Summary
Bu protokol verimli hava yolu epitel hücreleri olgun fare embriyonik kök hücre kaynaklı kesin endoderm yönlendirir. Bu farklılaşma tekniği tanımlanmış bir serum içermeyen kültür ortamında, akciğer soy özellikleri doğrudan 3 boyutlu hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kullanır.
Abstract
Akciğer soy farklılaşma büyüme faktörü sinyalizasyon, hücre-hücre etkileşimleri ve hücre-matriks etkileşimleri içeren karmaşık çevresel ipuçları entegrasyonunu gerektirir. Bu nedenle karmaşıklığı nedeniyle, in vitro olarak akciğer gelişiminin tekrarlama zorlu olan akciğer epitelyal hücrelerine kök hücrelerin farklılaşmasını teşvik etmek. Bu protokol, hücresizleştirilmiş akciğer iskeleleri kök hücre türevli yolu epitel hücreleri akciğer, 3 boyutlu bir ortam taklit eden ve üretmek için kullanılır. Fare embriyonik kök hücre ilk önce decellularized iskelelerinin üzerine ekilir aktivin A Endoderm hücreleri ile bir embriyoid gövde (EB) kültür yöntemi kullanılarak endoderm soyuna farklılaşmış ve en fazla 21 gün süreyle hava-sıvı arayüzü kültüre edilir. Bu teknik, ek büyüme faktörü takviyesi olmadan fonksiyonel hava yolu epitel hücrelerine seribaşı hücreler (kirpikli hücreler, kulüp hücreleri ve bazal hücreler) farklılaşmasını teşvik eder. Bu kültür kurulum tanımlanır, serum-ücretsiz, ucuz ve tekrarlanabilir. Sınırlı kirlenme kültüründe olmayan akciğer endoderm soydan gelen olmamasına rağmen, bu protokol sadece hava yolu epitel popülasyonları üretir ve alveol epitel hücrelerinin neden vermez. Bu protokol ile oluşan hava yolu epitelial akciğer organojenez esnasında ve hastalık modelleme ya da sistik fibroz gibi hava yolu ilgili patolojilerin ilaç keşfi platformları için hücre-matris etkileşimlerini incelemek için kullanılabilir.
Introduction
Akciğer soy pluripotent hücrelerin Yönetmen farklılaşma mikro-1,2 hassas sinyal olayları bağlıdır. Bu nedenle sürecin dinamik doğası in vitro akciğer organogenez kesin olayları taklit etmek zor olmuştur. Son raporlar akciğer farklılaşma 3-8 ulaşmak için iki boyutlu kültürlerin çözünür büyüme faktörü takviyesi ile adım adım soy kısıtlama stratejilerini kullanmışlardır. adım adım farklılaşma protokollerde, pluripotent hücreler, embriyonik kök hücreleri (ESC) veya uyarılmış pluripotent kök hücreler olup, ilk kesin endoderm germ tabakasına ayırt edildi. homeodomen içeren transkripsiyon faktörü NKX2-1 ifadesi ile tanımlanan endodermal hücreler daha sonra, akciğer progenitör hücrelere daha sonra bir ön endoderm kaderine itti ve bulundu. Bu akciğer atalarıdır daha proksimal (havayolu) veya uzak (alveolar) akciğer epitel hücrelerinin wi için ayırt edildiinci büyüme faktörü takviyesi devam etti. Böyle 2 boyutlu stratejiler akciğer epitel hücreleri üreten bazı başarı vardı, ancak orada belirsiz verimlilik, diğer Endodermal soy mümkün kirlenme, 3 boyutlu (3D) yapı eksikliği gibi çeşitli sınırlamalar vardır ve bazı durumlarda tanımlanmamış kültürlerin kullanımı serum takviyesi ile. Hücresizleştirilmiş akciğer iskeleler üzerine pluripotent veya farklılaşmış hücrelerin kültürü artan akciğer epitelyal yapılar 3,5,6,8,9 oluşturan Serpilen hücreleri, rejeneratif potansiyelini değerlendirmek için bir tahlil olarak kullanılır. Bu tür raporlar kültür sürekli büyüme faktörü veya serum takviyesi ile İskele üzerinde hücreleri ekildi.
Akciğer gelişimi çevresel işaretlere yanıt olarak bölünmesi, göç, gen ekspresyonu ve tek tek hücrelerin farklılaşmasını içermektedir. hücre dışı matrisi (ECM) yapısal destek sağlamanın yanı sıra, tissu yönlendiren glikoproteinlerin bir kafes olanentegre ve bu süreçleri 10,11 düzenleyerek e morfolojilerinden. Daha iyi in vivo akciğer gelişim ortamını taklit etmek endoderm kültürü için doğal bir platform olarak akciğer ECM iskele kullanarak, yüksek verimlilik ve tekrarlanabilirlik ile ayar tanımlanmış 3D-kültürde hücre kökenli havayolu epitel hücrelerini kök yarattı.
Fare, akciğer ECM iskeleleri oluşturulan Decellularization hem de fare ESC türetilmiş endodermal hücreler tarafından üretilen ve daha sonra, bu iskeleler üzerine ekilmiştir. CXCR4 ve c-KIT proteinlerinin Çift ifade havayolu (proksimal akciğer) progenitör hücreler olarak tanımlanır Sox2 & NKX2-1 ifade hem pozitif kesin bir endoderm hücre kimliğini ve hücreleri gösterir. Kesin endoderm hücreleri in vitro fonksiyonel hava yolu epitel hücreleri üretmek için üç hafta kadar hava sıvı arayüzü (ALI) de kültüre edildi.
Bu protokol tanımdan akciğer soy farklılaşmasını teşvikgibi erken NKX2-1 + / Sox2 + erken proksimal akciğer ataları ortaya çıkması ile gözlenen 7 gün olarak tive endoderm. 14. günde ve kirpikli de ortaya kültür olgun hava yolu epitel hücre popülasyonlarının 21 (TUBB4A +), kulüp (SCGB1A1 +) ve bazal (TRP63 + KRT5 +) yerel fare solunum yollarında morfolojik ve fonksiyonel benzerlik ile hücreleri tarafından. Bu protokol epitel hücreleri hava yolu sağlam farklılaşma elde etmek için 3D-matris mikroçevresinin önemini ortaya koymaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan deneyleri Sick Children Araştırma Enstitüsü Hastanesi Hayvan Bakım Komitesi talimatlarına uygun olarak gerçekleştirilmiştir.
1. İskele Hazırlık
- akciğer Decellularization
- CO 2 odasının kullanılarak yetişkin Wistar sıçan Euthanize. Odasında hayvan koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 pozlama başlar.
- bilinçsizlik için hayvan gözlemlemek; Bu yaklaşık 2-3 dakika sonra ortaya çıkar. bilinçsizlik Bu süre içinde oluşmazsa, hızı ve oda mühür doldurmak kontrol edin. bilinçsizlik ardından, soluk göz rengi ve solunum olmaması için hayvan gözlemleyin. Her iki gözlenmesi halinde, 1-2 dakika boyunca CO2 doldurma korumak ve daha sonra prosedür için odasından gelen hayvan çıkarın.
- forepaws ve arka ayakları sabitleyerek yüzey diseksiyon hayvan Güvenli ve% 70 etanol ile göğüs ve karın bölgeyi sprey. kalp ve lu girişsternum boyunca dikey bir kesi kullanılarak göğüs boşluğu açılarak NGS.
- diyafram üzerinden küçük kesiler yapmak ilk akciğerleri delinmesiyle şansını azaltmak, akciğerler geri çekmek için neden. Bir dikiş ile inferior vena kava bağlanır ve küçük diseksiyon makas ile sol atrium küçük bir kesi yerleştirin.
- Heparinize Hank dengeli tuz çözeltisi (HBSS) (HBSS, 10 U / ml heparin) ile dolu bir 25 G iğne ile hazırlanmış bir 10 ml şırınga kullanarak, akciğer dolaşımı sayesinde tampon itmek için sağ ventrikül içine iğne sokarak akciğer perfüzyon başlatmak (2 ml / dakika oranı). Akciğerler beyaz çevirmek ve sol atrium akan sıvı berrak bitene kadar bu işleme devam edin.
- perfüzyon ardından, tiroid kıkırdak yakın plastik bir kateter ile trakea ve cannulate ortaya çıkarmak ve bir dikişle yerine sabitleyin.
- Kur bir imbik standı ve kelepçe bir 10 ml şırınga sabitleyerek bir yerçekimi perfüzyon sistemi. Kaldır discard şırınga pistonu. akciğerler üzerinde 20 cm şırınga varil üzerinde maksimum doldurma noktasını sabitleyin. şırınga sonuna ve kanüle trakeaya decellularization çözümü sunmak için vana diğer ucuna uzun bir plastik boru için iki yönlü stopcock takın. şırıngaya çözüm dökün ve çözüm ekli plastik boru ve kateter doldurmak için izin verir.
- 1 dakika boyunca total akciğer kapasitesi (yaklaşık 12 ml) doldurarak akciğerleri lavaj ve sıvı akciğerlerin dışarı akmasına izin vermek için trakea plastik kateter çıkarın. H 2 O 20 cm altına basınç tutmak için akciğerlere lavaging şırınga fazla 10 ml doldurmayın
- fosfat tamponlu tuz (PBS) ile 10 kez batırıldıktan ardından sekiz kez decellularization çözeltisi ile akciğerlerin tekrar lavajı.
- boyun ve göğüs boşluğundan serbest trakea ve akciğerler incelemek ve hayvan kaldırmak. vibratome se hazırlık kadar 4 ° C 'de soğuk PBS doku tutunctioning.
- CO 2 odasının kullanılarak yetişkin Wistar sıçan Euthanize. Odasında hayvan koyun ve dakikada odası hacminin% 10-30 bir dolgu hızında% 100 CO 2 pozlama başlar.
- Kalın bölüm nesil
- % 2 yaklaşık 15 ml (ağırlık / hacim) agaroz% 4 ve% 6 kadar küçük dikdörtgen bloklar halinde, tüm lobu yerleştirmek için (ağırlık / hacim) agaroz hazırlayın. mikrodalga PBS içinde düşük erime noktalı agaroz toz eritilir. Bir ısı bloğu 50 ml tüpler agaroz aktarın ve jelleşmenin önüne geçmek üzere 40 ° C 'nin üzerindeki sıcaklığı muhafaza.
- Küçük bir makas kullanarak her lob (kranial, orta, aksesuar ve kuyruk sağa loblar ve sol lob) ayırmak için her lober bronş sonunda decellularized akciğer teşrih. Pat aşırı PBS kaldırmak ve% 2 içine yerleştirmek için emici yaprak kullanarak her lob kurutun (w / v) agaroz ısıtma bloğu üzerinde iken.
- Petri kabı yerleştirmek, agaroz içinde kaplamanın 5 dakika sonra her bir lob kaldırma ve yüzey soğuk plaka üzerinde 1 dakika boyunca jel sağlar.
- Yavaşça 5 dakika sonra, tekrar% 4 (ağırlık / hacim) agaroz serin lobları yerleştirin ve% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ile bir kez daha kaplama tekrarlayın.
- ardışık co sonraHer lob ating, kenarlarından çevreleyen doku agaroz en az 3 mm olan metal taban kalıplar kullanılarak% 6 (ağırlık / hacim) agaroz ayrı her lobun yerleştirin. Orient her lob deneyci bakan metal kalıbın yüzeyinde lobunun en büyük yassı kenarını konumlandırarak forseps kullanarak. Bu kenar vibratome kesit için numune plakasına sabitlenmiş taraf olacaktır.
- blok önceden vibratome ile kesit için en az 30 dakika süreyle soğuk plaka üzerinde jel izin verin. 4 ° C'de en çok 12 saat boyunca nemlendirilmiş bir odada saklayın blok önce kesit vibratome.
- Kur soğuk PBS 12 ile kesit odasını doldurarak vibratome. Çevre buz banyosu ile kesit boyunca soğuk sıcaklık korumak. metal kalıplar blokları kaldırmak ve doku kenarından yaklaşık 3 mm tutarken, lobu çevreleyen aşırı agaroz aşağı trim bir jilet kullanın.
- yapıştırıcı kullanılarak numune plakasının merkezine doku düzeltmek ve t içine plaka daldırınO kesit odasını PBS dolu. 0,2 mm / sn, 1.85 mm ve 350 um: sırasıyla aşağıdaki hız, genlik ve kalınlık değerleri seçerek vibratome sınırlarını kesit Kur.
Not: lob yönlendirme uzunlamasına ve enine iki kısmı, kabul edilebilir. - Bölüm her lob tamamen. Bir bölüm tam bölüm dizisinin sonunda bıçak ile ayrılmış değilse elle kesilmiş bölümleri küçük makas kullanarak ücretsiz. nazikçe iskele bölümleri toplayın ve bir sonraki adıma kadar buz üzerinde PBS tutmak.
Not: Oluşturulan Bölümler proksimal ve distal akciğer alanlarına ve recellularization için kullanılabilir her iki kaynaktan içerecektir; Bununla birlikte, yüzeyin en uzak akciğer içerecektir.
- skafold bölümlerinin atım
- mikrosantrifüj tüpler (30 bölüm / tüp) PBS 350 mikron kalınlığında iskele bölümleri aktarın ve nükleaz ile tedavi (PBS içinde 90 U / ml) (Malzeme listesi bakınız) 12 - üzerinde oda sıcaklığında 24 saat,Bir rotator.
- nükleaz işlemin ardından, yeni bir mikrosantrifüj tüplerine forseps kullanılarak bir döndürücünün üzerine, oda sıcaklığında 6 saat süre ile, steril koşullar altında (PBS içinde 200 U / ml penisilin streptomisin ve 25 ug / ml amfoterisin B), antimikrobiyal çözeltisi ile muamele transferi bölümlerinden oluşmaktadır.
Not: iskeleleri, kullanımdan önce bir hafta kadar 4 ° C antimikrobiyal çözelti içinde saklanabilir. - antimikrobiyal çözeltisi ile arındırma adımından sonra steril şartlar altında iki kez PBS ile yıkayın iskeleleri ve hücreler ile tohumlanmasından önce serbest farklılaşma ortamı (SFDM) serum aktarın.
2. Endodermal Hücre Hazırlama
- Kesin Endoderm İndüksiyon
- 2i koşullar 13 kullanılarak besleyici içermeyen, serum serbest kültürü altında fare ESC hatları korumak. Trypsinization tarafından yapışık pluripotent kültüründen hücreleri kaldırarak endoderm indüksiyon başlayın.
- 20,000 bir yoğunlukta SFDM tohum hücrelerin yeniden süspanseOrtam değişikliği olmadan hücreler üç gün boyunca, düşük yapışkan tabaklar / ml EB oluşumuna imkan vermek için.
- Üç gün yavaşça, 10 ml bir pipet kullanarak 50 ml konik tüp EBS aktarmak ve onları oda sıcaklığında 3 dakika boyunca alt almasına izin sonra.
- Dikkatlice aspire medya ve eklemek taze SFDM medya 50 ng / ml aktivin A ile desteklenmiş
- geri 1 düşük yapışık plakalar üzerine Tohum hücreleri üç gün daha 2 yoğunluğu ve kültür kesin endoderm farklılaşma elde etmek.
- Kesin Endoderm zenginleştirme
- Gün 6 EBS toplamak tripsin ile ayırmak ve konjuge floresan antikorlar 14 kullanılarak c-KIT ve CXCR4 ifade etiket.
- Her ikisinin de işaretleyicilerin ekspresyonu için floresans ile aktive edilen hücre tasnif (FACS) kullanılarak Sıralama etiketli hücreler zenginleştirilmiş bir nihai endoderm popülasyonu 15 elde edildi.
3. Recellularization Kurulumu
- Hava-sıvı arayüzükültür kurulumu
- Steril forseps kullanarak bir hidrofobik yüzen membran (8 mikron gözenek boyutu) üzerine SFDM her decellularized iskele bölümü (adım 1.2.9) aktarın. iskele sağlamak bölümler zar üzerinde eşit yayılır.
- sırasıyla SFDM 1 ya da 0.5 ml ile kuyu doldurarak 6 veya 12 oyuklu plakalar hazırlamak. Yavaşça bir hava-sıvı kültür kurulum oluşturma, zar medyanın üstünde yüzen sağlayan kuyu içine membranlar yerleştirin.
- 3D iskelelerinin tohumlama
- Kesin endoderm belirteçleri (adım 2.2.2) için aşağıdaki FACS, hemasitometre kullanarak sıralanmış hücreleri saymak SFDM 5 dakika ve tekrar süspansiyon için 400 xg'de aşağı doğru döndürün. Yaklaşık olarak 100,000 hücre / 10 ul / iskelet ihtiva eden bir birim elde etmek için tekrar süspansiyon hücreleri.
- doğrudan adım 3.1.2 her hazırlanmış bölümü üzerine pipet, hücrelerin 10 ul iskelesi recellularize için.
- kültürlerinde, her 48 saat SFDM ortamı değiştirin. hafif bir eğim de plaka tutarak eski medya aspirekültür bozmamak için. Yavaş yavaş dalgalı membran batan önlemek için oyuk kenarı boyunca kültüre taze SFDM ekleyin.
- olgun havayolu epitel numaralı seribaşı hücrelerin farklılaşmasını sağlamak kadar 21 gün boyunca hava-sıvı kültürleri korumak.
Not: Recellularized bölümler hücre kültürü 16 boyunca herhangi bir zaman noktasında, doku boyama ve imünoflöresan (IF) mikroskopi için işlenebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bu protokolde belirtildiği gibi, kesin endoderm sağlam farklılaşma epitel hücreleri decellularized akciğer iskele bölümleri numaralı seribaşı hücrelerin uzun kültürünü kullanılarak elde edilebilir havayolunu olgun. Decellularized iskeleleri (1) konak hücreler tamamen çıkarıldığından emin olmak için karakterize, ve (2) hücre dışı matriks proteinleri farklılaşması için iskeleler kullanmadan önce korunmuş tavsiye edilir. Şekil 1A 'de gösterildiği gibi Decellularization, hematoksilin ve eozin (H & E) ve 4', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) doku boyama kullanılarak değerlendirilebilir. Şekil 1B 'de gösterildiği gibi, yüksek bir büyütme tarama elektron mikroskobu (SEM) iskeleler analizi, konakçı hücreler ve bozulmamış matriks mimarisinin olmadığını teyit etmektedir. matris proteinleri için çekme testi ve immün kalan skafoldun ek karakterizasyonu preservat sağlamak için gerçekleştirilebilirDecellularization 16 Aşağıdaki ECM'nin iyonu.
Şekil 2A'da gösterildiği gibi hücre agrega (EBS) oluşumu ile altı gün sonucu SFDM medya EKH Yapışkan olmayan kültür. Kesin endoderm indüksiyon bir tedavi sonuçlarını aktivin Üç gün. Kesin endoderm için ESC soy kısıtlama upregülasyonun ve endoderm soy ilişkili genlerin ve proteinlerin 17 ifadesi ile teyit edilebilir ve morfolojik iddia edilemez. Endoderm indüksiyon verimliliği kullanılan ESC hatta bağlı olarak% 50-70 arasında değişmektedir. Deneyler, fare ESC hatları içinde gerçekleştirilmiştir: R1, (Nkx2-1 MCherry), G4 (DsRed -MST) ve 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4) bu metinde gösterilen tüm veri ise R1 hücresi çizgi. Çift pozitif CXCR4 + / c-kit + kesin endoderm popülasyon Şekil 2B'de gösterildiği gibi, kriteri tohumlanır3D akciğer iskeleler üzerine ve SFDM hava-sıvı arayüzü en fazla 21 gün süreyle kültüre. Tür ve organizasyonu sınırlı Şekil 2C'de gösterildiği gibi, farklılaşma, heterojen gün sıralanmamış hücre kültürü ile 6 EBS elde olarak kesin bir endoderm zenginleştirilmesi için önemlidir. İskele üzerinde sıralı hücreleri tarafından oluşturulan yapılar Şekil 2C-D gösterildiği gibi akciğer (embriyonik gün 13.5) gelişmekte anımsatır. Bizim tecrübelerimize göre, 100,000 sıralanmış hücre / iskele bir ekim yoğunluğu en iskele iskânından yola vermiştir.
Akciğer soy Farklılaşma iskele kültürü takip eden 7 gün gibi erken bir görülmektedir. NKX2-1 ve Sox2 pozitif hava yolu epitel progenitör hücrelerin Şekil 3A'da gösterildiği gibi, IF konfokal analizi kullanılarak tespit edilir. Sox2 pozitif, NKX2-1 negatif hücreler akciğer li farklılaşmış değil muhtemelen pluripotent Endodermal hücrelerneage. uzun kültürü ile bu hücrelerin NKX2-1 açık veya mikroçevresinin yeterli desteği olmadan apoptoz geçmesi başlayabilir. 21. günde kültür analizi Şekil 3B'de gösterildiği gibi, TUBB4A + silli hücrelerin SCGB1A1 + takım hücreler ve TRP63 + / KRT5 + bazal hücre içeren olgun bir hava yolu epitel nüfusu ortaya çıkarsa. 21. günde kültür yüzey SEM analizi, fare hava yollarına kök hücre türevli kültürleri morfolojik benzerliği ortaya çıkarmaktadır.
16 yukarıda tarif edildiği gibi kesin bir endoderm ile aşılandı ve aynı koşullar altında kültüre edildiği zaman yalıtılmıştır matris proteinleri (kolajen I, kolajen IV, fibronektin, laminin) ve hücresizleştirilmiş sıçan böbrek iskeleleri akciğer soy farklılaşmasını teşvik etmek mümkün oldu. Bu akciğer türevi iskeleler tarafından yaratılan 3D mikro-seede akciğer-dizi farklılaşmasını teşvik etme yeteneği böbrek türetilmiş iskeleler farklı olduğunu göstermektedird Endodermal hücreleri.
Şekil 1. Decellularization tekniği hücresel bileşenleri ortadan kaldırır ve ECM korur. (A) H & E (üst panel) ve DAPI Decellularization Aşağıdaki çekirdeklerin yokluğunu gösteren doğal ve hücresizleştirilmiş akciğer dokusunun (alt panel) boyama. Sağ paneli optimum Decellularization olmadan akciğerlerden doku bölümleri örneklerini göstermektedir. Ok uçları recellularization önce tekniği optimize önemini vurgulayarak nedeniyle eksik Decellularization için İskele kalan çekirdekleri göstermektedir. Ölçek çubuğu 25 mikron =. Hücreler ve decellularized iskeleleri üzerinde matris mimarisinin korunması yokluğunu gösteren doğal ve decellularized akciğer (B) SEM görüntüleri. Ölçek çubuğu = 10 mm. TıklayınızBu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için.
Şekil 2. SÄ optimum recellularization kesin endoderm sonuçlarını ESC türetilmiş. Kesin endoderm farklılaşma teşvik etmek için bir tedavi aktivin üç gün sonra (A) 6. Gün embriyoid organları (EBS). (B) EBS kesin endoderm nüfusu izole etmek için çift yüzey belirteçleri CXCR4 ifadesi ve c-KIT FACS göre sınıflandırılmaktadır. Bu nüfus decellularized iskeleleri numaralı seribaşı olacak. Gün 7 ve kültür 21. günde recellularized iskeleler (C), H & E boyama. Sol paneli sıralı hücreleri ile tohumlama sonrasında havayolu benzeri yapılar organize temsil ve sağ panel öncesinde recellularization Hücrelerin sıralama önemini vurgulayarak iskelelerinin üzerinde dağınık, yüksek proliferatif Sıralanmamış hücreleri temsil eder. ölçekbar = 30 mikron. Embriyonik gün 13.5 fare akciğerlerin (D) H & E boyama. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Doğal akciğer iskelelerinin üzerinde kesin endoderm Şekil 3. Genişletilmiş kültür epitel hücreleri hava yolu için farklılaşma yönlendirir. (A) Proksimal akciğer progenitör hücrelerin (NKX2-1 + / Sox2 +) decellularized iskelelerinin kültürün yedi gün sonra tespit edilir. Ölçek çubuğu 15 mikron =. (B) Sol görüntü gösterir yapıların bazal tarafındaki bazal membran proteini laminin ile kaplı epitel hücre (CDH1 +) yapılar yalancı olgun. Kirpikli hücreler (TUBB4A +) Clu ile komple merkez ve sağ görüntü göstermek olgun havayolu epiteliB hücreleri (SCGB1A1 +) ve bazal hücrelerde (KRT5 + / TRP63 +). Sol görüntü ölçek çubuğu = 30 mikron; merkez ve sağ görüntü ölçek çubuğu = 15 mm. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan protokol başka hiçbir takviyesi ile farklılaşmayı doğrudan sadece doğal akciğer iskeleleri kullanarak olgun ESC türetilmiş havayolu epitel üretir. Bu kültür, kurulum, serumsuz, pahalı olmayan ve tekrarlanabilir tanımlanır. Baz farklılaşma medya yok büyüme faktörü takviyesi gereklidir. Kök hücre kökenli akciğer epitel hücreleri üretmek için daha önce yayınlanmış yöntemler soy kısıtlama 3,4,8,18,19 teşvik etmek büyüme faktörü takviyesi ile 2 boyutlu stratejiler kullanmışlardır. tanımlı kültür koşulları, fonksiyonel hava yolu hücreleri, diğer Endodermal soy (tiroid, karaciğer, pankreas) dan sınırlı kirlenme yüksek farklılaşma verimliliği ve 3D farklılaşma mikroçevresinin: Burada anlatılan teknik de dahil olmak üzere çeşitli nedenlerle, bu yöntemler üzerinde avantajlıdır. Bu teknik, fare-türevli ECM ile benzer sonuçlar elde edilir ve bu nedenle farenin akciğerlerinde kullanılarak hücresizleştirilmiş iskeleleri üretmek için değiştirilebilir. Sıçan kökenli EKH kesin endoderm için farklılaşmış ve bu protokol aynı zamanda havayolu epitel ayırt kullanarak iskelelerinin üzerine ekildi.
Hücresizleştirilmiş iskeleleri önce recellularization kadar 7 gün boyunca 4 ° C'de dekontaminasyon çözelti içinde saklanabilir. Iskeleleri uzun süreler işlevsel olabilir için, ancak biz bu onaylamak için test değil tuttu. verimli organizasyon ve farklılaşma elde etmek için o gün 6 Aktivin A. Sigara endoderm hücreleri ile indüksiyon EBS genellikle Pluripotency işaretleyici Oct4 ifade ve iskelelerinin numaralı seribaşı eğer organizasyon ve şartname olmadan çoğalmaya devam edecektir aşağıdaki FACS kesin endoderm için zenginleştirmek için gereklidir akciğer soyu. tohum yoğunluğu, aynı zamanda iskeleler tam Recellularization elde etmek için hücre çizgisi-spesifitesine göre ayarlanabilir.
Bu protokolün bir sınırlama alveol epitel hücrelerine farklılaşmasını teşvik etmek onun yetersizlik olduğunu. NKX rağmen2-1 + / SOX9 + uzak progenitör hücreler iskelelerinin kültürün yedi gün sonra tespit edilir, bu nüfus günde 14 mevcut değildir ve gün olgun Çeşidi 21. İşaretleyiciler ben epitel hücreleri (AQP5) ve tip II alveoler epitel hücrelerini Alveoler (SFTB, SFTPC) iskele kültür sırasında herhangi bir aşamada tespit edilmez. Burada anlatılan matriks proteinleri ve decellularized iskeleleri üzerinde kalan matris bağlı büyüme faktörleri havayolu soy farklılaşmasını teşvik etmek için yeterli olduğu iken bu ek büyüme faktörü takviyesi ve alveol soy özellikleri tanıtmak için batık kültür koşulları için bir gereklilik nedeniyle olabilir.
Akciğer iskeleleri kullanarak epitel hücreleri hava yolu kesin endoderm farklılaşma teşvik için kritik bir adım decellularization sürecinin optimizasyonu olduğunu. matris bileşenleri korunur iken hücresel bileşenleri tamamen kaldırılmalıdır. DAPI kullanarak nükleer maddenin doku boyama, ultra-yapıtarama ve transmisyon elektron mikroskopisi ve DNA testleri ile iskelelerinin ural analiz tüm hücresel bileşenlerin kaldırılmasını onaylamak için kullanılabilir. Iskeleler ECM proteini bileşimi boyama ve IF kullanılarak değerlendirilebilir matris proteinleri için immünoblot analizi: kolajen I, kolajen IV, elastin, fibronektin, heparin sülfat proteoglikan, ve laminin 16.
Bu kök hücre türevli akciğer epitelyum sistik fibroz gibi solunum yolu ile ilgili patolojilerin hastalığı modelleme ve ilaç keşfi platformlarında kullanılabilir. Bu doku onarımı ve hücre tedavisi gibi rejeneratif uygulamalarda, bu hücre-matris konstruktlarının potansiyeli çeşitli fare modellerinde mühendislik yapılarında in vivo nakli ile incelenebilir. Ayrıca, solunum yolu farklılaşması için bir in vitro yöntem, bu 3D kolay büyüme faktörü kullanılabilirliği ve hücre-matris sinyal manipüle akciğer soy özellikleri etkileyen çeşitli parametreleri incelemek için adapte edilebilirİskele üzerinde farklılaşma farklı aşamalarında kültürlerin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
beyan için hiçbir rakip mali çıkarları vardır.
Acknowledgments
Biz Şekiller 1-3'te gösterilen deneylerde kullanılan Nkx2-1 MCherry ESC Dr. Rossant ve Dr Bilodeau teşekkür etmek istiyorum. FACS SickKids-UHN Sitometrisi Tesisinde uygulandı. Bu çalışma Sağlık Araştırma Kanada Enstitüsü ve Yenilik Kanada Vakfı bir altyapı hibe (CSCCD) hibe işletim tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell Sci. 121 (3), 255-264 (2008).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J. Clin. Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X. L., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat. Biotechnol. 32 (1), 84-91 (2014).
- Jensen, T., et al. A rapid lung de-cellularization protocol supports embryonic stem cell differentiation in vitro and following implantation. Tissue Eng. Part C: Methods. 18 (8), 632-646 (2012).
- Longmire, T. A., et al. Efficient derivation of purified lung and thyroid progenitors from embryonic stem cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, A. P., et al. Directed differentiation of human pluripotent stem cells into mature airway epithelia expressing functional CFTR protein. Nat. Biotechnol. 30 (9), 876-882 (2012).
- Gilpin, S. E., et al. Enhanced Lung Epithelial Specification of Human Induced Pluripotent Stem Cells on Decellularized Lung Matrix. Annal. Thorac. Surg. 98, 1721-1729 (2014).
- Cortiella, J., et al. Influence of Acellular Natural Lung Matrix on Murine Embryonic Stem Cell Differentiation and Tissue Formation. Tissue Eng. Part A. 16 (8), 2565-2580 (2010).
- Princivalle, M., De Agostini, A. Developmental roles of heparan sulfate proteoglycans: a comparative review in Drosophila, mouse and human. Int. J. Dev. Biol. 46, 267-278 (2002).
- Thompson, S. M., Jesudason, E. C., Turnbull, J. E., Fernig, D. G. Heparan sulfate in lung morphogenesis: The elephant in the room. Birth Defects Res. Part C, Embryo Today. 90 (1), 32-44 (2010).
- Zimmermann, M., et al. Improved reproducibility in preparing precision-cut liver tissue slices. Cytotechnology. 61 (3), 145-152 (2009).
- Ying, Q. -L., et al. The ground state of embryonic stem cell self-renewal. Nature. 453 (7194), 519-523 (2008).
- Fox, E., et al. Three-Dimensional Culture and FGF Signaling Drive Differentiation of Murine Pluripotent Cells to Distal Lung Epithelial Cells. Stem Cells Dev. 24 (1), 21-35 (2014).
- Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of Specific Cell Population by Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS). J. Vis. Exp. (41), e1546 (2010).
- Shojaie, S., et al. Acellular lung scaffolds direct differentiation of endoderm to functional airway epithelial cells: requirement of matrix-bound HS proteoglycans. Stem Cell Reports. 4, 1-12 (2015).
- Kubo, A., et al. Development of definitive endoderm from embryonic stem cells in culture. Development. 131 (7), 1651-1662 (2004).
- Longmire, T. A., et al. Efficient Derivation of Purified Lung and Thyroid Progenitors from Embryonic Stem Cells. Cell stem cell. 10 (4), 398-411 (2012).
- Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3D mouse embryo atlas based on micro-CT. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
