Summary
Denne protokollen dirigerer effektivt mus embryonale stamcelle-avledet definitive endoderm til modne luftveier epitelceller. Denne differensieringen teknikken bruker tre-dimensjonale decellularized lunge stillasene for å dirigere lunge avstamning spesifikasjon, i et definert, serumfritt kultur innstilling.
Abstract
Lunge avstamning differensiering krever integrering av komplekse miljø signaler som omfatter vekstfaktor-signalering, celle-celle interaksjoner og celle-matriks-interaksjoner. På grunn av denne kompleksiteten, til gjentagelse av lunge utvikling in vitro fremme differensiering av stamceller til lunge epitelceller har vært utfordrende. I denne protokollen, decellularized lunge stillasene benyttes for å etterligne den tre-dimensjonale miljøet i lunge og generere stamcelle-avledede luftveis epitelceller. Mus embryonale stamceller blir først differensiert til endoderm linjen ved hjelp av en embryoid legeme (EB) dyrkningsmetode med aktivin A. endoderm Cellene blir deretter sådd ut på decellularized stillaser og dyrket ved luft-væske-grenseflate i opp til 21 dager. Denne teknikken fremmer differensiering av seeded celler til funksjonell Airway epitelceller (Cilierte celler, klubb celler, og basal celler) uten ytterligere vekstfaktor tilskudd. Denne kulturen oppsettet er definert, serum-fri, billig, og reproduserbar. Selv om det er begrenset forurensning fra ikke-lunge endoderm linjene i kultur, denne protokollen genererer bare luftveis epitel populasjoner og ikke gir opphav til alveolære epitelceller. Airway epithelia generert med denne protokollen kan brukes til å studere celle-matriks interaksjoner under lunge organogeneseperioden og for sykdom modellering eller narkotika-discovery plattformer av luftveisrelaterte sykdommer som cystisk fibrose.
Introduction
Regissert differensiering av pluripotente celler til lungene avstamning er avhengig av presise signal hendelser i mikromiljøet 1,2. På grunn av dynamikken i denne prosessen har det vært utfordrende å etterligne de nøyaktige hendelsene i lunge organogeneseperioden in vitro. Nyere rapporter har brukt trinnvise avstamning restriksjons strategier med løselig vekstfaktor tilskudd av to-dimensjonale kulturer for å oppnå lunge differensiering 3-8. I trinn-messig differensiering protokoller, pluripotente celler, enten embryonale stamceller (ESC) eller induserte pluripotente stamceller, ble først differensiert til den definitive endoderm bakterie lag. Endodermal celler ble deretter presset til en fremre endoderm skjebne, og deretter til lunge progenitor-celler, som er identifisert ved ekspresjon av homeodomain-inneholdende transkripsjonsfaktor NKX2-1. Disse lungestamfedre ble ytterligere differensiert i proksimale (luftveier) eller distal (alveolære) lunge epitelceller with fortsatt vekst faktor tilskudd. Slike to-dimensjonale strategier har hatt en viss suksess i å generere lunge epitelceller, men det er flere begrensninger, inkludert uklare effektivitet, mulig forurensning fra andre endodermal slektsnavn, mangel på en tre-dimensjonal (3D) struktur, og i noen tilfeller bruk av udefinerte kulturer med serum tilskudd. Kultur av pluripotent eller differensierte celler på decellularized lungestillasene blir stadig mer brukt som en analyse for å vurdere den regenerative potensialet til utsådd celler til å danne tette epiteliale strukturer 3,5,6,8,9. Slike rapporter kultur seeded celler på stillasene med fortsatt vekstfaktor eller serum tilskudd.
Lunge utvikling involverer divisjonen, migrasjon, genekspresjon og differensiering av individuelle celler i respons til miljømessige signaler. Den ekstra matriks (ECM) er et rammeverk av glykoproteiner som i tillegg til å gi strukturell støtte, dirigerer tissue morphogenesis ved å integrere og regulere disse prosessene 10,11. Ved hjelp av lunge ECM stillaset som en naturlig plattform for endoderm kultur for å bedre etterligne in vivo lunge utviklingsmiljøet, har vi generert stamcelle-avledet luftveis epitelceller i et definert 3D-kultur innstilling med høy effektivitet og reproduserbarhet.
Rat lunge ECM stillasene ble generert av decellularization samt mus ESC-avledet endodermal celler ble generert og deretter sådd ut på disse stillasene. Dual uttrykk for CXCR4 & c-KIT proteiner indikerer en definitiv endoderm celle identitet og positiv for både SOX2 & NKX2-1 uttrykk er identifisert som luftveis (proksimale lunge) stamceller celler. Definitive endoderm celler ble dyrket i luften væske-grensesnittet (ALI) for opptil tre uker å lage funksjonelle Airway epitelceller in vitro.
Denne protokollen fremmer lunge avstamning differensiering av Definitiontive endoderm så tidlig som 7 dager, observert med fremveksten av NKX2-1 + / SOX2 + tidlige proksimale lunge stamfedre. Ved dag 14 og 21 av kultur modne luftveier epiteliale cellepopulasjoner dukker inkludert Cilierte (TUBB4A +), klubb (SCGB1A1 +), og basal (TRP63 +, KRT5 +) celler med morfologisk og funksjonell likhet med innfødte mus luftveiene. Denne protokollen demonstrerer viktigheten av 3D-matrix mikromiljøet for å oppnå robust differensiering til luftveis epitelceller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyreforsøk ble utført i samsvar med Animal Care komiteens retningslinjer Hospital for Sick Children Research Institute.
1. Stillas Forberedelse
- Decellularization av lungene
- Avlive voksne Wistar rotter ved hjelp av CO 2 kammer. Plasser dyr i kammeret og begynne 100% CO2 eksponering ved en fyllgrad på 10-30% av kammervolumet per minutt.
- Observere dyr for bevisstløshet; Dette vil skje etter ca 2-3 min. Hvis bevisstløshet ikke forekommer i denne tidsperioden, sjekk fyllrate og kammer segl. Etter bevisstløshet, observere dyr for falmet øyenfarge og mangel på åndedrett. Hvis begge er observert, opprettholde CO 2 fylling i 1-2 min og deretter fjerne dyr fra kammer for prosedyren.
- Sikre dyr å dissekere overflaten ved å feste forpotene og bakbena, og spray ned brystet og magen området med 70% etanol. Åpne hjertet og luNGS ved å åpne brysthulen ved hjelp av et vertikalt snitt langs brystbenet.
- Lag små snitt gjennom membranen først å forårsake lungene å trekke, noe som reduserer sjansen for punktering lungene. Ligate inferior vena cava med en sutur og plassere et lite snitt i venstre atrium med små dissekere saks.
- Ved hjelp av en forberedt 10 ml sprøyte med en 25 G nål fylt med heparinisert Hanks balanserte saltløsning (HBSS) (10 U / ml heparin i HBSS), start lunge perfusjon ved å sette nålen inn i den høyre ventrikkel for å presse bufferen gjennom lungekretsløpet (hastighet på 2 ml / min). Fortsett denne prosedyren til lungene blir hvite og væsken strømmer fra venstre atrium renner klart.
- Etter perfusjon, eksponere trakea og cannulate med et plastkateter i nærheten av skjoldbruskkjertelen og feste på plass med en sutur.
- Oppsett en tyngdekraft perfusjon system ved å feste en 10 ml sprøyte til et skarpt svar stå og klemme. Ta ut og discard sprøytestempelet. Sikre maksimal fylling punkt på sprøyten 20 cm over lungene. Fest en to-veis stoppekran til enden av sprøyten, og en lang plastrør til den andre enden av stengeventilen for å levere decellularization løsning til den kanylerte luftrøret. Hell løsningen i sprøyten og la løsningen å fylle festet plastrør og kateter.
- Kylling lungene ved å fylle til total lungekapasitet (ca. 12 ml) i 1 min og fjerne plast kateteret fra luftrøret for å tillate fluid å strømme ut av lungene. Ikke fyll sprøyte mer enn 10 ml når lavaging lungene for å holde trykket under 20 cm H 2 O.
- Gjenta utskylling av lungene åtte ganger med decellularization løsning, etterfulgt av 10 skyllinger med fosfat-bufret saltvann (PBS).
- Dissekere luftrøret og lungene fri fra halsen og brysthulen og fjerne fra dyret. Holde vevet i kald PBS ved 4 ° C inntil forberedelse for vibratome sectioning.
- Avlive voksne Wistar rotter ved hjelp av CO 2 kammer. Plasser dyr i kammeret og begynne 100% CO2 eksponering ved en fyllgrad på 10-30% av kammervolumet per minutt.
- Tykke delen generasjon
- Fremstille omtrent 15 ml av 2% og 4% (w / v) agarose, og nok til 6% (w / v) agarose for innebygging alle fliker i små rektangulære blokker. Oppløs lavt smeltepunkt agarose pulver i PBS ved mikrobølger. Overfør agarose til 50 ml-rør på en varmeblokk og opprettholde temperatur over 40 ° C for å unngå geldannelse.
- Dissekere decellularized lunge ved slutten av hver Lobar bronkier å løsne hver nese (kraniale, midtre tilbehør, og kaudale rette fliker og den venstre lapp) ved hjelp av en liten saks. Tørk hver lobe ved hjelp av absorberende ark for å fjerne overskudd av PBS og sette inn innvendig 2% (w / v) agarose, mens på varmeblokken.
- Fjern hver lapp etter 5 min av belegg i agarose, plassere i en petriskål og la overflaten gel i 1 min på en kald plate.
- Forsiktig fliker tilbake til 4% (w / v) agarose, kule etter 5 min, og gjenta belegg en gang mer med 6% (w / v) agarose.
- Etter sekvensiell cogen av hver lapp, legge hver lapp separat i 6% (w / v) agarose ved hjelp av metall-baseformer med i det minste 3 mm av agarose omgivende vev fra kantene. Orient hver lapp ved hjelp av tang ved å plassere lapp største flat kant på overflaten av metall mold mot eksperimentator. Denne kant vil være den side som er festet til prøveplate for vibratome snitting.
- Tillat blokker til gel på kald plate i minst 30 minutter før seksjonering med vibratome. Oppbevar blokker i et fuktet kammer for opp til 12 timer ved 4 ° C før vibratome snitting.
- Oppsett vibratome ved å fylle seksjonering kammer med kald PBS 12. Opprettholde kald temperatur i hele seksjonering med det omgivende isbad. Fjern blokkene fra metallformer og bruke et barberblad for å trimme ned overflødig agarose rundt lapper, mens du holder ca. 3 mm fra kanten av vevet.
- Fiks vev til sentrum av prøven plate ved hjelp av lim, og senk platen inn than PBS fylte seksjonering kammer. Oppsett seksjonering grenser for vibratome ved å velge de følgende hastighet, amplitude, og tykkelsesverdier henholdsvis: 0,2 mm / sek, 1,85 mm, og 350 um.
Merknad: Både langsgående og tverrgående partier av den flik orientering er akseptable. - § hver lapp helt. Manuelt snittavsnitt gratis ved hjelp liten saks hvis en seksjon ikke er helt atskilt av bladet ved enden av seksjonen sekvensen. Samle stillas seksjoner forsiktig og holde i PBS på is til neste trinn.
Merk: Profiler som genereres vil omfatte både nære og fjerne lunge områder og begge kilder kan brukes til recellularization; Imidlertid vil de fleste av overflaten omfatter distale lunge.
- Behandling av stillas seksjoner
- Overfør de 350 mikron tykke stillas seksjoner fra PBS til Mikrosentrifugerør (opp til 30 seksjoner / tube) og behandle med nuklease (90 U / ml i PBS) (se liste over materialer) for 12-24 timer ved RT, påen rotator.
- Etter nuklease-behandling, overføringsdelene med pinsett til nye mikrosentrifugerør og behandle med antimikrobiell oppløsning (200 U / ml penicillin og streptomycin 25 ug / ml amfotericin B i PBS) under sterile betingelser i 6 timer ved romtemperatur, på en rotator.
Merk: Stillaser kan lagres i antimikrobiell løsning for opptil én uke ved 4 ° C før bruk. - Etter dekontaminering takt med antimikrobiell løsning, skyll stillaser to ganger med PBS under sterile forhold og overføre til serum gratis differensiering media (SFDM) før såing med celler.
2. endodermal Cell Forberedelse
- Definitive endoderm induksjon
- Opprettholde mus ESC linjer under mater-fri, serumfritt kultur bruker 2i forhold 13. Begynn endoderm induksjon ved å fjerne celler fra tilhenger pluripotent kultur ved trypsinering.
- Resuspender cellene i SFDM og frø ved en tetthet på 20000celler / ml i lavtheft plater for tre dager uten media endring for å tillate EB formasjon.
- Etter tre dager forsiktig overføre EBS i 50 ml koniske rør ved anvendelse av en 10 ml pipette og tillate dem å samle seg på bunnen i 3 minutter ved RT.
- Nøye aspirer media og legge friske SFDM media supplert med 50 ng / ml activin A.
- Seed celler tilbake på lave adherente platene på en 1: 2 tetthet og dyrking i ytterligere tre dager for å oppnå endelig endoderm differensiering.
- Definitive endoderm berikelse
- Samle dag 6 EBS, distansere med trypsin og merke for c-KIT og CXCR4 uttrykk ved hjelp konjugerte fluorescerende antistoffer 14.
- Sorter merkede celler ved hjelp av fluorescens-aktivert celle sortering (FACS) for uttrykk av begge merkene for å oppnå en beriket definitive endoderm befolkningen 15.
3. Recellularization Setup
- Air-væske-grensesnittetkultur oppsett
- Overfør hver decellularized stillas seksjon (trinn 1.2.9) fra SFDM på en hydrofob flytende membran (8 mikrometer porestørrelse) ved hjelp av steril tang. Sørg stillas deler er spredt jevnt på membranen.
- Fremstille 6- eller 12-brønners plater ved å fylle brønnene med 1 eller 0,5 ml SFDM, henholdsvis. Forsiktig membraner i brønner, slik at membranen til å flyte på toppen av mediet, noe som skaper en luft flytende kultur oppsett.
- Seeding av 3D stillaser
- Følgende FACS for definitive endoderm markører (trinn 2.2.2) teller sortert celler ved hjelp av en hemocytometer, spinne ned ved 400 xg i 5 min og resuspender i SFDM. Resuspender cellene for å oppnå et volum som inneholdt ca. 100 000 celler / 10 ul / stillas.
- For å recellularize stillas, pipette 10 mL av celler direkte på hver forberedt seksjon fra trinn 3.1.2.
- Erstatt SFDM media i kulturer hver 48 time. Aspirer de gamle mediene ved å holde platen på en svak skråningfor å unngå å forstyrre kulturen. Sakte legger frisk SFDM til kultur langs siden av brønnen for å hindre synkende flytende membran.
- Oppretthold luft flytende kulturer i inntil 21 dager for å oppnå differensiering av seeded celler i å modne luftveiene epitel.
Note: Recellularized seksjonene kan bli behandlet for vev-farging og immunofluorescent (IF) mikroskopi som helst punkt i løpet av 16 cellekultur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Som beskrevet i denne protokollen, til robuste differensiering av definitive endoderm modne airway epitelceller kan oppnås ved hjelp av utvidet kultur seeded celler på decellularized lunge stillas seksjoner. Det anbefales at decellularized stillasene kjennetegnes for å sikre (1) vertsceller kan fjernes helt, og (2) ekstracellulære matrix proteiner er bevart før du bruker stillaser for differensiering. Decellularization kan vurderes ved hjelp vev farging med hematoksylin og eosin (H & E) og 4 ', 6-diamidino-2-fenylindol (DAPI), som illustrert i figur 1A. Høy forstørrelse scanning elektronmikroskop (SEM) analyse av stillas bekrefter fravær av vertsceller og intakte matrisearkitektur, som illustrert i figur 1B. Ytterligere karakterisering av de gjenværende stillaset ved strekkprøving og immunofarging for matriseproteiner kan utføres for å sikre preservation av ECM følgende decellularization 16.
Ikke-klebende kultur av ESCs i SFDM media i seks dager resulterer i dannelse av celleaggregater (EBS) som illustrert i figur 2A. Tre dager med activin en behandling fører til definitive endoderm induksjon. Lineage begrensning av ESC til definitive endoderm kan bekreftes ved oppregulering og uttrykk for endoderm avstamning assosierte gener og proteiner 17, og kan ikke gjøres gjeldende morfologisk. Endoderm-induksjon effektivitet varierer fra 50-70% avhengig av ESC linjen som brukes. Forsøkene ble utført i mus MGP linjer: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (DsRed -MST), og 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), mens alle data som er vist i dette manuskriptet bruker R1 celle linje. Den doble positive CXCR4 + / c-KIT + definitive endoderm befolkningen er sortert figur 2B, seededpå 3D-lunge stillas, og dyrket i opptil 21 dager på luft-væske-grensesnittet i SFDM. Det er viktig å sortere og anrike for definitiv endoderm som begrenses organisasjon og differensiering oppnås med kultur av usorterte celler fra heterogene dag 6 EBS som illustrert i figur 2C. Strukturer dannet av sorterte celler på stillasene er minner om utviklingen av lunge (embryodag 13,5) som illustrert i figur 2C-D. I vår erfaring, har en seeding tetthet på 100.000 sortert celler / stillas ga den beste stillaset repopulation.
Differensiering til lungene avstamning er observert så tidlig som 7 dager etter stillaset kultur. Luftveis-epitelceller stamceller som var positive for NKX2-1 og SOX2 blir detektert ved hjelp av konfokal IF-analyse som vist i figur 3A. SOX2 positiv, NKX2-1 negative celler er sannsynlig pluripotente endodermal celler som ikke har differensiert til lungen lineage. Med lengre kulturen disse cellene kan begynne å uttrykke NKX2-1 eller gjennomgå apoptose uten tilstrekkelig støtte i mikromiljøet. IF analyse av dag 21 kulturer avslører en moden airway epithelial populasjon inneholdende TUBB4A + cilierte celler, SCGB1A1 + klubb-celler, og TRP63 + / + KRT5 basale celler som vist på figur 3B. SEM analyse av overflaten på dag 21 kulturer viser morfologisk likhet mellom stamcelle-avledet kulturer for museluftveiene.
Både isolerte matrix proteiner (kollagen I, kollagen IV, fibronektin, laminin) og decellularized rotte nyre stillas var i stand til å fremme lunge-avstamning differensiering når sådd med definitive endoderm og dyrket under samme betingelser som beskrevet ovenfor 16. Dette viser at 3D-mikromiljøet skapt av lunge-avledet stillasene er forskjellig fra nyre-avledet stillasene i sin evne til å fremme lunge-avstamning differensiering av seeded endodermal celler.
Figur 1. Decellularization teknikk fjerner cellulære komponenter og bevarer ECM. (A) H & E (topplaten) og DAPI (nedre panel) farging av naturlige og decellularized lungevev som viser fravær av kjerner følgende decellularization. Høyre panel viser eksempler på vevssnitt fra lungene uten optimal decellularization. Pilspisser viser gjenværende kjerner på stillaser på grunn av ufullstendig decellularization, fremhever viktigheten av å optimalisere teknikken før recellularization. Scale bar = 25 mikrometer. (B) SEM bilder av naturlige og decellularized lunge, som viser fravær av celler og bevaring av matrise arkitektur på decellularized stillaser. Scale bar = 10 mikrometer. Klikk herfor å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Ordnet ESC-avledet definitive endoderm resulterer i optimal recellularization. (A) Dag 6 embryoid organer (EBS) etter tre dager med activin En behandling for å fremme definitive endoderm differensiering. (B) EBS er sortert ved hjelp av FACS for dual ekspresjon av overflatemarkører CXCR4 og c-KIT for å isolere den definitive endoderm befolkningen. Denne befolkningen vil bli seedet på decellularized stillaser. (C) H & E farging av recellularized stillaser på dag 7 og dag 21 av kulturen. Venstre panel representerer organisert, luftveislignende strukturer etter seeding med sorterte celler, og panel høyre representerer uorganisert, svært proliferative usorterte celler på stillaser fremhever viktigheten av sortering av celler før recellularization. Scalebar = 30 mikrometer. (D) H & E farging av embryonale dag 13,5 muse lungene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Utvidet kultur definitive endoderm på naturlige lungestillasene dirigerer differensiering til luftveis epitelceller. (A) proksimal lunge stamceller (NKX2-1 + / SOX2 +) blir oppdaget etter syv dager med kultur på decellularized stillaser. Scale bar = 15 mikrometer. (B) Venstre bilde viser modne pseudostratified epiteliale celle (CDH1 +) strukturer omgitt av basalmembranprotein laminin på basal side av strukturer. Senter og høyre bilde viser modne luftveis epithelia komplett med ciliated celler (TUBB4A +), club celler (SCGB1A1 +) og basal celler (KRT5 + / TRP63 +). Venstre bilde skala bar = 30 mikrometer; midtre og høyre bilde skala bar = 15 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen er beskrevet her genererer modne ESC-avledet luftveis epitel med kun naturlig lunge stillasene til direkte differensiering med ingen andre tilskudd. Denne kulturen oppsettet er definert, serum-fri, billig, og reproduserbar. Ingen vekstfaktor tilskudd av basen differensiering media er nødvendig. Tidligere publiserte metoder for å generere stamcelle-avledet lunge epitelceller har brukt to-dimensjonale strategier med vekstfaktor tilskudd for å fremme avstamning begrensning 3,4,8,18,19. Teknikken som beskrives her er fordelaktig i disse metodene for flere grunner, blant annet: definert kultur betingelser, høy differensiering effektivitet til funksjonelle Airway celler, begrenset forurensning fra andre endodermal linjene (skjoldbruskkjertel, lever, bukspyttkjertel), og en 3D differensiering mikromiljøet. Denne teknikken gir tilsvarende resultater med mus-avledet ECM og kan derfor bli endret for å generere decellularized stillas ved hjelp av muselunger. Rat-avledet ESCs differensiert til definitive endoderm og sådd ut på stillasene ved hjelp av denne protokollen også differensiere til luftveis epitel.
Decellularized stillasene kan lagres i dekontaminering løsning ved 4 ° C i opp til 7 dager før recellularization. Stillaser holdt for lengre varighet kan være funksjonelle, men vi har ikke testet for å bekrefte dette. For å oppnå effektiv organisasjon og differensiering er det nødvendig å anrike for definitive endoderm ved FACS etter induksjon med activin A. Non-endoderm celler i dag 6 EBS ofte uttrykker pluripotency markør Oct4 og hvis seedet på stillasene vil fortsette å spre seg uten organisasjon og spesifikasjon til lunge avstamning. Den seeding tetthet kan også justeres basert på cellelinje-spesifisitet for å oppnå fullstendig recellularization av stillas.
En begrensning av denne protokollen er i sin manglende evne til å fremme differensiering til alveolære epitelceller. selv NKX2-1 + / SOX9 + distal stamceller blir oppdaget etter syv dager med kultur på stillasene, er dette befolkningen ikke tilstede på dag 14 og dag 21. Markører av modne type I alveolære epitelceller (AQP5) og type II alveolære epitelceller (SFTPB, SFTPC) ikke blir oppdaget på noe tidspunkt under stillaset kultur. Dette kan skyldes en forutsetning for ytterligere vekst faktor tilskudd og nedsenkede dyrkningsforhold for å fremme alveolær avstamning spesifikasjon, mens slik det er beskrevet her, matrix proteiner og rest matrix-bundet vekstfaktorer på decellularized stillasene er tilstrekkelig for å fremme luftveis avstamning differensiering.
Det kritiske trinnet for å fremme differensiering av definitive endoderm til luftveis epitelceller ved hjelp av lungestillasene er optimalisering av decellularization prosessen. Cellulære komponenter må fjernes helt, mens matrisekomponenter er bevart. Tissue farging for kjernefysisk materiale ved hjelp av DAPI, ultra-structural analyse av stillas med scanning og transmisjonselektronmikroskopi, og DNA-analyser kan anvendes for å bekrefte at fjerning av alle cellulære komponenter. ECM protein sammensetningen av stillas kan vurderes ved hjelp IF flekker og immunoblot analyse for matrix proteiner: kollagen jeg, kollagen IV, elastin, fibronektin, heparin sulfat proteoglykaner og laminin 16.
Disse stamcelle-avledet lunge epitel kan brukes i sykdoms modellering og medikament-oppdagelse plattformer av luftveis-relaterte sykdommer som cystisk fibrose. Potensialet av disse celle-matrix konstruksjoner i regenerativ applikasjoner som vev reparasjon og celleterapi kan bli undersøkt ved in vivo transplantasjon av konstruerte konstruksjoner i ulike musemodeller. Videre kan denne 3D in vitro metode for differensiering luftvei lett tilpasses for å studere forskjellige parametre som påvirker avstamning spesifikasjon lunge ved å manipulere vekstfaktor tilgjengelighet og celle-matriks signaleav kulturer under forskjellige stadier av differensiering på stillasene.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Det er ingen konkurrerende økonomiske interesser å erklære.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke dr Rossant og Dr. Bilodeau for Nkx2-1 mcherry ESC brukt i eksperimenter vist i figur 1-3. FACS ble utført i Den SickKids-uhn flowcytometrisystemer Facility. Dette arbeidet ble støttet av driftstilskudd fra den kanadiske Institutes for Health Research og en infrastruktur stipend (CSCCD) fra kanadiske Foundation of Innovation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
