Summary
Этот протокол эффективно направляет эмбриональных стволовых клеток мыши, полученных окончательное энтодермы для зрелых эпителиальных клеток дыхательных путей. Эта методика дифференциации использует 3-мерные decellularized каркасы легких направить спецификации клонов легких, в определенной, не содержащей сыворотки настройки культуры.
Abstract
Lung родословная дифференциация требует интеграции сложных экологических сигналов, которые включают в себя передачу сигналов фактора роста, межклеточных взаимодействий и клетка-матрица взаимодействий. Из - за этой сложности, рекапитуляцию развития легких в пробирке способствовать дифференциации стволовых клеток в легких эпителиальных клеток было сложной задачей. В этом протоколе decellularized подмости легочные используются для имитации 3-мерную среду легкого и генерировать полученной из культур клеток эпителиальных клеток дыхательных путей стволовых клеток. Эмбриональных стволовых клеток мыши сначала дифференцированы в энтодермы линии с использованием метода культуры эмбриоидного тела (EB) с энтодермы клетками активина A. Затем высевали на decellularized подмостей и культивировали при воздушно-жидкостной интерфейс на срок до 21 дней. Этот метод способствует дифференциации посеянных клеток к функциональным эпителиальных клеток дыхательных путей (реснитчатые клетки, клубные клетки и базальных клеток) без дополнительного добавок фактора роста. Эта установка культуры определяется, Серум-свободный, недорогой и воспроизводимым. Хотя существует ограниченное загрязнение от не-легочных энтодермальных линий в культуре, этот протокол генерирует только в дыхательных путях эпителиальные населения и не приводят к гиперплазии эпителиальных клеток. Эпителий дыхательных путей, генерируемые с этим протоколом могут быть использованы для изучения клеточной матрицы взаимодействий во время органогенеза легких и для моделирования заболевания или наркотиков обнаружения платформ дыхательных патологий, таких как кистозный фиброз.
Introduction
Направленной дифференцировки плюрипотентных клеток к линии легкого зависит от точных сигнальных событий в микросреде 1,2. Из - за динамической природы этого процесса он был сложным , чтобы имитировать точные события органогенеза легких в лабораторных условиях . Последние отчеты использовали пошаговый стратегии ограничения родословная с фактором роста растворимы добавок двумерных культур для достижения дифференциации легких 3-8. В ступенчатых протоколов дифференцировки, плюрипотентные клетки, то ли эмбриональные стволовые клетки (ЭСК) или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, были впервые дифференцированы к окончательному энтодермы зародышевого слоя. Энтодермальная клетки впоследствии доводятся до передней энтодермы судьбы, а затем к клеткам-предшественников легких, которые, как определено выражением гомеодоменовым содержащих фактора транскрипции NKX2-1. Эти клетки-предшественники легких были дополнительно дифференцированы проксимальных (дыхательные пути) или дистальных (альвеолярных) эпителиальных клетках легких Wiго фактора роста по-прежнему добавок. Такие 2-мерные стратегии имели некоторый успех в создании легких эпителиальных клеток, однако есть несколько ограничений, включая неясными эффективности, возможного загрязнения от других энтодермальных линий, отсутствие 3-мерного (3D) структуры, а в некоторых случаях использование неопределенных культур с добавками сыворотки. Культура плюрипотентные или дифференцированных клеток на decellularized каркасах легких все чаще используется в качестве анализа для оценки регенеративный потенциал посеянных клеток в формировании легочных эпителиальных структур 3,5,6,8,9. Такие отчеты культуры высевали клетки на каркасах с продолжающимся фактором роста или сыворотки добавок.
Развитие легкого включает в себя разделение, миграцию, экспрессию генов и дифференцировки отдельных клеток в ответ на сигналы окружающей среды. Внеклеточного матрикса (ЕСМ) является решетчатой гликопротеинов, которые в дополнение к обеспечению структурной поддержки, направляет Tissuе формообразование путем интеграции и регулирования этих процессов 10,11. При использовании ECM легких строительных лесов в качестве естественной платформой для энтодермы культуры , чтобы лучше имитировать в естественных условиях легких среду развития, мы сгенерировали стволовых клеток , полученных эпителиальных клеток дыхательных путей в определенной 3D-культуры настройки с высокой эффективностью и воспроизводимостью.
Крыса легких ECM каркасы были сгенерированы decellularization, а также мышь ESC-полученных энтодермальных клеток были получены и впоследствии высевали на этих каркасах. Двойное выражение CXCR4 & C-KIT белков указывает на окончательную идентичность клеток энтодермы и клеток положительный результат как для SOX2 и экспрессии NKX2-1 идентифицированы как клетки в дыхательных путях (проксимальная легких) предшественниках. Definitive энтодермальные клетки культивировали при воздушной жидкости интерфейс (ALI) на срок до трех недель для создания функциональной эпителиальных клеток дыхательных путей в пробирке.
Этот протокол способствует легких клонов дифференциации опреденый энтодерма уже 7 дней, наблюдаемые с появлением NKX2-1 + / + SOX2 ранние проксимальных клеток - предшественников легких. На 14 -й день и 21 культуры популяций зрелых клеток в дыхательных путях эпителиальных появляются , в том числе ресничного (TUBB4A +), клуб (SCGB1A1 +) и базальных (TRP63 +, KRT5 +) клеток с морфологической и функциональной схожести с носителями дыхательных путей мыши. Этот протокол демонстрирует важность 3D-матрицы микросреды для достижения надежной дифференциации для эпителиальных клеток дыхательных путей.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты на животных были проведены в соответствии с руководящими принципами для животных комитета по охране госпиталя для больных детей Научно-исследовательского института.
1. Подготовка Эшафот
- Decellularization легких
- Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО 2 камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
- Заметим, животное для бессознательности; это произойдет после того, как приблизительно 2-3 мин. Если потеря сознания не происходит в этот период времени, проверьте скорость и камеры уплотнения заполнения. После потери сознания, наблюдать за животное выцветшие глаза и отсутствие дыхания. Если оба наблюдаются, поддерживать наполнение СО 2 в течение 1-2 мин , а затем удалить животное из камеры для процедуры.
- Закрепить животное рассекает поверхность, фиксируя передними лапами и задними ногами, и брызги вниз грудь и область живота с 70% этанола. Доступ к сердцу и луNGS путем открытия грудной полости с использованием вертикальный разрез вдоль грудины.
- Сделать небольшие надрезы через диафрагму сначала вызвать легкие втягиваться, уменьшая вероятность прокола легких. Лигирования нижней полой вены с швом и поместите небольшой разрез в левом предсердии с небольшими рассекающих ножницами.
- Используя приготовленный шприц объемом 10 мл с 25 G иглой, заполненную сбалансированным солевым раствором гепаринизированной Хэнкса (HBSS) (10 ед / мл гепарина в HBSS), начинают перфузию легких, вставив иглу в правый желудочек, чтобы толкать буфер через легочный кровоток (скорость 2 мл / мин). Продолжайте эту процедуру, пока легкие не белеют и жидкость течет из левого предсердия чистой.
- После перфузии, разоблачить трахеи и иглу с пластиковым катетером возле щитовидного хряща и зафиксировать на месте с помощью шовного материала.
- Настройка силы тяжести системы перфузии с помощью фиксации 10 мл шприц к штативу и зажимом. Удалить и discard поршень шприца. Закрепите точку максимума наполнения на цилиндра шприца на 20 см выше легких. Приложить двусторонний запорный кран к концу шприца и длинной пластиковой трубки к другому концу запорного крана для подачи decellularization раствора в канюлированного трахеи. Налейте раствор в шприц и дайте раствор для заполнения комплектных пластиковых трубок и катетера.
- Лаважа легкие, заполняя к общей емкости легких (приблизительно 12 мл) в течение 1 мин и снять пластиковый катетер из трахеи, чтобы позволить жидкости вытекать из легких. Не заполняйте шприц более 10 мл , когда lavaging легкие , чтобы держать давление ниже 20 см H 2 O.
- Повторите промывание легких восемь раз с decellularization раствором, а затем 10 промывок фосфатно-солевым буферным раствором (PBS).
- Рассеките трахею и легкие, свободной от полости шеи и груди и удалить из животного. Держите ткань в холодной PBS при 4 ° С до подготовки к vibratome SEctioning.
- Эвтаназии взрослых крыс линии Вистар с использованием СО 2 камеры. Поместите животное в камеру и начать воздействия 100% СО 2 при скорости заполнения 10-30% от объема камеры в минуту.
- поколение толстый раздел
- Приготовьте приблизительно 15 мл 2% и 4% (вес / объем) агарозном, и достаточно 6% (вес / объем) агарозном для встраивания всех лепестка в небольшие прямоугольные блоки. Растворите с низкой температурой плавления порошка агарозы в PBS микроволновке. Передача агарозы в 50 мл пробирки на тепловом блоке и поддерживать температуру выше 40 ° C, чтобы избежать гелеобразования.
- Рассеките decellularized легких в конце каждого долевой бронх, чтобы отделить каждую лопасть (черепную, средний, аксессуар и каудальной правой долей и левой доли), используя маленькие ножницы. Пат сухой каждый лепесток с помощью абсорбирующими прокладками, чтобы удалить избыток PBS и поместить внутрь 2% (вес / объем) агарозы в то время как на нагревательном блоке.
- Удалите каждую лопасть через 5 мин покрытия в агарозе, поместить в чашку Петри и дайте поверхности геля в течение 1 мин на холодную пластину.
- Аккуратно мочки обратно в 4% (вес / объем) агарозном, остудить через 5 мин, и повторить покрытие еще раз с 6% (вес / объем) агарозы.
- После последовательного сотрудничестватем создания каждого лепестка, встраивать каждую лопасть по отдельности в 6% (вес / объем) агарозном геле с использованием Металлическое основание пресс-формы, по меньшей мере, 3 мм, агарозы, окружающей ткани от краев. Orient каждая лопасть с помощью щипцов, расположив большой плоский край лепестка в на поверхности металлической формы, обращенной к экспериментатору. Этот край будет стороной крепится к пластине образца для vibratome секционирования.
- Разрешить блоки гель на холодной плите в течение по крайней мере за 30 мин до секционирования с vibratome. Хранить блоки в увлажненной камере в течение 12 ч при температуре 4 ° С до vibratome секционирования.
- Настройте vibratome путем заполнения секционирования камеру с холодным PBS 12. Поддержание холодной температуры во секционирования с ванной окружающего льда. Удалить блоки из металлических пресс-форм и использовать лезвие бритвы, чтобы урезать избыток агарозы окружающих лепестка, сохраняя при этом приблизительно 3 мм от края ткани.
- Закрепить ткань к центру образца пластины с помощью клея и погрузить пластины в тон PBS заполненные секционирования камеру. Настройка секционирования границ на vibratome, выбрав следующие значения скорости, амплитуды и толщины соответственно: 0,2 мм / сек, 1,85 мм, и 350 мкм.
Примечание: Обе продольные и поперечные сечения ориентации лепестка являются приемлемыми. - Раздел каждая лопасть полностью. Вручную срезанные участки бесплатно с помощью небольших ножниц, если участок не полностью отделены друг от лопатки в конце последовательности секции. Сбор секций строительных лесов осторожно и не держать в PBS на льду до следующего шага.
Примечание: Секции, сгенерированные будет включать как проксимальных и дистальных легких областей и могут быть использованы для recellularization обоих источников; Тем не менее, большая часть поверхности будет включать в себя дистальный легких.
- Обеззараживание секций строительных лесов
- Передачи, в 350 микрон толстые секции строительных лесов от PBS для микропробирок (до 30 секций / трубки) и обрабатывают нуклеазой (90 ед / мл в PBS) (см перечень материалов) в течение 12 - 24 ч при комнатной температуре, наротатор.
- После нуклеазная обработки, секции передачи с помощью щипцов для новых микропробирок и обрабатывают противомикробным раствором (200 ед / мл пенициллина и стрептомицина 25 мкг / мл амфотерицина В в PBS) в стерильных условиях в течение 6 ч при комнатной температуре, на ротатора.
Примечание: Каркасы могут быть сохранены в антимикробным раствором в течение одной недели при температуре 4 ° С перед использованием. - После стадии дезактивации с антимикробным раствором, полоскать подмости дважды PBS в стерильных условиях и переносят в свободной от сыворотки среде для дифференцировки (SFDM) перед посевом клеток.
2. энтодермальная Cell Подготовка
- Definitive энтодермы Индукционная
- Поддержание мыши ESC линии под фидера свободной, свободной от сыворотки культуры с использованием 2i условий 13. Начало индукции энтодермы путем удаления клеток из клейкого плюрипотентных культуры трипсинизацией.
- Ресуспендируют клетки в SFDM и семян при плотности 20000клеток / мл в низких прилипших планшетах в течение трех дней без замены среды, чтобы обеспечить формирование EB.
- Через три дня аккуратно перенести ЭТ в 50 мл конические пробирки с помощью 10 мл пипетки и дать им возможность собирать на дне в течение 3 мин при комнатной температуре.
- Тщательно аспирата средств массовой информации и добавить свежие SFDM, дополненной 50 нг / мл активина A.
- Семенной клетки обратно на низких прилипших планшеты при 1: 2 плотности и культуры в течение трех дополнительных дней для достижения окончательной дифференциации энтодермы.
- Окончательное обогащение эндодермы
- Собирают день 6 ЭТ, диссоциируют с трипсином и маркировать для с-KIT и экспрессии CXCR4 с использованием конъюгированных флуоресцентных антител 14.
- Сортировка меченые клетки с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS) для экспрессии обоих маркеров , чтобы получить обогащенную окончательное энтодермы население 15.
3. Установка Recellularization
- Воздух-жидкость интерфейснастройка культуры
- Передача каждого decellularized раздел эшафот (этап 1.2.9) из SFDM на гидрофобной плавающей мембраной (размер пор 8 мкм) с использованием стерильного пинцета. Обеспечение строительных лесов участки распределены равномерно по мембране.
- Подготовка 6- или 12-луночные планшеты с заполнением лунки с 1 или 0,5 мл SFDM соответственно. Аккуратно поместите мембраны в лунки, позволяя мембране плавать на поверхности носителя, создавая установки культуры воздух-жидкость.
- Посев 3D подмостей
- После FACS для окончательных маркеров энтодермы (этап 2.2.2) подсчет отсортированных клеток с использованием гемоцитометра, спином вниз при 400 мкг в течение 5 мин и ресуспендируют в SFDM. Ресуспендируют клетки, чтобы получить объем, содержащий приблизительно 100000 клеток / 10 мкл / эшафот.
- Для recellularize каркасы, пипетка 10 мкл клеток непосредственно на каждую подготовленную секцию со стадии 3.1.2.
- Заменить SFDM СМИ в культурах каждые 48 ч. Аспирируйте старые средства массовой информации, держа пластину под небольшим наклономчтобы избежать нарушения культуры. Медленно добавить свежий SFDM к культуре вдоль боковой стороны скважины с целью предотвращения затопления плавучего мембраны.
- Поддерживать воздух-жидкость культур до 21 дней, чтобы достичь дифференциации посеянных клеток для зрелой воздушной трассы эпителии.
Примечание: Recellularized секции могут быть обработаны для окрашивания тканей и иммунофлюоресценции (IF) микроскопии в любой момент времени , в течение культивирования клеток 16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Как указано в этом протоколе, надежная дифференциация окончательного энтодермы созревать дыхательные пути эпителиальные клетки могут быть достигнуты с использованием расширенной культуры посеяны клеток на decellularized секций строительных лесов легких. Рекомендуется, чтобы decellularized подмости быть охарактеризован для обеспечения (1) клетки-хозяева полностью удалены, и (2) белки внеклеточного матрикса сохраняются до использования Каркасы для дифференцировки. Decellularization может быть оценена с помощью окрашивания тканей гематоксилином и эозином (Н & Е) и 4 ', 6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI), как это показано на рисунке 1А. Увеличивающим с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) анализ каркасах подтверждает отсутствие клеток - хозяев и неповрежденной матричной архитектуры, как показано на фигуре 1В. Дополнительная характеристика оставшегося помост путем испытания на растяжение и иммуногистохимическое матричных белков могут быть выполнены, чтобы обеспечить preservatион ЕСМ следующие decellularization 16.
Неприлипающими культура ESCs в SFDM средах в течение шести дней , приводит к образованию агрегатов клеток (ЭТ) , как показано на рисунке 2А. Три дня активин А результаты лечения в окончательной индукции энтодермы. Ограничение Lineage из ESC для окончательного энтодермы может быть подтверждено и повышающую регуляцию экспрессии энтодермальных LINEAGE-ассоциированных генов и белков , 17, и нельзя утверждать , морфологически. Эффективность эндодермы индукция колеблется от 50-70% в зависимости от линии ESC используется. Опыты проводились на мышах линии ESC: R1 (Nkx2-1 mCherry), G4 (DsRed -MST), и 129 / УПВ (Бри-GFP / Foxa2-hCD4), в то время как все данные , представленные в этой рукописи используется ячейка R1 линия. Двойной положительный CXCR4 + / с-KIT + окончательное население эндодермы сортируется , как показано на рисунке 2B, засевалина 3D каркасах легких, и культивировали в течение до 21 дней на границе раздела воздух-жидкость в SFDM. Важно , чтобы сортировать и обогащать для окончательного энтодермы как ограниченная организация и дифференциация достигается с культурой несортированных клеток из гетерогенной день 6 ЭТ , как показано на рисунке 2C. Структуры , образованные отсортированных клеток на строительные леса напоминают развития легких (эмбриональный день 13.5) , как показано на рисунке 2C-D. По нашему опыту, плотность засева 100000 отсортированных клеток / эшафот дала лучший эшафот заселение.
Дифференциация к линии легких наблюдается уже в 7 дней после каркасного культуры. Эпителиальных клеток дыхательных путей предшественников дает положительный результат на NKX2-1 и SOX2 определяются с использованием IF конфокальной анализа , как показано на рисунке 3А. SOX2 положительный, NKX2-1 отрицательные клетки вероятно плюрипотентные клетки эндодермы, которые не дифференцированные на Li легкихneage. При более длительном культуре эти клетки могут начать выражать NKX2-1 или апоптозу без адекватной поддержки в микросреде. Если анализ 21 -й день культур показывает зрелый дыхательные пути эпителиальной популяцию , содержащую TUBB4A + реснитчатые клетки, SCGB1A1 + клубные клетки и TRP63 + / KRT5 + базальные клетки , как показано на рисунке 3B. СЭМ анализ поверхности 21-й день культуры показывает морфологическое сходство стволовых клеток, полученных культур в компьютерную мышь дыхательные пути.
Обе выделенные белки матрикса (коллаген I, коллаген IV, фибронектин, ламинин) и decellularized Строительные леса почек крыс были неспособны продвинуть легких-клонов дифференциации , когда затравку окончательного эндодермы и культивировали при тех же условиях , как описано выше 16. Это свидетельствует о том, что 3D микроокружение созданный легочными происхождения каркасах отличается от почечных происхождения каркасах в ее способности содействовать легких-клонов дифференциации seedeг эндодермы клетки.
Рисунок 1. Метод Decellularization удаляет клеточные компоненты и сохраняет ECM. (A) H & E (верхняя панель) и DAPI (нижняя панель) окрашивание природного и decellularized легочной ткани показывает отсутствие ядер следующий decellularization. Правая панель показывает примеры срезов тканей из легких без оптимального decellularization. Наконечники показать оставшиеся ядра на каркасах из-за неполного decellularization, подчеркнув важность оптимизации техники, прежде чем recellularization. Шкала бар = 25 мкм. (B) СЭМ изображения природного и decellularized легкого, показывая отсутствие клеток и сохранения матричной архитектуры на decellularized каркасах. Шкала бар = 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесьдля просмотра увеличенной версии этой фигуры.
Рисунок 2. Рассортировано ESC полученных окончательных результатов энтодермы в оптимальной recellularization. (A) 6 -й день эмбриональные тельца (ЭТ) следующие три дня активин лечения для содействия окончательной дифференциации энтодермы. (Б) ЭТ сортируются по FACS для двойного экспрессии поверхностных маркеров CXCR4 и с-KIT , чтобы изолировать окончательную популяцию энтодермы. Это население будет высевали на decellularized каркасах. (C) H & E окрашивание recellularized каркасы на 7 -й день и 21 -й день культуры. Левая панель представляет собой организованный, сократимость-подобные структуры следующие затравки отсортированных клеток, а правая панель представляет собой неорганизованное высоко пролиферативные несортированные клетки на каркасах, подчеркивающие важность сортировки клеток до recellularization. Масштаббар = 30 мкм. (D) H & E окрашивание эмбриональных день 13,5 легких мышей. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3. Расширенная культура окончательного энтодермы на естественных каркасах легких направляет дифференциацию эпителиальных клеток дыхательных путей. (А) проксимальные клетки - предшественники легких (NKX2-1 + / SOX2 +) обнаруживаются следующие семь дней культивирования на decellularized каркасах. Шкала бар = 15 мкм. (В) Левое изображение показывает зрелый псевдомногослойный эпителиальные клетки (CDH1 +) структуры выстланы базальной мембраны белка ламинина на базальной стороне структур. В центре и справа показывают изображение зрелые эпителий дыхательных путей в комплекте с ресничных клеток (TUBB4A +), CLUб клетки (SCGB1A1 +) и базальные клетки (KRT5 + / TRP63 +). Левый масштаб изображения бар = 30 мкм; центр и правая шкала изображения бар = 15 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Протокол, описанный здесь, генерирует зрелый эпителий ESC полученные в дыхательных путях, используя только каркасы природного легкого направлять дифференцировку без других добавок. Эта установка культура определяется, не содержащей сыворотки, недорогой и воспроизводимым. Ни один фактор роста добавок базовой дифференцировки не требуется. Ранее опубликованные способы получения клеток , полученных эпителиальные клетки легких стволовых использовали 2-мерных стратегий с фактором роста добавок для содействия ограничению клонов 3,4,8,18,19. Техника, описанная здесь, имеет преимущество перед этими методами по нескольким причинам, в том числе: условия определены культура, высокая эффективность дифференциации функциональных клеток в дыхательных путях, ограниченного загрязнения от других родов энтодермальных (щитовидной железы, печени, поджелудочной железы), а также 3D-дифференциация микроокружения. Этот метод дает сходные результаты с мышиного происхождения ECM и, следовательно, могут быть модифицированы, чтобы генерировать decellularized подмости с использованием легких мышей, Крысы полученных ЭСК дифференцируются к окончательному энтодермы и высевали на строительные леса, используя этот протокол также дифференцироваться в дыхательных путях эпителии.
Decellularized каркасы могут быть сохранены в обеззараживание растворе при 4 ° С в течение 7 дней до recellularization. Каркасы храниться при более длительном может быть функциональным, однако мы не проверяли, чтобы подтвердить это. Для достижения эффективной организации и дифференциации требуется для обогащения окончательного энтодермы путем FACS после индукции с активина A. Non-эндодермы клетки в 6-й день ЭТ часто выражают плюрипотентности Oct4 маркер и если высевали на строительные леса будет продолжать распространяться без организации и спецификации к родословная легких. Плотность высева также может быть скорректирован на основе клеточной линии специфичностью для достижения полной recellularization каркасов.
Ограничение этого протокола заключается в его неспособности способствовать дифференциации к гиперплазии эпителиальных клеток. Хотя Nkx2-1 + / SOX9 + дистальных клеток - предшественников обнаруживаются после семи дней культивирования на каркасах, эта популяция не присутствует на 14 -й день и день 21. Маркеры зрелого типа I альвеолярного эпителиальные клетки (аквапорин 5) и тип II альвеолярных эпителиальных клеток (SFTPB, SFTPC) не обнаружены ни на одном этапе строительных лесов культуры. Это может быть из-за потребности в дополнительном фактора роста добавок и погружают условий культивирования для содействия альвеол спецификации клонов, в то время как, как описано здесь, матричные белки и уцелевшие матричные переплете факторы роста на decellularized каркасах достаточно для содействия в дыхательных путях дифференциации клонов.
Важным шагом для содействия дифференциации окончательного энтодермы к эпителиальных клеток дыхательных путей с использованием строительных лесов легких является оптимизация процесса decellularization. Клеточные компоненты должны быть полностью удалены в то время как матричные компоненты сохраняются. Ткань для окрашивания ядерного материала с использованием DAPI, ультра-структураUral анализ каркасах с сканирующей и просвечивающей электронной микроскопии и анализов ДНК могут быть использованы для подтверждения удаления всех клеточных компонентов. ECM белковый состав лесов можно оценить с помощью IF окрашивания и анализ иммуноблот для матричных белков: коллагена I, коллагена IV, эластин, фибронектин, гепаринсульфат протеогликанов и ламинин 16.
Эти стволовые клетки получены эпителии легкого может быть использован при моделировании болезни и наркотиков обнаружения платформ воздушных путей, связанных патологий, таких как кистозный фиброз. Потенциал этих клеток-матричных конструкций в регенеративных приложениях , таких как восстановление ткани и клеточной терапии может быть рассмотрен трансплантации в естественных условиях инженерно - технических конструкций в различных мышиных моделях. Кроме того, это 3D экстракорпоральное метод дифференциации в дыхательных путях можно легко адаптировать для изучения различных параметров , оказывающими легких спецификации клонов путем манипулирования роста доступности фактором и клетка-матрица сигнализациикультур на разных стадиях дифференцировки на каркасах.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Там нет конкурирующих финансовых интересов в таможенной декларации.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить д - ра Rossant и доктора Bilodeau для mcherry ESC Nkx2-1 , используемых в экспериментах , изображенных на рисунках 1-3. FACS проводили в SickKids-UHN проточной цитометрии фонда. Эта работа была поддержана операционной гранты от Канадского института исследований в области здравоохранения и грант инфраструктуры (CSCCD) из Канадского фонда инноваций.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
