脱細胞肺足場を使用してESC由来のマウス気道上皮細胞の生成
Summary
このプロトコルは、効率的に気道上皮細胞を成熟するために、マウスの胚性幹細胞由来の胚体内胚葉を指示します。この分化技術は、定義された、無血清培養の設定において、肺系統の仕様を指示するために3次元の脱細胞化肺足場を使用します。
Abstract
肺系統への分化は、増殖因子シグナル伝達、細胞 – 細胞相互作用および細胞 – マトリックス相互作用を含む複雑な環境手がかりの統合を必要とします。これにより、複雑に、肺上皮細胞への幹細胞の分化を促進するために、インビトロで肺の発達の要約は、困難でした。このプロトコルでは、脱細胞化肺足場は、肺の3次元環境を模倣し、幹細胞由来の気道上皮細胞を生成するために使用されます。マウス胚性幹細胞を、まず脱細胞化の足場上に播種されたアクチビンA内胚葉細胞と胚様体（EB）培養法を用いて内胚葉系統に分化し、最大21日間、空気 – 液体界面で培養します。この技術は、追加の増殖因子を補充せずに機能的気道上皮細胞（繊毛細胞、クラブ細胞、および基底細胞）に播種した細胞の分化を促進します。この培養の設定が定義されている、SERUメートルのない、安価で、かつ再現可能。文化の中で非肺内胚葉系統からの限られた汚染があるが、このプロトコルは、気道上皮集団を生成し、肺胞上皮細胞に上昇を与えるものではありません。このプロトコルを用いて生成された気道上皮、肺器官中および疾患モデルまたは嚢胞性線維症などの気道に関連した病態の創薬プラットフォームの細胞 – マトリックス相互作用を研究するために使用することができます。
Introduction
肺系統への多能性細胞の監督分化は、微小環境1,2で正確なシグナル伝達事象に依存しています。これにより、プロセスの動的な性質のために、in vitroで肺器官の正確なイベントを模倣するために挑戦されています。最近の報告は、肺分化3-8を達成するために、二次元培養物の可溶性増殖因子の補充と段階的系統制限戦略を使用しています。段階的な分化プロトコルにおいて、多能性細胞は、胚性幹細胞（ESC）または人工多能性幹細胞かどうかを、まず胚体内胚葉胚葉に分化させました。ホメオドメイン含有転写因子NKX2-1の表現によって識別されるように内胚葉細胞は、その後、前方内胚葉の運命に、その後、肺前駆細胞にプッシュされました。これらの肺前駆細胞はさらに、近位（気道）または遠位（肺胞）肺上皮細胞のwiに分化させました継続的な成長因子補充番目。このような2次元の戦略が肺上皮細胞を生成する際に、いくつかの成功を収めている、しかし、そこに不明瞭効率、他の内胚葉系統からの汚染の可能性、3次元（3D）構造の欠如を含むいくつかの制限があり、場合によっては、未定義の培地の使用血清補充を持ちます。脱細胞肺足場上の多能性又は分化した細胞の培養は、ますます肺上皮構造3,5,6,8,9を形成する際に播種した細胞の再生可能性を評価するためのアッセイとして使用されています。このようなレポートの文化は継続的な成長因子または血清補充と足場に細胞を播種しました。
肺の開発は、環境の合図に応答して個々の細胞の分裂、遊走、遺伝子発現および分化を含みます。細胞外マトリックス（ECM）は、構造的支持を提供することに加えて、TISSUを指示する糖タンパク質の格子でありますこれらのプロセス10,11を統合し、調節することにより、電子形態形成。優れたin vivoでの肺の発達環境を模倣するために内胚葉培養のために自然なプラットフォームとしての肺のECMスキャフォールドを使用することにより、我々は、高効率と再現性で設定定義された3D-培養中の細胞由来の気道上皮幹細胞生成しています。
ラット肺のECMスキャフォールドは、脱細胞化によって生成されただけでなく、マウスESC由来の内胚葉細胞が生成され、その後、これらの足場に播種しました。 CXCR4＆C-KITタンパク質の二重発現は、気道（近位肺）前駆細胞として同定されるSOX2＆NKX2-1発現の両方に陽性胚体内胚葉細胞のアイデンティティと細胞を示します。胚体内胚葉細胞は、 インビトロでの機能的気道上皮細胞を生成するために、最大3週間、空気液体界面（ALI）で培養しました。
このプロトコルは、definiの肺系統への分化を促進します早ければ7日のような的な内胚葉、NKX2-1 + / SOX2 +早期近位肺前駆細胞の出現で観察しました。日によって14と文化の21成熟した気道上皮細胞集団は、ネイティブマウス気道への形態学的および機能的類似性を持つ繊毛（TUBB4Aの+）、クラブ（SCGB1A1の+）、および基底（TRP63 +、KRT5 +）細胞を含む出現します。このプロトコルは、上皮細胞を気道する堅牢な差別化を実現するための3次元マトリックスの微小環境の重要性を示しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここで説明するプロトコルは他の補充との差別化を指示するために唯一の天然の肺足場を使用して、成熟したESC由来の気道上皮を生成します。この培養のセットアップは、無血清、安価で、かつ再現性の定義されています。ベース分化培地のない成長因子の補充が必要とされません。幹細胞由来の肺上皮細胞を生成するための、以前に公表された方法は、系統限定3,4,8,18,19を促進する…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
我々は、 図1〜図3に示した実験で使用したNkx2-1のmCherryをEscキー博士Rossant博士Bilodeauに感謝したいです。 FACSはSickKids-UHNフローサイトメトリーの施設で行いました。この作品は、ヘルスリサーチのためのカナダの研究所とイノベーションのカナダの財団からインフラ助成金（CSCCD）からの助成金を操作することによってサポートされていました。
Materials
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10U/mL heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90U/mL Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200U/mL penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25μg/mL amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05mg/mL ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
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