म वंश भेदभाव कर रहे हैं तो decellularized मचानों पर वरीयता प्राप्त कर रहे हैं और अप करने के लिए 21 दिनों के लिए हवा तरल इंटरफेस में सुसंस्कृत। इस तकनीक को अतिरिक्त वृद्धि कारक पूरकता के बिना कार्यात्मक एयरवे उपकला कोशिकाओं के लिए वरीयता प्राप्त कोशिकाओं (रोमक कोशिकाओं, क्लब कोशिकाओं, और बेसल सेल) के भेदभाव को बढ़ावा देता है। इस संस्कृति सेटअप परिभाषित किया गया है, Seruमीटर से मुक्त, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य। हालांकि वहां की संस्कृति में गैर फेफड़ों एण्डोडर्म प्रजातियों से सीमित संदूषण है, इस प्रोटोकॉल केवल एयरवे उपकला आबादी उत्पन्न करता है और वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं को जन्म देना नहीं है। श्वासनली इस प्रोटोकॉल के साथ उत्पन्न epithelia फेफड़ों जीवोत्पत्ति के दौरान और रोग मॉडलिंग या ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस के रूप में एयरवे संबंधी विकृतियों की दवा की खोज प्लेटफार्मों के लिए सेल मैट्रिक्स बातचीत का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।

Introduction

फेफड़ों के वंश को pluripotent कोशिकाओं के निर्देशन में भेदभाव microenvironment 1,2 में सटीक संकेत घटनाओं पर निर्भर है। इस प्रक्रिया के गतिशील स्वभाव के कारण यह इन विट्रो में फेफड़ों जीवोत्पत्ति के सटीक घटनाओं की नकल करने की चुनौती दे दी गई है। हाल की रिपोर्टों से दो आयामी संस्कृतियों के घुलनशील वृद्धि कारक पूरकता के साथ कदम वार वंश प्रतिबंध रणनीतियों का इस्तेमाल किया है फेफड़ों भेदभाव 3-8 प्राप्त करने के लिए। कदम वार भेदभाव प्रोटोकॉल में, pluripotent कोशिकाओं, चाहे भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (ईएससी) या प्रेरित pluripotent स्टेम सेल, पहले निश्चित एण्डोडर्म रोगाणु परत करने के लिए भेदभाव किया गया। Endodermal कोशिकाओं बाद के रूप में homeodomain युक्त प्रतिलेखन कारक NKX2-1 की अभिव्यक्ति द्वारा की पहचान की, फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं को एक पूर्वकाल एण्डोडर्म भाग्य को धकेल दिया गया था और उसके बाद। ये फेफड़ों के पूर्वज आगे समीपस्थ (एयरवे) या बाहर का (वायुकोशीय) फेफड़ों उपकला कोशिकाओं वाई करने के लिए भेदभाव कर रहे थेवें वृद्धि कारक पूरकता जारी रखा। इस तरह 2-आयामी रणनीति है फेफड़ों के उपकला कोशिकाओं को पैदा करने में कुछ सफलता मिली है, लेकिन वहाँ अस्पष्ट क्षमता, अन्य endodermal प्रजातियों से संभावित संक्रमण, एक 3-आयामी (3 डी) संरचना की कमी सहित कई सीमाएं हैं, और कुछ मामलों में अपरिभाषित संस्कृतियों का उपयोग सीरम पूरकता के साथ। Pluripotent या decellularized फेफड़ों मचानों पर विभेदित कोशिकाओं की संस्कृति तेजी से फेफड़ों के उपकला संरचनाओं 3,5,6,8,9 बनाने में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के पुनर्योजी क्षमता का आकलन करने के लिए एक परख के रूप में प्रयोग किया जाता है। इस तरह की रिपोर्टों संस्कृति निरंतर विकास के कारक या सीरम पूरकता के साथ मचानों पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं।

फेफड़ों के विकास प्रभाग, प्रवास, जीन पर्यावरण cues के जवाब में अभिव्यक्ति और व्यक्ति की कोशिकाओं के भेदभाव शामिल है। अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) ग्लाइकोप्रोटीन की एक जाली कि संरचनात्मक समर्थन प्रदान करने के अलावा, निर्देशन Tissu हैएकीकरण और इन प्रक्रियाओं 10,11 विनियमन द्वारा ई morphogenesis। एण्डोडर्म संस्कृति के लिए एक मंच के रूप में प्राकृतिक फेफड़ों ईसीएम पाड़ का उपयोग कर बेहतर विवो फेफड़ों के विकास के वातावरण की नकल करने से, हम उच्च दक्षता और reproducibility के साथ स्थापित करने के लिए एक परिभाषित 3 डी-संस्कृति में सेल व्युत्पन्न एयरवे उपकला स्टेम कोशिकाओं उत्पन्न किया है।

चूहा फेफड़ों ईसीएम scaffolds decellularization के साथ ही माउस ईएससी व्युत्पन्न endodermal कोशिकाओं द्वारा उत्पन्न किया गया उत्पन्न किया गया और बाद में इन मचानों पर वरीयता प्राप्त। CXCR4 और सी-किट प्रोटीन की दोहरी अभिव्यक्ति एक निश्चित एण्डोडर्म सेल पहचान और कोशिकाओं दोनों Sox2 और NKX2-1 अभिव्यक्ति के लिए सकारात्मक एयरवे (समीपस्थ फेफड़ों) पूर्वज कोशिकाओं के रूप में पहचाने जाते हैं इंगित करता है। निश्चित एण्डोडर्म कोशिकाओं को तीन सप्ताह के लिए इन विट्रो में कार्यात्मक एयरवे उपकला कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए हवा तरल इंटरफेस (अली) में सुसंस्कृत थे।

इस प्रोटोकॉल परिभाषा के फेफड़ों वंश भेदभाव को बढ़ावा देता हैसक्रिय एण्डोडर्म के रूप में जल्दी 7 दिन, NKX2-1 + / Sox2 + जल्दी समीपस्थ फेफड़ों के progenitors के उद्भव के साथ मनाया जाता है। दिन के 14 और संस्कृति परिपक्व एयरवे उपकला सेल आबादी के 21 उभरने रोमक सहित (TUBB4A +), क्लब (SCGB1A1 +), और बेसल (TRP63 +, KRT5 +) मूल निवासी माउस एयरवेज को रूपात्मक और कार्यात्मक समानता के साथ कोशिकाओं द्वारा। इस प्रोटोकॉल उपकला कोशिकाओं airway के लिए मजबूत भेदभाव को प्राप्त करने के लिए 3 डी मैट्रिक्स microenvironment के महत्व को दर्शाता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

पशु प्रयोगों बीमार बच्चे अनुसंधान संस्थान के लिए अस्पताल के पशु की देखभाल समिति के दिशा निर्देशों के अनुसार किया गया था।

1. पाड़ तैयारी

  1. फेफड़ों के Decellularization
    1. सीओ का उपयोग कर 2 चैम्बर वयस्क Wistar चूहों euthanize। चैम्बर में पशु रखें और प्रति मिनट चैम्बर मात्रा का 10-30% की एक भरने दर पर 100% सीओ 2 जोखिम शुरू करते हैं।
      1. बेहोशी के लिए पशु पालन; यह लगभग 2-3 मिनट के बाद हो जाएगा। बेहोशी इस समय अवधि में नहीं होती है, तो भरने की दर और चैम्बर सील की जाँच करें। बेहोशी के बाद फीका आंखों का रंग और श्वसन की कमी के लिए पशु पालन। दोनों मनाया जाता है, 1-2 मिनट के लिए बनाए रखने के लिए सीओ 2 भरने और फिर प्रक्रिया के लिए कक्ष से पशु हटा दें।
    2. forepaws और पिछले पैरों फिक्सिंग से सतह विदारक करने के लिए पशु सुरक्षित, और सीने में और 70% इथेनॉल के साथ पेट क्षेत्र नीचे स्प्रे। दिल और लू पहुंचेंउरोस्थि के साथ एक ऊर्ध्वाधर चीरा का उपयोग करते हुए वक्ष गुहा खोलने के द्वारा NGS।
    3. डायाफ्राम के माध्यम से छोटे चीरों बनाओ पहले फेफड़ों puncturing की संभावना को कम करने के फेफड़ों वापस लेना पैदा करने के लिए। एक सीवन के साथ अवर रग Cava ligate और छोटे विदारक कैंची से बाएं आलिंद में एक छोटा सा चीरा जगह है।
    4. एक 25 जी heparinized हांक संतुलित नमक समाधान (HBSS) (10 यू / मिलीलीटर HBSS में हेपरिन) के साथ भरा सुई के साथ एक तैयार 10 मिलीलीटर सिरिंज का प्रयोग, सही वेंट्रिकल में सुई डालने फेफड़े के संचलन के माध्यम से पुश करने के लिए बफर से फेफड़ों के छिड़काव शुरू (2 मिलीग्राम / मिनट की दर)। जब तक फेफड़ों सफेद बारी और तरल पदार्थ बाएं आलिंद से बहने स्पष्ट चलाता है इस प्रक्रिया को जारी रखें।
    5. छिड़काव के बाद, थायराइड उपास्थि के पास एक प्लास्टिक कैथेटर के साथ श्वासनली और Cannulate बेनकाब और एक सीवन के साथ जगह में सुरक्षित है।
    6. सेटअप एक मुंहतोड़ जवाब स्टैंड और दबाना करने के लिए एक 10 मिलीलीटर सिरिंज फिक्सिंग से एक गुरुत्वाकर्षण छिड़काव प्रणाली। निकालें और घiscard सिरिंज सवार। फेफड़ों के ऊपर 20 सेमी में सिरिंज प्रति बैरल पर अधिकतम भरने बिंदु सुरक्षित। सिरिंज के अंत में, और cannulated श्वासनली को decellularization समाधान देने के लिए पानी निकलने की टोंटी के दूसरे छोर से एक लंबी प्लास्टिक टयूबिंग के लिए एक दो तरह से पानी निकलने की टोंटी संलग्न। सिरिंज में समाधान डालो और समाधान संलग्न प्लास्टिक टयूबिंग और कैथेटर को भरने के लिए अनुमति देते हैं।
      1. 1 मिनट के लिए (लगभग 12 मिलीलीटर) कुल फेफड़ों की क्षमता को भरने के द्वारा फेफड़ों पानी से धोना और फेफड़ों से बाहर प्रवाह करने की अनुमति देने के लिए तरल पदार्थ श्वासनली से प्लास्टिक कैथेटर को हटा दें। जब फेफड़ों lavaging एच 2 ओ के 20 सेमी नीचे दबाव रखने के लिए सिरिंज से अधिक 10 मिलीलीटर भरने मत करो
    7. फेफड़ों decellularization समाधान के साथ आठ बार की दोहराएँ पानी से धोना, फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के साथ 10 rinses द्वारा पीछा किया।
    8. श्वासनली और फेफड़ों गर्दन और छाती गुहा से मुक्त काटना और जानवर से हटा दें। vibratome एसई के लिए तैयार है जब तक 4 डिग्री सेल्सियस पर ठंड पीबीएस में ऊतक रखेंctioning।
  2. मोटी अनुभाग पीढ़ी
    1. 2% के लगभग 15 मिलीग्राम और 4% (w / v) agarose, और पर्याप्त 6% (w / v) छोटे आयताकार ब्लॉकों में सभी पालियों embedding के लिए agarose तैयार करें। microwaving द्वारा पीबीएस में कम पिघलने बिंदु agarose पाउडर भंग। एक गर्मी ब्लॉक पर 50 मिलीलीटर ट्यूबों के लिए agarose स्थानांतरण और ऊपर 40 डिग्री सेल्सियस के तापमान को बनाए रखने के बीच बढ़िया तालमेल से बचने के लिए।
    2. प्रत्येक लोबार श्वसनी प्रत्येक पालि (कपाल, मध्य, सहायक, और दुम सही पालियों और छोड़ दिया पालि) छोटे कैंची का उपयोग कर अलग करने के अंत में decellularized फेफड़ों काटना। पैट शोषक पत्रक का उपयोग अतिरिक्त पीबीएस निकालें और 2% के अंदर जगह के लिए प्रत्येक पालि शुष्क (w / v) agarose जबकि हीटिंग ब्लॉक पर।
    3. agarose में कोटिंग के 5 मिनट के बाद प्रत्येक पालि निकालें, एक पेट्री डिश में डाल दिया है और सतह एक ठंडा प्लेट पर 1 मिनट के लिए जेल के लिए अनुमति देते हैं।
    4. धीरे 5 मिनट के बाद, पीठ 4% (w / v) agarose में पालियों जगह शांत, और 6% (w / v) agarose के साथ एक बार फिर कोटिंग दोहराएँ।
    5. अनुक्रमिक सह बादप्रत्येक पालि की ating, साथ किनारों से आसपास के ऊतकों agarose की कम से कम 3 मिमी धातु आधार molds का उपयोग कर 6% (w / v) agarose में अलग से प्रत्येक पालि एम्बेड। ओरिएंट प्रत्येक पालि धातु मोल्ड प्रयोगकर्ता का सामना करना पड़ की सतह पर पालि का सबसे बड़ा फ्लैट बढ़त स्थिति से संदंश का उपयोग। इस बढ़त की ओर vibratome सेक्शनिंग के लिए नमूना थाली करने के लिए तय हो जाएगा।
    6. ब्लॉकों vibratome साथ सेक्शनिंग करने से पहले कम से कम 30 मिनट के लिए ठंड प्लेट पर जेल की अनुमति दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर अप करने के लिए 12 घंटे के लिए एक humidified कक्ष में स्टोर ब्लॉकों सेक्शनिंग vibratome से पहले।
    7. सेटअप ठंड पीबीएस 12 के साथ सेक्शनिंग चैम्बर भरने के द्वारा vibratome। आसपास बर्फ स्नान के साथ सेक्शनिंग भर ठंडे तापमान को बनाए रखें। धातु नए नए साँचे से ब्लॉक को हटाने और, पालियों आसपास के अतिरिक्त agarose नीचे ट्रिम करने के लिए है, जबकि ऊतक के किनारे से लगभग 3 मिमी रखते हुए एक रेजर ब्लेड का उपयोग करें।
    8. चिपकने का उपयोग नमूना प्लेट के केंद्र के लिए ऊतक को ठीक करें, और टी में थाली डूबवह पीबीएस भरा सेक्शनिंग चैंबर। सेटअप निम्न गति, आयाम, मोटाई और मूल्यों क्रमशः चयन करके vibratome पर सीमाओं सेक्शनिंग: 0.2 मिमी / सेकंड, 1.85 मिमी, और 350 माइक्रोन।
      नोट: पालि उन्मुखीकरण के दोनों अनुदैर्ध्य और अनुप्रस्थ वर्गों स्वीकार्य हैं।
    9. धारा प्रत्येक पालि पूरी तरह से। मैन्युअल वर्गों में कटौती छोटे कैंची का उपयोग कर मुक्त अगर एक खंड को पूरी तरह से खंड दृश्य के अंत में ब्लेड से अलग नहीं है। धीरे पाड़ वर्गों लीजिए और अगले चरण तक बर्फ पर पीबीएस में रहते हैं।
      नोट: उत्पन्न धारा दोनों प्रॉक्सिमल और बाहर फेफड़ों के क्षेत्रों और दोनों स्रोतों Recellularization के लिए इस्तेमाल किया जा सकता शामिल होंगे; हालांकि, सतह का सबसे बाहर का फेफड़ों धरना देंगे।
  3. पाड़ वर्गों के परिशोधन
    1. microcentrifuge ट्यूब (अप करने के लिए 30 वर्गों / ट्यूब) के लिए पीबीएस से 350 माइक्रोन मोटी पाड़ वर्गों स्थानांतरण और nuclease के साथ व्यवहार (90 यू / पीबीएस में एमएल) (सामग्री की सूची देखें) 12 के लिए - आरटी पर 24 घंटा, परएक रोटेटर।
    2. nuclease उपचार के बाद, नए microcentrifuge ट्यूबों के लिए संदंश का उपयोग और रोगाणुरोधी आरटी पर 6 घंटे के लिए बाँझ शर्तों के तहत (पीबीएस में 200 यू / एमएल पेनिसिलिन स्ट्रेप्टोमाइसिन और 25 माइक्रोग्राम / एमएल amphotericin बी) के समाधान के लिए एक रोटेटर पर साथ इलाज के हस्तांतरण वर्गों।
      नोट: Scaffolds उपयोग करने से पहले एक सप्ताह तक 4 डिग्री सेल्सियस के लिए रोगाणुरोधी समाधान में संग्रहित किया जा सकता है।
    3. रोगाणुरोधी समाधान के साथ परिशोधन कदम के बाद, बाँझ शर्तों के तहत पीबीएस के साथ दो बार कुल्ला scaffolds और मुक्त भेदभाव मीडिया (SFDM) सीरम के लिए कोशिकाओं के साथ बोने से पहले हस्तांतरण।

2. endodermal सेल तैयार

  1. निश्चित एण्डोडर्म प्रेरण
    1. फीडर से मुक्त, सीरम मुक्त संस्कृति के तहत माउस ईएससी लाइनों 2i 13 शर्तों का उपयोग कर बनाए रखें। trypsinization द्वारा पक्षपाती pluripotent संस्कृति से कोशिकाओं को हटाने के द्वारा एण्डोडर्म प्रेरण शुरू करो।
    2. 20,000 के घनत्व पर SFDM और बीज में कोशिकाओं Resuspendमीडिया बदलाव के बिना तीन दिनों के लिए कम पक्षपाती प्लेटों में / एमएल कोशिकाओं ईबी गठन के लिए अनुमति देने के लिए।
    3. तीन दिनों के बाद धीरे ईबीएस 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूबों में एक 10 मिलीलीटर पिपेट का उपयोग हस्तांतरण और उन्हें आरटी पर 3 मिनट के लिए तल पर इकट्ठा करने के लिए अनुमति देते हैं।
    4. ध्यान से महाप्राण मीडिया और जोड़ने के ताजा SFDM मीडिया 50 एनजी / एमएल activin ए के साथ पूरक
    5. वापस एक 1 पर कम पक्षपाती प्लेटों पर बीज कोशिकाओं: 2 घनत्व और तीन अतिरिक्त दिनों के लिए संस्कृति निश्चित एण्डोडर्म भेदभाव को प्राप्त करने के लिए।
  2. निश्चित एण्डोडर्म संवर्धन
    1. दिन 6 ईबीएस लीजिए, trypsin के साथ अलग कर देना और संयुग्मित फ्लोरोसेंट एंटीबॉडी का उपयोग कर 14 सी-किट और CXCR4 अभिव्यक्ति के लिए लेबल।
    2. क्रमबद्ध लेबल दोनों मार्कर की अभिव्यक्ति के लिए प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई (FACS) का उपयोग कोशिकाओं एक समृद्ध निश्चित एण्डोडर्म आबादी 15 प्राप्त करने के लिए।

3. Recellularization सेटअप

  1. हवा तरल इंटरफेससंस्कृति सेटअप
    1. एक हाइड्रोफोबिक चल झिल्ली (8 माइक्रोन रोमकूप आकार) बाँझ संदंश का उपयोग पर SFDM से प्रत्येक decellularized पाड़ खंड (कदम 1.2.9) हस्तांतरण। सुनिश्चित करें पाड़ वर्गों झिल्ली पर समान रूप से फैले हुए हैं।
    2. क्रमशः SFDM की 1 या 0.5 मिलीग्राम, साथ कुओं को भरने से 6 या 12 अच्छी तरह प्लेटें तैयार करें। धीरे कुओं में झिल्ली जगह है, झिल्ली मीडिया के शीर्ष पर फ्लोट करने के लिए अनुमति देता है, एक हवा तरल संस्कृति सेटअप बनाने।
  2. 3 डी scaffolds के सीडिंग
    1. निश्चित एण्डोडर्म मार्कर (कदम 2.2.2) के लिए निम्नलिखित FACS, एक hemocytometer का उपयोग हल कोशिकाओं की गिनती 5 मिनट और SFDM में resuspend के लिए 400 XG पर नीचे स्पिन। एक मात्रा लगभग 100,000 कोशिकाओं / 10 μl / पाड़ युक्त प्राप्त करने के लिए कोशिकाओं Resuspend।
    2. सीधे कदम 3.1.2 से प्रत्येक तैयार खंड पर scaffolds recellularize करने के लिए, पिपेट कोशिकाओं के 10 μl।
    3. हर 48 घंटा संस्कृतियों में SFDM मीडिया बदलें। एक मामूली इच्छा पर प्लेट धारण करके पुराने मीडिया Aspirateसंस्कृति में खलल न डालें से बचने के लिए। धीरे-धीरे चल झिल्ली के डूबने को रोकने के लिए अच्छी तरह से पक्ष के साथ संस्कृति के लिए ताजा SFDM जोड़ें।
    4. परिपक्व एयरवे epithelia करने में वरीयता प्राप्त कोशिकाओं के भेदभाव को प्राप्त करने के लिए 21 दिनों के लिए हवा तरल संस्कृतियों को बनाए रखें।
      नोट: Recellularized वर्गों सेल संस्कृति 16 के दौरान किसी भी समय बिंदु पर ऊतक धुंधला और immunofluorescent (यदि) माइक्रोस्कोपी के लिए कार्रवाई की जा सकती।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

इस प्रोटोकॉल के रूप में रेखांकित किया है, निश्चित एण्डोडर्म के मजबूत भेदभाव एयरवे उपकला कोशिकाओं decellularized फेफड़ों पाड़ वर्गों पर वरीयता प्राप्त कोशिकाओं की विस्तारित संस्कृति का उपयोग कर प्राप्त किया जा सकता परिपक्व करने के लिए। यह सिफारिश की है कि decellularized scaffolds सुनिश्चित करने के लिए (1) मेजबान कोशिकाओं को पूरी तरह से हटा रहे हैं होती जा, और (2) बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन भेदभाव के लिए scaffolds उपयोग करने से पहले संरक्षित कर रहे हैं। के रूप में चित्रा 1 ए में सचित्र Decellularization, hematoxylin और eosin (एच एंड ई) और 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ ऊतक धुंधला का उपयोग का आकलन किया जा सकता है। उच्च बढ़ाई स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप (SEM) scaffolds के विश्लेषण के रूप में चित्रा 1 बी में सचित्र, मेजबान कोशिकाओं और बरकरार मैट्रिक्स वास्तुकला के अभाव की पुष्टि करता है। तनन परीक्षण और मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए immunostaining द्वारा शेष पाड़ के अतिरिक्त लक्षण वर्णन किया जा सकता है preservat सुनिश्चित करने के लिएdecellularization 16 निम्नलिखित ईसीएम के आयन।

के लिए सेल समुच्चय (ईबीएस) चित्रा 2A में सचित्र के रूप में के गठन में छह दिन परिणाम SFDM मीडिया में ESCs के गैर पक्षपाती संस्कृति। निश्चित एण्डोडर्म प्रेरण में एक उपचार के परिणाम activin के तीन दिनों के लिए। निश्चित एण्डोडर्म को ईएससी के वंश प्रतिबंध अपरेगुलेशन और एण्डोडर्म वंश जुड़े जीन और प्रोटीन 17 की अभिव्यक्ति से इसकी पुष्टि की जा सकती है, और आकृति विज्ञान माँगे नहीं किया जा सकता। एण्डोडर्म प्रेरण दक्षता का इस्तेमाल किया ईएससी लाइन के आधार पर 50-70% से पर्वतमाला। प्रयोगों माउस ईएससी लाइनों में बाहर किया गया: R1 (Nkx2-1 mCherry), जी -4 (dsRed -MST), और 129 / ओला (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), आर 1 सेल सभी डेटा इस पांडुलिपि में सचित्र उपयोग कर रहा है, जबकि लाइन। के रूप में चित्रा 2 बी में सचित्र डबल सकारात्मक CXCR4 + / सी किट + निश्चित एण्डोडर्म आबादी हल, वरीयता दी गई है3 डी फेफड़ों मचानों पर, और SFDM में हवा तरल इंटरफेस पर अप करने के लिए 21 दिनों के लिए सुसंस्कृत। यह एक तरह और संगठन सीमित है और भेदभाव के रूप में चित्रा -2 में सचित्र अवर्गीकृत कोशिकाओं की संस्कृति के साथ विषम दिन से 6 ईबीएस हासिल की है के रूप में निश्चित एण्डोडर्म के लिए संतुष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण है। मचानों पर हल कोशिकाओं द्वारा गठित संरचनाएं फेफड़ों (भ्रूण दिन 13.5) चित्रा -2 सी डी में सचित्र के रूप में विकसित की याद ताजा कर रहे हैं। हमारे अनुभव में, 100,000 हल कोशिकाओं / पाड़ की एक बोने घनत्व सबसे अच्छा पाड़ repopulation प्राप्त हुए है।

फेफड़ों के वंश को भेदभाव पाड़ संस्कृति के बाद 7 दिनों के रूप में जल्दी के रूप में मनाया जाता है। श्वासनली उपकला पूर्वज NKX2-1 और Sox2 के लिए सकारात्मक कोशिकाओं अगर confocal विश्लेषण चित्रा 3 ए में सचित्र के रूप में उपयोग करते हुए पाया जाता है। Sox2 सकारात्मक, नकारात्मक NKX2-1 कोशिकाओं की संभावना pluripotent endodermal कोशिकाओं है कि फेफड़ों ली से भेदभाव नहीं किया हैneage। अब संस्कृति के साथ इन कोशिकाओं NKX2-1 व्यक्त या microenvironment में पर्याप्त समर्थन के बिना apoptosis गुजरना करने के लिए शुरू कर सकते हैं। 21 दिन संस्कृतियों का विश्लेषण एक परिपक्व एयरवे उपकला TUBB4A + रोमक कोशिकाओं, SCGB1A1 + क्लब कोशिकाओं, और TRP63 + / KRT5 + बेसल कोशिकाओं से युक्त के रूप में चित्रा 3 बी में सचित्र आबादी का पता चलता है। 21 दिन संस्कृतियों की सतह के SEM विश्लेषण माउस एयरवेज के लिए स्टेम सेल व्युत्पन्न संस्कृतियों की रूपात्मक समानता का पता चलता है।

जब निश्चित एण्डोडर्म के साथ वरीयता प्राप्त और एक ही परिस्थितियों में सुसंस्कृत रूप में 16 से ऊपर वर्णित दोनों अलग मैट्रिक्स प्रोटीन (कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, फ़ाइब्रोनेक्टिन, laminin) और decellularized चूहे गुर्दे scaffolds फेफड़ों-वंश भेदभाव को बढ़ावा देने में असमर्थ थे। यह दर्शाता है कि फेफड़ों के व्युत्पन्न scaffolds के द्वारा बनाई गई 3 डी microenvironment seede के फेफड़ों-वंश भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए अपनी क्षमता में गुर्दे व्युत्पन्न मचानों से अलग हैडी endodermal कोशिकाओं।

आकृति 1
चित्रा 1. Decellularization तकनीक सेलुलर घटकों को निकालता है और ईसीएम बरकरार रखता है। (ए) एच एंड ई (शीर्ष पैनल) और DAPI (कम पैनल) प्राकृतिक और decellularized फेफड़े के ऊतकों का धुंधला decellularization निम्नलिखित नाभिक के अभाव दिखा। राइट पैनल इष्टतम decellularization बिना फेफड़ों से ऊतक वर्गों का उदाहरण दिखाता है। तीर, अधूरा decellularization के कारण मचानों पर शेष नाभिक दिखाने से पहले Recellularization तकनीक के अनुकूलन के महत्व पर प्रकाश डाला। स्केल बार = 25 माइक्रोन। प्राकृतिक और decellularized फेफड़ों का (बी) SEM छवियों, कोशिकाओं और decellularized मचानों पर मैट्रिक्स वास्तुकला के संरक्षण के अभाव दिखा। स्केल बार = 10 माइक्रोन। कृपया यहाँ क्लिक करेंयह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए।

चित्र 2
चित्रा 2. इष्टतम Recellularization में हल ईएससी व्युत्पन्न निश्चित एण्डोडर्म का परिणाम है। (ए) दिन 6 embryoid निकायों (ईबीएस) निश्चित एण्डोडर्म भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए एक इलाज activin के तीन दिनों के बाद। (बी) ईबीएस निश्चित एण्डोडर्म आबादी को अलग करने की सतह मार्कर CXCR4 की दोहरी अभिव्यक्ति और सी-KIT के लिए FACS के अनुसार क्रमबद्ध हैं। इस आबादी decellularized मचानों पर वरीयता प्राप्त किया जाएगा। (सी) एच एंड ई recellularized scaffolds के दिन 7 और संस्कृति के 21 दिन में धुंधला हो जाना। वाम पैनल का आयोजन का प्रतिनिधित्व करता है, एयरवे संरचनाओं की तरह हल कोशिकाओं के साथ बोने के बाद, और सही पैनल Recellularization करने से पहले कोशिकाओं की छंटाई के महत्व पर प्रकाश डाला मचानों पर बेतरतीब, अत्यधिक proliferative अवर्गीकृत कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करता है। स्केलबार = 30 माइक्रोन। (डी) एच एंड ई भ्रूण दिन 13.5 माउस फेफड़ों के धुंधला हो जाना। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
प्राकृतिक फेफड़ों मचानों पर निश्चित एण्डोडर्म की चित्रा 3. विस्तारित संस्कृति उपकला कोशिकाओं airway के लिए भेदभाव का निर्देशन। (ए) समीपस्थ फेफड़ों के पूर्वज कोशिकाओं (NKX2-1 + / Sox2 +) decellularized मचानों पर संस्कृति के सात दिनों के बाद पता चला रहे हैं। स्केल बार = 15 माइक्रोन। (बी) वाम छवि को दर्शाता है pseudostratified उपकला सेल (CDH1 +) संरचनाओं के बेसल पक्ष पर तहखाने झिल्ली प्रोटीन laminin से लाइन में खड़ा संरचनाओं परिपक्व। केंद्र और सही छवि शो परिपक्व एयरवे epithelia रोमक कोशिकाओं (TUBB4A +), CLU के साथ पूरा करेंबी कोशिकाओं (SCGB1A1 +) और बेसल कोशिकाओं (KRT5 + / TRP63 +)। वाम छवि पैमाने बार = 30 माइक्रोन; केंद्र और सही छवि पैमाने बार = 15 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

यहां वर्णित प्रोटोकॉल परिपक्व ईएससी व्युत्पन्न एयरवे केवल प्राकृतिक फेफड़ों मचानों का उपयोग कर कोई अन्य पूरकता के साथ भेदभाव को निर्देशित करने के epithelia उत्पन्न करता है। इस संस्कृति सेटअप, सीरम मुक्त, सस्ती, और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य परिभाषित किया गया है। आधार भेदभाव मीडिया की कोई वृद्धि कारक पूरकता की आवश्यकता है। स्टेम सेल व्युत्पन्न फेफड़ों उपकला कोशिकाओं को पैदा करने के लिए पहले प्रकाशित तरीकों वृद्धि कारक पूरकता के साथ 2-आयामी रणनीति है इस्तेमाल किया है वंश प्रतिबंध 3,4,8,18,19 बढ़ावा देने के लिए। परिभाषित संस्कृति की स्थिति, कार्यात्मक एयरवे कोशिकाओं, अन्य endodermal प्रजातियों (थायराइड, जिगर, अग्न्याशय) से सीमित प्रदूषण के उच्च भेदभाव दक्षता, और एक 3 डी भेदभाव microenvironment: तकनीक यहाँ वर्णित सहित कई कारणों के लिए इन तरीकों से अधिक फायदेमंद है। इस तकनीक माउस व्युत्पन्न ईसीएम के साथ इसी तरह के परिणाम पैदावार और इसलिए माउस फेफड़ों का उपयोग कर decellularized scaffolds उत्पन्न करने के लिए संशोधित किया जा सकता। चूहा व्युत्पन्न ESCs निश्चित एण्डोडर्म करने के लिए भेदभाव और का उपयोग कर इस प्रोटोकॉल भी एयरवे epithelia करने के लिए अंतर मचानों पर वरीयता प्राप्त।

Decellularized scaffolds Recellularization करने से पहले 7 दिनों के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर परिशोधन समाधान में संग्रहित किया जा सकता है। Scaffolds अब durations कार्यात्मक हो सकता है, लेकिन हम इस बात की पुष्टि करने के लिए परीक्षण नहीं किया है रखा। कुशल संगठन और भेदभाव को प्राप्त करने के लिए यह 6 दिन में activin ए गैर-एण्डोडर्म कोशिकाओं के साथ प्रेरण ईबीएस अक्सर अभिव्यक्त pluripotency मार्कर Oct4 और अगर मचानों पर वरीयता प्राप्त संगठन और करने के लिए विनिर्देश के बिना पैदा करना जारी रखेंगे निम्नलिखित FACS द्वारा निश्चित एण्डोडर्म के लिए संतुष्ट करने के लिए आवश्यक है फेफड़ों के वंश। बोने घनत्व भी सेल लाइन विशिष्टता के आधार पर मचानों की पूरी Recellularization प्राप्त करने के लिए समायोजित किया जा सकता है।

इस प्रोटोकॉल की एक सीमा है वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं को भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए अपनी असमर्थता में है। हालांकि NKX2-1 + / SOX9 + बाहर का पूर्वज कोशिकाओं मचानों पर संस्कृति के सात दिनों के बाद पता चला रहे हैं, इस आबादी 14 दिन में मौजूद नहीं है, और दिन परिपक्व प्रकार के 21. मार्करों मैं उपकला कोशिकाओं (AQP5) और प्रकार द्वितीय वायुकोशीय उपकला कोशिकाओं वायुकोशीय (SFTPB, SFTPC) पाड़ संस्कृति के दौरान किसी भी स्तर पर नहीं पाया जाता है। जबकि के रूप में यहाँ वर्णित है, मैट्रिक्स प्रोटीन और decellularized मचानों पर बचे हुए मैट्रिक्स बाध्य वृद्धि कारक एयरवे वंश भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए पर्याप्त है यह अतिरिक्त वृद्धि कारक पूरकता और जलमग्न संस्कृति की स्थिति वायुकोशीय वंश विनिर्देश को बढ़ावा देने के लिए एक आवश्यकता के कारण हो सकता है।

फेफड़ों के मचानों का उपयोग कर उपकला कोशिकाओं airway के लिए निश्चित एण्डोडर्म के भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए महत्वपूर्ण कदम decellularization प्रक्रिया का अनुकूलन है। सेलुलर घटकों पूरी तरह से जबकि मैट्रिक्स घटकों संरक्षित कर रहे हैं हटा दिया जाना चाहिए। DAPI का उपयोग कर परमाणु सामग्री के लिए ऊतक धुंधला, अल्ट्रा संरचनास्कैनिंग और संचरण इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी, और डीएनए assays के साथ scaffolds के यूराल विश्लेषण सभी सेलुलर घटकों को हटाने की पुष्टि करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ईसीएम scaffolds के प्रोटीन संरचना यदि धुंधला हो जाना और का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता मैट्रिक्स प्रोटीन के लिए immunoblot विश्लेषण: कोलेजन मैं, कोलेजन चतुर्थ, इलास्टिन, फ़ाइब्रोनेक्टिन, हेपरिन सल्फेट प्रोटेयोग्लाईकैन्स, और laminin 16।

ये स्टेम सेल व्युत्पन्न फेफड़ों epithelia ऐसे सिस्टिक फाइब्रोसिस के रूप में एयरवे संबंधी विकृतियों के रोग मॉडलिंग और दवा की खोज प्लेटफार्मों में इस्तेमाल किया जा सकता है। इस तरह के ऊतकों की मरम्मत और सेल थेरेपी के रूप में पुनर्जन्म का आवेदन पत्र में इन सेल मैट्रिक्स निर्माणों की क्षमता विभिन्न माउस मॉडल में इंजीनियर निर्माणों के vivo प्रत्यारोपण द्वारा जांच की जा सकती है। इसके अलावा, एयरवे भेदभाव के लिए इन विट्रो विधि में इस 3 डी आसानी से वृद्धि कारक उपलब्धता और सेल मैट्रिक्स संकेतन जोड़ तोड़ द्वारा प्रभावशाली फेफड़ों वंश विनिर्देश विभिन्न मापदंडों का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता हैमचानों पर भेदभाव के विभिन्न चरणों के दौरान संस्कृतियों की।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

वहाँ कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की घोषणा करने के लिए कर रहे हैं।

Acknowledgments

हम Nkx2-1 mCherry आंकड़े 1-3 में चित्रित प्रयोगों में इस्तेमाल ईएससी के लिए डॉ रोसंट और डॉ Bilodeau का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। FACS SickKids-UHN से फ्लो सुविधा में प्रदर्शन किया गया था। इस काम के संचालन के स्वास्थ्य अनुसंधान के लिए संस्थान कनाडा और नवाचार के कनाडाई फाउंडेशन से एक बुनियादी सुविधाओं अनुदान (CSCCD) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents
Perfusion solution Sigma H0777 10 U/ml heparin
Perfusion solution Gibco 14170112 dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-)
Decellularization solution BioShop CHA003 8 mM CHAPS
Decellularization solution Sigma E9884 25 mM EDTA
Decellularization solution BioShop SOD002 1 M NaCl
Decellularization solution Gibco 14190-144 dissolved in PBS
Benzonase nuclease Novagen 70664-3 90 U/ml Benzonase nuclease 
Benzonase nuclease Gibco 14190-144 diluted in PBS
Antimicrobial solution  Gibco 15140 200 U/ml penicillin streptomycin
Antimicrobial solution  Gibco 15290 25 μg/ml amphotericin B
Antimicrobial solution  Gibco 14190-144 diluted in PBS
Trypsinization  Gibco 12605-028 TrypLE
Serum free differentiation media (SFDM) Gibco IMDM 2440-053, F12 11765-054 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium
Serum free differentiation media (SFDM) Gibco 12587-010 B27 supplement (50x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM) Gibco 17502-048 N2 supplement (100x dilution)
Serum free differentiation media (SFDM) Gibco 15260-037 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin
Serum free differentiation media (SFDM) Gibco 35050-061 200 mM Glutamax
Serum free differentiation media (SFDM) Sigma M6145 4 μM monothioglycerol
Serum free differentiation media (SFDM) Sigma A4403  0.05 mg/ml ascobic acid
Endoderm induction R&D 338-AC/CF Activin A
Antibodies
CDH1 BD Biosciences 610181 Mouse, non-conjugated, 1:100
C-KIT BD Biosciences 558163 Rat, PE-Cy7, 1:100
CXCR4 BD Biosciences 558644 Rat, APC, 1:100
KRT5 Abcam ab24647 Rabbit, non-conjugated, 1:1,000
NKX2-1 Abcam ab76013 Rabbit, non-conjugated, 1:200
Laminin Novus Biologicals NB300-144 Rabbit, non-conjugated, 1:200
SCGB1A1 Santa Cruz sc-9772  Goat, non-conjugated, 1:1,000
SOX2 R&D Systems AF2018  Goat, non-conjugated, 1:400
TRP63 Santa Cruz sc-8431 Mouse, non-conjugated, 1:200
TUBB4A BioGenex MU178-UC Mouse, non-conjugated, 1:500
Goat IgG  Invitrogen A-11055 Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG  Invitrogen A-21202 Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Mouse IgG  Invitrogen A-31571 Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Rabbit IgG Invitrogen A-21206 Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200
Rabbit IgG  Invitrogen A-31573 Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200
Other Materials
Low adherent plates Nunc Z721050  Low cell binding plates,  6 wells  
Air-liquid interface membranes  Whatman 110614 Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size
Vibratome Leica VT1200S  Leica Vibratome
Tissue Adhesive Ted Pella 10033 Pelco tissue adhesive

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
  2. Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
  3. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
  4. Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
  5. Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
  6. Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
  7. Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
  8. Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
  9. Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
  10. Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
  11. Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
  12. Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
  13. Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
  14. Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
  15. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
  16. Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
  17. Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
  18. Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
  19. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).

Tags

जैव अभियांत्रिकी अंक 111 जैव अभियांत्रिकी ऊतक इंजीनियरिंग फेफड़ों इंजीनियरिंग बाह्य मैट्रिक्स फेफड़ों उपकला कोशिकाओं फेफड़े के ऊतकों एयरवे epithelia फेफड़ों भेदभाव
ईएससी व्युत्पन्न माउस श्वासनली उपकला decellularized फेफड़े Scaffolds का उपयोग कोशिकाओं की पीढ़ी
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Shojaie, S., Lee, J., Wang, J.,… More

Shojaie, S., Lee, J., Wang, J., Ackerley, C., Post, M. Generation of ESC-derived Mouse Airway Epithelial Cells Using Decellularized Lung Scaffolds. J. Vis. Exp. (111), e54019, doi:10.3791/54019 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter