Summary
Dieses Protokoll leitet effizient embryonalen Maus-Stammzellen abgeleiteten endgültigen Endoderm Epithelzellen der Atemwege zu reifen. Diese Differenzierung Technik verwendet 3-dimensional dezellularisierte Lungengerüste Lungen lineage Spezifikation, in einem definierten, serumfreien Kultureinstellung zu lenken.
Abstract
Lung lineage Differenzierung erfordert Integration komplexer Umweltreize, die Wachstumsfaktor-Signalgebung umfassen Zell-Zell-Wechselwirkungen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Aufgrund dieser Komplexität ist herausfordernd Rekapitulation der Lungenentwicklung in vitro Differenzierung von Stammzellen zu Lungenepithelzellen zu fördern. In diesem Protokoll werden dezellularisierte Lungengerüste verwendet, um die 3-dimensional Umgebung der Lunge zu imitieren und Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege zu erzeugen. embryonalen Stammzellen der Maus werden zunächst in die endoderm Linie differenziert, um eine Embryoidkörperbildung (EB) Kulturverfahren unter Verwendung von mit Activin A. Endoderm Zellen werden dann auf dezellularisiert Gerüste und kultiviert bei Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche für bis zu 21 Tage. Diese Technik fördert die Differenzierung von ausgesäten Zellen zu funktionellen Epithelzellen der Atemwege (Zilienzellen, Club-Zellen, und basalen Zellen) ohne zusätzliche Wachstumsfaktor Ergänzung. Diese Kultur Setup definiert ist, serum frei, kostengünstig und reproduzierbar ist. Obwohl es nur begrenzte Kontamination von nicht-Lungen-endoderm Abstammungslinien in Kultur ist, erzeugt dieses Protokoll nur epithelialen Populationen Atemwegs und führt nicht zu Alveolarepithelzellen geben. Airway Epithelien mit diesem Protokoll erzeugt wird, kann verwendet werden, Zell-Matrix-Interaktionen während Lunge Organogenese und für Krankheitsmodelle oder Drogen-Entdeckung Plattformen der Atemwegsbedingten Krankheiten wie Mukoviszidose zu studieren.
Introduction
Regie Differenzierung von pluripotenten Zellen in die Lunge Linie ist abhängig von präzisen Signalereignisse in der Mikroumgebung 1,2. Aufgrund der dynamischen Natur dieses Prozesses schwierig es ist , die genauen Vorgänge von Lungen Organogenese in vitro nachzuahmen. Jüngste Berichte haben schrittweise lineage Beschränkungsstrategien mit löslichen Wachstumsfaktor Supplementierung von zweidimensionalen Kulturen verwendet , um Lungendifferenzierung 3-8 erzielen. In schrittweise Differenzierung Protokolle, pluripotente Zellen, ob embryonale Stammzellen (ESC) oder induzierte pluripotente Stammzellen wurden zuerst auf die endgültige Endoderm Keimschicht unterschieden. Endodermalen Zellen wurden anschließend in einer anterioren Endoderm Schicksal geschoben und danach Lungen Progenitorzellen, wie durch die Expression von homeodomain enthaltenden Transkriptionsfaktor NKX2-1 identifiziert. Diese Lungen Vorläufern wurden weiter nach proximal differenzierten (Atemweg) oder distalen (alveolären) Lungenepithelzellen with weiterhin Wachstumsfaktor Ergänzung. Solchen 2-dimensional Strategien gewissen Erfolg gehabt haben Lungenepithelzellen bei der Erzeugung sind jedoch mehrere Einschränkungen, einschließlich unklar Wirkungsgrade, eine mögliche Kontamination von anderen endodermalen Abstammungslinien, das Fehlen eines 3-dimensionalen (3D) Struktur, und in einigen Fällen verwenden undefinierter Kulturen mit Serumergänzung. Kultur pluripotenter oder differenzierten Zellen auf dezellularisierten Lungengerüste wird zunehmend als ein Assay verwendet , um das Regenerationspotential gesäten Zellen in Bilden Lungenepithelzellen Strukturen 3,5,6,8,9 zu beurteilen. Solche Berichte Kulturzellen auf Gerüsten mit anhaltendem Wachstumsfaktor oder Serum-Supplementierung ausgesät.
Lungenentwicklung beinhaltet die Division, die Migration, die Genexpression und Differenzierung von einzelnen Zellen als Reaktion auf Umweltreize. Die extrazelluläre Matrix (ECM) ein Gitterwerk von Glykoproteinen, die zusätzlich zur strukturellen Unterstützung, lenkt tissue Morphogenese durch die Integration und diese Prozesse 10,11 regulieren. Durch die Verwendung von Kultur die Lunge ECM Gerüst als natürliche Plattform für Endoderm um besser auf die in vivo - Lungenentwicklungs milieu nachahmen, haben wir Stammzellen abgeleiteten Epithelzellen der Atemwege in einem definierten 3D-Kultur erzeugt mit hoher Effizienz und Reproduzierbarkeit einstellen.
Rattenlunge ECM Gerüste wurden von Dezellularisierung erzeugt sowie Maus ESC-derived Entodermzellen wurden erzeugt und anschließend ausgesät auf diese Gerüste. Dual-Expression von CXCR4 und c-KIT-Proteine zeigt eine definitive endoderm Zellidentität und Zellen, die positiv für beide SOX2 & NKX2-1 Ausdruck als Atemweg (proximal Lunge) Vorläuferzellen identifiziert. Definitive Entodermzellen wurden bei Luft Flüssigkeit - Grenzfläche (ALI) für bis zu drei Wochen funktionelle Epithelzellen der Atemwege in vitro zu erzeugen.
Dieses Protokoll fördert Lungen lineage Differenzierung von definitive endoderm so früh wie 7 Tage mit der Entstehung von NKX2-1 beobachtet + / SOX2 + frühen proximalen Lungen Vorläufern. Am Tag 14 und 21 der Kultur reifen Atemwegsepithelzellen Zellpopulationen emerge einschließlich bewimpert (TUBB4A +), Club (SCGB1A1 +) und basalen (TRP63 +, KRT5 +) Zellen mit morphologischen und funktionellen Ähnlichkeit mit nativem Maus Atemwege. Dieses Protokoll zeigt die Bedeutung der 3D-Matrix-Mikroumgebung zur Erzielung robust Differenzierung Epithelzellen Atemwege.
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Protocol
Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den Animal Care Committee Richtlinien des Hospital for Sick Children Research Institute durchgeführt.
1. Scaffold Vorbereitung
- Dezellularisierung der Lunge
- Euthanize erwachsenen Wistar - Ratten mit CO 2 Kammer. Platzieren Tier in der Kammer und starten 100% CO 2 Exposition bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute.
- Beobachten Tier für Bewusstlosigkeit; Dies wird nach ca. 2-3 min auftreten. Wenn Bewusstlosigkeit in dieser Zeit nicht auftritt, überprüfen Rate und Kammerdichtung zu füllen. Nach Bewusstlosigkeit, beobachten Tier für verblasste Augenfarbe und mangelnde Atmung. Wenn beide beobachtet werden, halten CO 2 Füllung für 1-2 min und dann Tier für das Verfahren aus der Kammer zu entfernen.
- Sichere Tier Oberfläche Sezieren von forepaws und Hinterbeine Fixierung und sprühen Sie die Brust und Bauchbereich mit 70% Ethanol. Besuchen Sie das Herz und die luNGS durch die Brusthöhle mit einem vertikalen Schnitt entlang des Brustbeins zu öffnen.
- Machen Sie zuerst kleine Schnitte durch Zwerchfell die Lunge verursachen zurückzuziehen, wodurch die Chance auf die Lunge Punktierung. Ligieren die untere Hohlvene mit einer Naht und legen Sie einen kleinen Schnitt in den linken Vorhof mit kleinen Dissektionsscheren.
- Verwendung einer vorbereiteten 10 ml-Spritze mit einer Nadel 25 G gefüllt mit heparinisierter Hanks balancierter Salzlösung (HBSS) (10 U / ml Heparin in HBSS), Lungenperfusion starten, indem die Nadel in den rechten Ventrikel Einführen des Puffers durch den Lungenkreislauf zu drücken, (Rate von 2 ml / min). Wiederholen Sie diesen Vorgang, bis die Lungen weiß und die Flüssigkeit aus dem linken Vorhof fließt klar ist.
- Im Anschluss an die Perfusion, setzen die Trachea und kanülieren mit einem Kunststoff-Katheter in der Nähe des Schildknorpels und befestigen Sie sie mit einer Naht.
- Richten Sie eine Schwere Perfusionssystem durch einen 10-ml-Spritze an ein Stativ und Klemmbefestigung. Entfernen und discard Spritzenkolben. Sichern Sie die maximale Füllung Punkt auf Spritzenzylinder bei 20 cm über der Lunge. Befestigen einen Zweiwegehahn bis zum Ende der Spritze, und einem langen Kunststoffschlauch mit dem anderen Ende des Absperrventils zur Dezellularisierung Lösung des kanülierten Trachea zu liefern. Gießen Lösung in die Spritze und lassen Lösung beigelegten Kunststoffschlauch und Katheter zu füllen.
- Lavage die Lunge durch bis zur Gesamtlungenkapazität Füllung (ca. 12 ml) für 1 min und entfernen Sie die Kunststoff-Katheter aus der Trachea der Flüssigkeit zu ermöglichen, aus der Lunge fließen zu lassen. Nicht Spritze mehr als 10 ml füllen , wenn die Lunge lavaging Druck zu halten , unter 20 cm H 2 O
- Wiederholen Lavage von Lungen achtmal mit Dezellularisierungslösung, gefolgt von 10 Spülungen mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS).
- Präparieren Sie die Luftröhre und Lunge frei von Hals und Brusthöhle, und entfernen Sie aus dem Tier. Halten Gewebe in kaltem PBS bei 4 ° C bis zur Vorbereitung für Vibratom sectioning.
- Euthanize erwachsenen Wistar - Ratten mit CO 2 Kammer. Platzieren Tier in der Kammer und starten 100% CO 2 Exposition bei einer Füllrate von 10 bis 30% des Kammervolumens pro Minute.
- Thick Abschnitt Generation
- Bereiten ca. 15 ml 2% und 4% (w / v) Agarose und genug 6% (w / v) Agarose für alle Ausbuchtungen in kleine rechteckige Blöcke eingebettet werden. Löse mit niedrigem Schmelzpunkt Agarose-Pulver in PBS durch Erhitzen in der Mikrowelle. Übertragen, um die Agarose zu 50 ml Röhrchen auf einem Heizblock und aufrechtzuerhalten Temperatur über 40 ° C ein Gelieren zu vermeiden.
- Präparieren dezellularisierter Lunge am Ende jedes lobar Bronchus jeder Lappen (Schädel-, Mitte, Zubehör und Schwanz rechten Lappen und der linke Lappen) mit einer kleinen Schere zu lösen. Pat trocknen jeder Lappen Absorptionslagen unter Verwendung von überschüssigem PBS zu entfernen und innerhalb 2% (w / v) Agarose, während auf dem Heizblock schalten.
- Entfernen Sie jede Lappen nach 5 min von Beschichtung in Agarose, in einer Petrischale und lassen Sie die Oberfläche für 1 min auf eine kalte Platte zu gelieren.
- Sanft Lappen in 4% Platz zurück (w / v) Agarose, cool nach 5 min und Beschichtung wiederholen noch einmal mit dem 6% (w / v) Agarose.
- Nach aufeinanderfolgenden Cotriebs jedes Lappens, einzubetten jeder Lappen separat in 6% (w / v) Agarose unter Verwendung von Metallgrundformen mit zumindest 3 mm aus Agarose, das Gewebe von den Kanten umgeben. Orient jeder Lappen mit einer Pinzette durch die größte flache Kante des Lappens Positionierung an der Oberfläche der Metallform der Experimentator gegenüber. Diese Kante wird die Seite für Vibratom Schnitte zur Probenplatte befestigt sein.
- Lassen Sie Blöcke für mindestens 30 min auf kalte Platte zu gelieren, bevor sie mit Vibratom dem Schneiden. Store Blöcke in einer befeuchteten Kammer für bis zu 12 Stunden bei 4 ° C vor sectioning zu Vibratom.
- Richten Sie die Vibratom durch die Schneidekammer mit kaltem PBS 12 zu füllen. Pflegen kalten Temperaturen mit dem umgebenden Eisbad ganzen sectioning. Entfernen Sie Blöcke aus Metallformen und die Verwendung einer Rasierklinge überschüssige Agarose umgebende Lappen zu trimmen, während etwa 3 mm vom Rand des Gewebes zu halten.
- Fix Gewebe in die Mitte der Probenplatte Kleber und versenken Platte in ter PBS gefüllten Schneideraum. Setup-sectioning Grenzen auf Vibratom indem Sie die folgenden Geschwindigkeit, Amplitude und Dickenwerte jeweils: 0,2 mm / sec, 1,85 mm, und 350 & mgr; m.
Hinweis: Die beiden Längs- und Querschnitte des Lappens Orientierung akzeptabel sind. - Abschnitt jeder Lappen vollständig. Manuell geschnittenen Abschnitte kleine Schere kostenlos mit, wenn ein Abschnitt nicht vollständig durch das Blatt am Ende des Abschnitts Sequenz getrennt ist. Sammeln Sie Gerüstabschnitte sanft und halten in PBS auf Eis bis zum nächsten Schritt.
Hinweis: generierte Abschnitte wird sowohl die proximalen und distalen Lungenbereiche und beide Quellen können für Rezellularisierung verwendet werden; Allerdings werden die meisten von der Oberfläche distal Lunge umfassen.
- Dekontamination von Gerüstteile
- Übertragen Sie die 350 Mikrometer dicke Gerüstabschnitte von PBS zu Mikrozentrifugenröhrchen (bis zu 30 Abschnitte / Röhrchen) und Behandlung mit Nuklease (90 U / ml in PBS) (siehe Liste der Materialien) für 12 bis 24 h bei RT, aufeinen Rotator.
- Folgende Nuclease-Behandlung, Übertragungsabschnitte Pinzetten in neue Mikrozentrifugenröhrchen und behandle mit antimikrobielle Lösung (200 U / ml Penicillin-Streptomycin und 25 & mgr; g / ml Amphotericin B in PBS) unter sterilen Bedingungen für 6 h bei RT, auf einem Rotator verwenden.
Hinweis: Scaffolds kann vor der Verwendung bei 4 ° C für bis zu einer Woche in antimikrobiellen Lösung gelagert werden. - Im Anschluss an die Dekontaminationsschritt mit antimikrobiellen Lösung gründlich Gerüste zweimal mit PBS unter sterilen Bedingungen und Transfer zum freien Differenzierung Medien (SFDM) vor dem Impfen mit Zellen Serum.
2. Endodermal Zellpräparation
- Definitive Endoderm Induction
- Pflegen Maus ESC Linien unter Feeder frei, Serum freie Kultur mit 2i Bedingungen 13. Starten Sie endoderm Induktion von Zellen aus adhärenten pluripotenten Kultur durch Trypsinisierung entfernt.
- Die Zellen in SFDM und Samen bei einer Dichte von 20.000Zellen / ml in niedrig anhaftende Platten für drei Tage ohne Medienwechsel für EB Bildung zu ermöglichen.
- Nach drei Tagen sanft die EBs in 50 ml konische Röhrchen übertragen Sie eine 10 ml-Pipette und lassen Sie sie für 3 min bei RT am Boden zu sammeln.
- Sorgfältig absaugen Medien und frische SFDM Medien hinzufügen, mit 50 ng / ml Activin A. ergänzt
- Samenzellen wieder auf den niedrigen anhaftenden Platten bei einer 1: 2-Dichte und die Kultur für drei weitere Tage definitive Endoderm Differenzierung zu erreichen.
- Definitive endoderm Anreicherung
- Sammeln Tag 6 EBs, distanziere mit Trypsin und beschriften für c-KIT und CXCR4 - Expression konjugierten fluoreszierenden Antikörpern 14 verwendet wird .
- Sortier markierten Zellen fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung (FACS) zur Expression beider Marker unter Verwendung von 15 eine angereicherte Population definitive Endoderm zu erhalten.
3. Rezellularisierung-Setup
- Luft-Flüssigkeits-GrenzflächeKultur-Setup
- Übertragen jedes dezellularisierter Gerüstabschnitt (Schritt 1.2.9) von SFDM auf eine hydrophobe schwebenden Membran (8 & mgr; m Porengröße) mit einer sterilen Pinzette. Stellen Sie sicher, Gerüstteile sind gleichmäßig auf der Membran verteilt.
- Bereiten 6- oder 12-Well-Platten mit Vertiefungen mit 1 oder 0,5 ml SFDM bzw. Füllung. Sanft legen Sie Membranen in die Vertiefungen, so dass die Membran auf der Oberseite der Medien zu schweben, eine Luft-Flüssigkeit-Kultur Einrichtung zu schaffen.
- Seeding von 3D-Gerüste
- Nach FACS für die endgültige Endoderm Marker (Schritt 2.2.2) sortierten Zellen zählen ein Hämozytometer, Spin-down bei 400 xg für 5 min und resuspendieren in SFDM verwenden. Die Zellen mit einem Volumen, das etwa 100.000 Zellen / 10 & mgr; l / Gerüst zu erhalten.
- Um recellularize Gerüste, Pipette 10 ul Zellen direkt auf jedem vorbereiteten Abschnitt aus Schritt 3.1.2.
- Ersetzen SFDM Medien in Kulturen alle 48 Stunden. Absaugen die alten Medien durch die Platte mit einem leichten Gefälle hältAufbrechen der Kultur zu vermeiden. Langsam frische SFDM zu Kultur entlang der Seite des Brunnenbau von schwimmenden Membran zu verhindern.
- Pflegen Luft-Flüssigkulturen für bis zu 21 Tage Differenzierung von ausgesäten Zellen in zu reifen Atemwegsepithelien zu erreichen.
Hinweis: rezellularisiertes Abschnitte können zur Gewebefärbung und Immunofluoreszenz (IF) Mikroskopie zu jedem Zeitpunkt während der Zellkultur 16 verarbeitet werden.
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Representative Results
Wie in diesem Protokoll skizzierten robust Differenzierung definitive Endoderm zu reifen Atemwegsepithelzellen unter Verwendung von erweiterten Kultur beimpft Zellen auf dezellularisierten Gerüsts Lungenabschnitte erreicht werden kann. Es wird empfohlen, dezellularisierte Gerüste (1) Wirtszellen vollständig entfernt, um sicherzustellen, charakterisiert sind, und (2) extrazelluläre Matrix-Proteine werden vor der Verwendung von Gerüsten für die Differenzierung erhalten. Dezellularisierung kann unter Verwendung von Gewebefärbung mit Hämatoxylin und Eosin (H & E) und 4 'bewertet werden, 6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), wie in 1A veranschaulicht. Hochvergrößernden Rasterelektronenmikroskop (SEM) -Analyse von Gerüsten bestätigt die Abwesenheit von Wirtszellen und intakten Matrix - Architektur, wie in 1B veranschaulicht. Weitere Charakterisierung der übrigen Gerüst durch Zugversuch und Immunofärbung für Matrixproteine können preservat sicherzustellen erfolgenIon des ECM folgenden Dezellularisierung 16.
Nicht-adhärente Kultur von WSR in SFDM Medien für sechs Tage führt zur Bildung von Zellaggregaten (EBs) , wie in 2A veranschaulicht. Drei Tage einer Behandlung führt zu einer endgültigen endoderm Induktion Activin. Lineage Einschränkung des ESC , um endgültige Endoderm kann durch upregulation und die Expression von endoderm abstammungs assoziierten Gene und Proteine 17 und geltend gemacht werden kann morphologisch nicht bestätigt werden. Endoderm-Induktionseffizienz im Bereich von 50-70% in Abhängigkeit von der ESC Linie verwendet. Die Experimente wurden in Maus ESC Linien durchgeführt: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (dsRed -MST) und 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), während alle in diesem Manuskript dargestellten Daten werden mit der R1 - Zelle Linie. Die doppelte positive CXCR4 + / c-KIT + endgültige Endoderm Bevölkerung ist , wie in 2B dargestellt ist sortiert, entkerntauf 3D-Lungengerüste und kultiviert für bis zu 21 Tage an der Luft-Flüssigkeit-Grenzfläche in SFDM. Es ist wichtig für die endgültige Endoderm zu sortieren und zu bereichern , wie beschränkt Organisation und Differenzierung mit Kultur von unsortierten Zellen aus heterogenen Tag 6 EBs erreicht wird , wie in 2C dargestellt. Strukturen von sortierten Zellen auf Gerüsten gebildet erinnern an Lunge (Embryonaltag 13,5) , wie dargestellt in Figur 2C-D zu entwickeln. Nach unserer Erfahrung hat eine Aussaatdichte von 100.000 sortierten Zellen / Gerüst das beste Gerüst Neubesiedlung ergab.
Die Differenzierung in die Lunge Linie wird so früh wie 7 Tage nach der Gerüst Kultur beobachtet. Airway epithelialen Vorläuferzellen positiv für NKX2-1 und SOX2 verwenden IF konfokale Analyse , wie in 3A dargestellt erkannt. SOX2 positiv sind NKX2-1 negative Zellen wahrscheinlich pluripotent endodermalen Zellen, die in die Lunge li differenziert haben nichtneage. Bei längeren Kultur können diese Zellen beginnen NKX2-1 zum Ausdruck bringen oder Apoptose ohne ausreichende Unterstützung in der Mikroumgebung unterziehen. ZF - Analyse 21 Kulturen von Tag zeigt einen reifen Bevölkerung Atemwegsepithelzellen enthält TUBB4A + Zilienzellen, SCGB1A1 + Club - Zellen und TRP63 + / KRT5 + basalen Zellen , wie in 3B dargestellt. SEM-Analyse der Oberfläche von Tag 21 Kulturen zeigt morphologische Ähnlichkeit von Stammzellen abgeleiteten Kulturen Maus airways.
Beide isolierten Matrixproteinen (Kollagen I, Kollagen IV, Fibronectin, Laminin) und dezellularisierten Rattenniere Scaffolds konnten Lungen lineage Differenzierung zu fördern , wenn sie mit definitive Endoderm und kultiviert unter den gleichen Bedingungen wie oben ausgesät 16 beschrieben. Dies zeigt, dass die von der Lunge abgeleitete Gerüste erstellt 3D-Mikroumgebung von Niere stamm Gerüste in seiner Fähigkeit unterscheidet Lungen-Linie Differenzierung von seede zu fördernd Entodermzellen.
Abbildung 1. Dezellularisierung Technik entfernt zellulären Komponenten und bewahrt ECM. (A) H & E (oben) und DAPI (unteres Bild) Färbung von natürlichen und dezellularisierter Lungengewebe zeigt die Abwesenheit von Keimen folgenden Dezellularisierung. Rechte Bild zeigt Beispiele von Gewebeschnitten aus den Lungen ohne optimale Dezellularisierung. Pfeilspitzen zeigen verbleibenden Kerne auf Gerüsten aufgrund unvollständiger Dezellularisierung, was die Bedeutung Technik vor Rezellularisierung zu optimieren. Maßstabsbalken = 25 & mgr; m. (B) REM - Aufnahmen von natürlichen und dezellularisierter Lunge, zeigt Abwesenheit von Zellen und die Erhaltung der Matrix - Architektur auf dezellularisierter Gerüste. Maßstabsbalken = 10 & mgr; m. Bitte klicken Sie hiereine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Sortiert ESC-derived endgültige Endoderm Ergebnisse in optimalen Rezellularisierung. (A) 6. Tag Embryoidkörpern (EVG) nach drei Tagen eine Behandlung zur Förderung der endgültigen endoderm Differenzierung Activin. (B) Die EBs werden durch FACS für Dual - Expression von Oberflächenmarkern CXCR4 und c-KIT sortiert die endgültige Endoderm Bevölkerung zu isolieren. Diese Population wird auf dezellularisierter Gerüste ausgesät werden. (C) H & E - Färbung von rezellularisiertes Gerüste am Tag 7 und Tag 21 der Kultur. Linke Seite stellt organisiert, Atemwegs-ähnliche Strukturen mit sortierten Zellen nach dem Aussäen und rechte Tafel stellt desorganisiert, hochproliferative unsortierten Zellen auf Gerüsten streichen die Bedeutung der vor Rezellularisierung von Zellen zu sortieren. Rahmenbar = 30 & mgr; m. (D) H & E - Färbung von embryonalen Tag 13,5 der Mäuselunge. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Erweiterte Kultur endgültiger endoderm auf natürliche Lungengerüste leitet Differenzierung Epithelzellen zu Atemwegs. (A) Proximale Lungen Progenitorzellen (NKX2-1 + / SOX2 +) werden nach sieben Tagen nach der Kultur auf dezellularisierter Gerüste erkannt. Maßstabsbalken = 15 & mgr; m. (B) linke Bild zeigt reifen Epithelzelle (CDH1 +) Strukturen gesäumt von Basalmembran Protein Laminin auf die basale Seite der Strukturen pseudostratified. Mitte und rechts Bild zeigen reife Atemwegsepithelien komplett mit Zilienzellen (TUBB4A +), cluB - Zellen (SCGB1A1 +) und basalen Zellen (KRT5 + / TRP63 +). Bild links Skala bar = 30 & mgr; m; Mitte und rechts Abbildungsmaßstab bar = 15 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Das hier beschriebene Protokoll erzeugt reifen ESC-derived Atemwegsepithelien nur natürliche Lungengerüste mit Differenzierung keine andere Ergänzung zu lenken. Diese Kultur Aufbau ist, serumfrei, kostengünstig und reproduzierbar definiert ist. Keine Wachstumsfaktor Ergänzung der Basis Differenzierung Medien erforderlich ist. Vorveröffentlichten Verfahren zur Erzeugung von Stammzellen abgeleiteten Lungenepithelzellen haben 2-dimensionale Strategien mit Wachstumsfaktor - Supplementierung verwendet 3,4,8,18,19 zu fördern lineage Einschränkung. Die hier beschriebene Technik ist vorteilhaft gegenüber diesen Verfahren aus mehreren Gründen, einschließlich: definierten Kulturbedingungen, hohe Differenzierungseffizienz zu funktionellen Atemweg Zellen begrenzte Verunreinigung von anderen Abstammungen endodermalen (Schilddrüse, Leber, Pankreas) und eine 3D-Mikroumgebung Differenzierung. Diese Technik liefert ähnliche Ergebnisse mit der Maus stamm ECM und deshalb modifiziert werden können dezellularisierter Gerüste mit der Maus Lunge zu erzeugen. Ratte abgeleiteten differenzierten WSR endgültige Endoderm und ausgesät auf Gerüsten mit diesem Protokoll auch Atemwegsepithelien unterscheiden.
Dezellularisierte Gerüste können in Dekontaminationslösung bei 4 ° C für bis zu 7 Tage vor der Rezellularisierung gespeichert werden. Scaffolds gehalten für längere Laufzeiten funktionsfähig sein kann, jedoch haben wir nicht, dies zu bestätigen, getestet. Um eine effiziente Organisation erreichen und Differenzierung ist es erforderlich, für die endgültige Endoderm durch FACS nach Induktion mit Activin A. Nicht Entodermzellen in Tag zu bereichern 6 EBs oft Pluripotenz Marker Oct4 auszudrücken und wenn auf Gerüsten ausgesät wird auch weiterhin ohne Organisation und Spezifikation der zu vermehren Lungen Linie. Die Dichte der Aussaat kann auch basierend auf Zelllinie Spezifität angepasst werden, um vollständige Rezellularisierung von Gerüsten zu erreichen.
Eine Einschränkung dieses Protokolls liegt in seiner Unfähigkeit, Differenzierung alveolären Epithelzellen zu fördern. Obwohl NKX2-1 + / SOX9 + distalen Vorläuferzellen nachgewiesen werden nach sieben Tagen Kultur auf Gerüsten, ist diese Population nicht am Tag 14 und Tag 21 Marker von reifen Typ alveolären I Epithelzellen (AQP5) und Typ - II - Alveolarepithelzellen (SFTPB, SFTPC) sind nicht in jedem Stadium während der Gerüst Kultur entdeckt. Dies kann für zusätzliche Wachstumsfaktor-Ergänzung und unter Wasser Kulturbedingungen auf eine Anforderung darauf zurückzuführen sein, alveolar Abstammungslinie Spezifikation fördern, während, wie hier beschrieben, Matrixproteine und die Überbleibsel Matrix gebundenen Wachstumsfaktoren auf dezellularisierter Gerüste reicht Atemwegs lineage Differenzierung zu fördern.
Der entscheidende Schritt zur Differenzierung der endgültigen endoderm Förderung Epithelzellen zu Atemwegslungengerüste mit ist die Optimierung des Dezellularisierung Prozess. Zelluläre Komponenten entfernt werden müssen vollständig, während Matrixkomponenten erhalten bleiben. Die Gewebefärbung für Kernmaterial unter Verwendung von DAPI, ultra-Struktural Analyse von Gerüsten mit Raster- und Transmissions-Elektronenmikroskopie und DNA-Assays können Entfernung aller Zellkomponenten zur Bestätigung verwendet werden. ECM Proteinzusammensetzung von Gerüsten kann mit beurteilt werden IF - Färbung und Immunoblot - Analyse für Matrixproteine: Kollagen I, Kollagen IV, Elastin, Fibronektin, Heparinsulfatproteoglykanen und Laminin 16.
Diese Stammzellen abgeleiteten Lungenepithel kann in Krankheit Modellierung und Drogen-Entdeckung Plattformen von Atemwegsbedingten Krankheiten wie Mukoviszidose eingesetzt werden. Das Potential dieser Zell-Matrix - Konstrukte in regenerative Anwendungen wie die Reparatur von Gewebe und Zelltherapie kann durch in vivo - Transplantation von Engineered Konstrukte in verschiedenen Mausmodellen untersucht werden. Darüber hinaus kann diese 3D in vitro - Verfahren zur Differenzierung Atemweg leicht durch Manipulation Wachstumsfaktor Verfügbarkeit und Zell-Matrix verschiedene Parameter Bewirkung Lungen lineage Spezifikation zu studieren angepasst Signalisierungsder Kulturen während der verschiedenen Stadien der Differenzierung auf Gerüsten.
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Disclosures
Es gibt keine konkurrierenden finanziellen Interessen zu erklären.
Acknowledgments
Wir wünschen Dr. Rossant und Dr. Bilodeau für die Nkx2-1 mCherry ESC in den Experimenten in den Figuren 1-3 dargestellt verwendet danken. FACS wurde in der Sickkids-UHN Flow Cytometry Einrichtung durchgeführt. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem kanadischen Institutes für Gesundheitsforschung und Infrastrukturbeihilfe (CSCCD) von der kanadischen Stiftung für Innovation arbeitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
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