Summary
Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.
Abstract
Pulmão diferenciação linhagem requer integração de sinais ambientais complexos que incluem o factor de crescimento de sinalização, as interacções célula-célula e as interacções célula-matriz. Devido a esta complexidade, recapitulação de desenvolvimento do pulmão in vitro para promover a diferenciação de células estaminais para as células epiteliais do pulmão tem sido um desafio. Neste protocolo, andaimes pulmonares descelularizados são utilizados para imitar o ambiente de 3-dimensional do pulmão e gerar células epiteliais das vias aéreas derivadas de células estaminais. células-tronco embrionárias de rato são primeiro diferenciado à linhagem endoderme usando um método de cultura corporal embryoid (EB) com células da endoderme activina A. são então semeadas em andaimes descelularizados e cultivadas a interface ar-líquido por até 21 dias. Esta técnica promove a diferenciação de células semeadas para as células epiteliais das vias aéreas funcional (células ciliadas, células do clube, e células basais) sem suplementação adicional de fator de crescimento. Esta configuração cultura é definida, seru-M livre, barato e reprodutível. Embora não haja contaminação limitado de linhagens endoderme não-pulmonares na cultura, este protocolo só gera populações epiteliais das vias aéreas e não dá origem a células epiteliais alveolares. epitélios das vias aéreas gerados com este protocolo pode ser utilizado para estudar as interacções célula-matriz durante a organogénese de pulmão e para modelar doenças ou plataformas de drogas de descoberta de patologias relacionadas com o das vias respiratórias, tais como a fibrose cística.
Introduction
Dirigido a diferenciação de células pluripotentes para a linhagem de pulmão é dependente de eventos de sinalização precisos no microambiente 1,2. Devido à natureza dinâmica deste processo tem sido um desafio para mimetizar os acontecimentos precisos de organogénese do pulmão in vitro. Relatórios recentes têm utilizado estratégias de restrição de linhagem passo a passo com a suplementação de culturas bidimensionais factor de crescimento solúvel para alcançar a diferenciação pulmonar 3-8. Nos protocolos de diferenciação passo a passo, as células pluripotentes, se as células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzidas, foram pela primeira vez diferenciado para a camada endoderme germe definitiva. As células da endoderme foram subsequentemente empurrado para um destino endoderme anterior e posteriormente para as células progenitoras de pulmão, como identificado pela expressão do factor de transcrição contendo homeodom�io NKX2-1. Estes progenitores pulmão foram ainda mais diferenciado para proximal (via aérea) ou de células epiteliais do pulmão distais (alveolares) with continuou a suplementação de fator de crescimento. Tais estratégias 2-dimensionais têm tido algum sucesso na geração de células epiteliais do pulmão, no entanto, existem várias limitações, incluindo a eficiência pouco claras, a possível contaminação de outras linhagens endoderme, a falta de uma estrutura 3-dimensional (3D), e, em alguns casos, usar de culturas indefinidas com a suplementação do soro. Cultura de pluripotentes ou células diferenciadas em andaimes pulmonares descelularizados é cada vez mais utilizado como um ensaio para avaliar o potencial de regeneração de células semeadas na formação de estruturas epiteliais pulmonares 3,5,6,8,9. Tais relatórios cultura células semeadas em andaimes com fator de crescimento contínuo ou suplementação de soro.
desenvolvimento pulmonar envolve a divisão, migração, a expressão do gene e a diferenciação de células individuais em resposta a estímulos ambientais. A matriz extracelular (ECM) é uma treliça de glicoproteínas que, além de fornecer apoio estrutural, dirige tissue morfogênese, integrando e regular esses processos 10,11. Ao utilizar o andaime ECM pulmão como uma plataforma natural para a cultura endoderme para melhor imitar o pulmão meio de desenvolvimento in vivo, que são geradas as células estaminais epiteliais das vias aéreas derivadas de células em uma cultura 3D-ajuste definido com alta eficiência e reprodutibilidade.
Rato andaimes ECM pulmonares foram gerados pela descelularização, bem como células da endoderme rato ESC-derivados foram gerados e subsequentemente semeadas em andaimes estes. expressão dual de CXCR4 e proteínas c-kit indica uma identidade de células endoderme definitivo e células positivas para ambos SOX2 & expressão NKX2-1 são identificadas como células das vias respiratórias (pulmonar proximal) progenitoras. As células da endoderme definitivas foram cultivadas na interface ar-líquido (ALI) durante até três semanas para gerar células epiteliais das vias respiratórias in vitro funcional.
Este protocolo promove a diferenciação de pulmão linhagem Definitiva endoderme tão cedo quanto 7 dias, observadas com o surgimento de NKX2-1 + / SOX2 + progenitoras pulmonares proximais início. Por volta do dia 14 e 21 de populações de células de cultura maduros epiteliais das vias aéreas emergirão, inclusive ciliadas (TUBB4A +), clube (SCGB1A1 +) e basal (TRP63 +, KRT5 +) células com semelhança morfológica e funcional de vias aéreas nativas do mouse. Este protocolo demonstra a importância do microambiente-matriz 3D para atingir a diferenciação forte para células epiteliais das vias respiratórias.
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Protocol
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Animal Care do Hospital para Crianças Doentes Research Institute.
1. Andaime Preparação
- Decelularização dos pulmões
- Euthanize ratos Wistar adultos usando CO 2 câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO 2 a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto.
- Observe animal para a inconsciência; isto irá ocorrer após cerca de 2-3 min. Se inconsciência não ocorre neste período de tempo, verificar a taxa e vedação da câmara preencher. Na sequência de inconsciência, observe animal para a cor dos olhos desapareceu e falta de respiração. Se ambos forem observadas, manter CO 2 enchimento para 1-2 min e em seguida, remover animais da câmara para o procedimento.
- Fixe animal para dissecar superfície fixando patas dianteiras e as patas traseiras, e spray para baixo do peito e abdômen com etanol 70%. Acesse o coração e luNGS por abertura da cavidade torácica através de uma incisão vertical ao longo do esterno.
- Fazer pequenas incisões através do diafragma primeiro para fazer com que os pulmões se retraia, reduzindo a possibilidade de perfurar os pulmões. Ligadura da veia cava inferior com uma sutura e colocar uma pequena incisão no átrio esquerdo com pequenas tesouras de dissecação.
- Usando um preparado seringa de 10 ml com uma agulha de 25 L preenchido com uma solução de sal equilibrada heparinizado de Hank (HBSS) (10 U / ml de heparina em HBSS), começar a perfusão pulmonar através da inserção da agulha para dentro do ventrículo direito para empurrar o tampão através da circulação pulmonar (taxa de 2 ml / min). Continue esse procedimento até que os pulmões ficam brancos e do fluido que flui do átrio esquerdo corre claro.
- Na sequência de perfusão, expor a traqueia e canular com um cateter de plástico perto da cartilagem tireóide e fixe no lugar com uma sutura.
- Instalação de um sistema de perfusão gravidade através da fixação de uma seringa de 10 ml a um stand retorta e grampo. Remover e discard êmbolo da seringa. Segurança do ponto de enchimento máximo no corpo da seringa a 20 cm acima dos pulmões. Adaptar uma torneira de duas vias para a extremidade da seringa, e um tubo de plástico de comprimento até à outra extremidade da torneira para o fornecimento de solução de descelularização para a traqueia canulada. Despeje solução na seringa e permita que a solução para preencher tubos de plástico anexado e cateter.
- A lavagem dos pulmões por enchimento a capacidade pulmonar total (cerca de 12 ml) durante 1 min e remover o cateter de plástico a partir da traqueia para permitir que o fluido se escoe para fora dos pulmões. Não encha seringa mais de 10 ml quando lavaging pulmões para manter a pressão abaixo de 20 cm de H 2 O.
- Repetir a lavagem dos pulmões oito vezes com solução de descelularização, seguido de 10 lavagens com solução salina tamponada com fosfato (PBS).
- Dissecar a traqueia e os pulmões livre da cavidade pescoço e peito e retire do animal. Manter o tecido em PBS frio a 4 ° C até à preparação para vibratome SEctioning.
- Euthanize ratos Wistar adultos usando CO 2 câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO 2 a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto.
- geração seção de espessura
- Prepare a cerca de 15 ml de 2% e 4% (w / v) de agarose, e suficientemente 6% (w / v) de agarose para a incorporação de todos os lobos em pequenos blocos retangulares. Dissolver baixo pó de agarose ponto de fusão em PBS por microondas. Transferir a agarose para tubos de 50 ml em um bloco de aquecimento e manter a temperatura acima de 40 ° C para evitar a gelificação.
- Dissecar pulmonar descelularizado no final de cada brônquio lobar para separar cada lóbulo (craniana, médio, acessório, e lobos caudal direito e do lobo esquerdo) usando uma tesoura pequena. Seque cada lóbulo utilizando folhas absorventes para remover o excesso de PBS e colocar dentro de 2% (w / v) de agarose, enquanto no bloco de aquecimento.
- Remover cada lobo após 5 min de revestimento em agarose, coloque em um prato de Petri e deixe a superfície gel durante 1 min em uma placa fria.
- Suavemente colocar lóbulos de volta em 4% (w / v) de agarose, fresco, após 5 min, e repetir revestimento mais uma vez com a 6% (w / v) de agarose.
- Após co sequencialating de cada lóbulo, incorporar cada lóbulo separadamente em 6% (w / v) de agarose utilizando moldes de metal de base com pelo menos 3 mm de agarose em torno do tecido a partir das bordas. Orient cada lóbulo utilizando uma pinça posicionando a borda plana maior do lóbulo na superfície do molde de metal virada para o experimentador. Esta vantagem é o lado fixo à placa de amostra para vibratome seccionamento.
- Permitir blocos de gel na placa fria durante pelo menos 30 minutos antes do corte com vibratome. Armazenar blocos numa câmara humidificada durante até 12 h a 4 ° C antes de seccionamento vibratome.
- Configuração do vibratome, preenchendo a câmara de seccionamento com PBS frio 12. Manter a temperatura fria durante todo o corte com o banho de gelo circundante. Remover os blocos a partir de moldes de metal e usar uma lâmina de barbear para cortar para baixo excesso de agarose em torno lóbulos, enquanto mantém a cerca de 3 mm a partir da borda do tecido.
- Fix tecido para o centro da placa de amostras utilizando adesivo, e submergir placa em Tele PBS-cheia câmara de corte. Setup seccionamento limites sobre vibratome, selecionando os seguintes valores de velocidade, amplitude, e espessura, respectivamente: 0,2 mm / seg, 1,85 mm e 350 mm.
Nota: as secções longitudinais e transversais do lobo orientação são aceitáveis. - Seção cada lóbulo completamente. Manualmente secções de corte livre usando uma tesoura pequena se uma secção não é totalmente separados por lâmina na extremidade da sequência de secção. Recolhe secções de andaime suavemente e manter em PBS em gelo até ao próximo passo.
Nota: Secções gerados incluirá ambas as zonas proximal e distai do pulmão e ambas as fontes podem ser utilizadas para recelularização; No entanto, a maior parte da superfície irá abranger pulmão distai.
- Descontaminação de secções de andaime
- Transfira a 350 mícrons seções de andaime grossas de PBS para microtubos (até 30 seções / tubo) e tratar com nuclease (90 U / ml em PBS) (veja Lista de Materiais) para 12-24 horas à temperatura ambiente, emum rotor.
- A seguir ao tratamento por nucleases, as secções de transferência usando uma pinça para tubos de microcentrífuga novos e tratar com uma solução antimicrobiana (200 U / ml de estreptomicina penicilina e 25 ug / ml de anfotericina B, em PBS), sob condições estéreis, durante 6 h à TA, num agitador rotativo.
Nota: Os andaimes pode ser armazenado em solução antimicrobiana para até uma semana a 4 ° C antes da utilização. - A seguir ao passo de descontaminação com solução antimicrobiana, lavar duas vezes com PBS andaimes sob condições estéreis e transferir ao soro meios diferenciação livre (SFDM) antes da inoculação com células.
2. endodérmico celular Preparação
- Definitive Endoderma Indução
- Manter linhas de rato ESC sob, a cultura livre de soro livre de alimentador usando condições 2i 13. Comece indução endoderme, removendo as células de cultura pluripotentes aderente por tripsinização.
- Ressuspender as células em SFDM e sementes a uma densidade de 20.000células / ml em baixas placas aderentes por três dias sem alteração de mídia para permitir a formação de EB.
- Depois de três dias suavemente transferir os CEs em tubos de 50 mL cónico, utilizando uma pipeta de 10 ml e permitir que eles se acumulem na parte inferior por 3 min a RT.
- Cuidadosa da mídia aspirado e adicionar mídia SFDM fresco suplementado com 50 ng / ml activina A.
- Semear as células de volta para a baixa placas aderentes na proporção de 1: 2 a densidade ea cultura durante três dias adicionais para atingir a diferenciação endoderme definitiva.
- enriquecimento endoderme definitiva
- Recolha dia 6 EBS, dissociar com tripsina e rotular para c-KIT e expressão CXCR4 utilizando anticorpos fluorescentes conjugados 14.
- Ordenar as células marcadas utilizando separação de células activada por fluorescência (FACS) para a expressão de ambos os marcadores para obter uma população enriquecida endoderme definitiva 15.
3. Configuração Recellularization
- interface ar-líquidoconfiguração cultura
- Transfira cada seção andaime decelularizado (passo 1.2.9) da SFDM para uma membrana flutuante hidrofóbico (8 tamanho de poro) usando uma pinça estéril. Garantir andaime seções estão distribuídos uniformemente sobre a membrana.
- Prepare 6 ou 12 poços placas por enchimento dos poços com 1 ou 0,5 ml de SFDM, respectivamente. Suavemente colocar membranas nos poços, permitindo que a membrana flutue na parte superior dos meios de comunicação, a criação de uma instalação de cultura ao ar-líquido.
- Semeadura de scaffolds 3D
- Seguintes FACS para marcadores endoderme definitivas (passo 2.2.2) contagem de células classificados usando um hemocitômetro, girar a 400 xg durante 5 min e ressuspender em SFDM. Ressuspender as células para se obter um volume contendo cerca de 100.000 células / 10 ul / andaime.
- Para recellularize andaimes, pipeta de 10 ml de células diretamente em cada seção preparado a partir do passo 3.1.2.
- Substituir mídia SFDM em culturas a cada 48 horas. Aspirar a velha mídia, segurando a placa a uma ligeira inclinaçãopara evitar prejudicar a cultura. Lentamente, adicionar SFDM fresco à cultura ao longo do lado do poço para evitar afundamento da membrana flutuante.
- Manter culturas de ar-líquido para até 21 dias para alcançar a diferenciação de células semeadas no epitélio das vias aéreas maduro.
Nota: repovoados secções pode ser processado para a coloração de tecidos e de imunofluorescência microscopia (IF), em qualquer ponto de tempo durante a cultura de células de 16.
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Representative Results
Conforme descrito neste protocolo, a diferenciação robusto de endoderme definitiva para amadurecer das vias aéreas células epiteliais podem ser alcançados com a cultura prolongada de células semeadas em seções de andaime de pulmão descelularizados. Recomenda-se que andaimes descelularizados ser caracterizado para garantir (1) células hospedeiras são completamente removidos, e (2) as proteínas da matriz extracelular são preservadas antes de utilizar andaimes para a diferenciação. Descelularização pode ser avaliada utilizando a coloração do tecido com hematoxilina e eosina (H & E) e 4 ', 6-diamidino-2-fenilindole (DAPI), tal como ilustrado na Figura 1A. De grande ampliação do microscópio electrónico de varrimento (MEV) dos andaimes confirma a ausência de células hospedeiras e a arquitectura de matriz intacta, tal como ilustrado na Figura 1B. A caracterização adicional do andaime restante por meio de testes de tracção e imunocoloração para proteínas da matriz pode ser realizada para assegurar preservation da ECM seguinte decellularization 16.
A cultura não-aderente de CES em meios SFDM durante seis dias resulta na formação de agregados de células (EBS), como ilustrado na Figura 2A. Três dias de Activina um tratamento resulta na indução endoderme definitiva. Linhagem restrição de ESC para endoderme definitiva pode ser confirmada por supra-regulação e expressão de genes e proteínas da endoderme 17 associado da linhagem, e não pode ser afirmado morfologicamente. eficiência endoderme-indução varia entre 50-70%, dependendo da linha CES utilizada. Os experimentos foram realizados em linhas ESC rato: R1 (NKX2-1 mCherry), G4 (dsRed -MST) e 129 / Ola (Bry-GFP / Foxa2-hCD4), enquanto todos os dados ilustrados neste manuscrito está usando o celular R1 linha. O duplo positivo CXCR4 + / população endoderme definitivo c-kit + é classificada como ilustrado na Figura 2B, semeadasem andaimes pulmonares 3D, e cultivadas por até 21 dias a interface ar-líquido no SFDM. É importante para resolver e enriquecer para endoderme definitivo como limitada organização e diferenciação é obtida com a cultura de células não separados a partir do dia 6 EBs heterogénea tal como ilustrado na Figura 2C. Estruturas formadas por células classificadas em estruturas de suporte são reminiscentes de desenvolvimento do pulmão (dia embrionário 13,5) como ilustrado na Figura 2C-D. Em nossa experiência, uma densidade de semeadura de 100.000 células classificadas / andaime rendeu a melhor repovoamento andaime.
A diferenciação da linhagem de pulmão é observado tão cedo como 7 dias após a cultura andaime. Airway células progenitoras epiteliais positivas para NKX2-1 e SOX2 são detectados utilizando confocal se a análise tal como ilustrado na Figura 3A. SOX2 positivo, células negativas NKX2-1 são células da endoderme pluripotentes prováveis que não diferenciadas ao li pulmãoneage. Com mais cultura estas células podem começar a expressar NKX2-1 ou sofrem apoptose sem o apoio adequado no microambiente. Se a análise de 21 dias culturas revela uma população epitelial das vias aéreas madura contendo + + KRT5 células basais TRP63 / células ciliadas TUBB4A +, células SCGB1A1 + clube, e como ilustrado na Figura 3B. A análise SEM da superfície do dia 21 culturas revela semelhança morfológica de culturas derivadas de células-tronco para rato vias aéreas.
Ambas as proteínas de matriz (colagénio isolado I, colagénio IV, fibronectina, laminina) e de rim de rato andaimes descelularizados foram incapazes de promover a diferenciação de pulmão de linhagem quando semeados com endoderme definitiva e cultivadas sob as mesmas condições tal como descrito acima de 16. Isto demonstra que o microambiente 3D criado por andaimes derivado do pulmão é distinto de andaimes derivadas de rim, na sua capacidade para promover a diferenciação de pulmão de linhagem de seedecélulas da endoderme d.
Figura 1. técnica Decelularização remove componentes celulares e preserva ECM. (A) H & E (painel superior) e DAPI (painel inferior) de coloração de tecido pulmonar descelularizado natural e que mostra a ausência de núcleos seguinte descelularização. painel da direita mostra exemplos de secções de tecido de pulmões sem decellularization ideal. Pontas de flechas mostram núcleos restantes em andaimes devido a descelularização incompleta, destacando a importância de otimizar a técnica antes recelularização. Barra de escala = 25 um. Imagens (B) SEM de pulmão natural e decelularizado, mostrando ausência de células e preservação da arquitetura de matriz em andaimes descelularizados. Barra de escala = 10 mm. Por favor clique aquipara ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. Ordenado ESC-derivada resultados endoderme definitivas em recelularização ideal. Corpos (A) Dia 6 embrióides (EBS) após três dias de activina um tratamento para promover a diferenciação endoderme definitiva. (B) Os EB são classificadas por FACS para a expressão dual de marcadores de superfície CXCR4 e c-kit para isolar a população endoderme definitiva. Esta população serão semeadas em andaimes descelularizados. (C) H & E coloração de andaimes repovoados no dia 7 e dia 21 de cultura. painel esquerdo representa organizado, estruturas das vias aéreas-like seguinte semeadura com células separadas, e o painel direito representa células não triados desorganizados, altamente proliferativa sobre andaimes destacando a importância da triagem de células antes da recelularização. EscalaBarra = 30 um. (D) H & E coloração do dia 13,5 pulmões embrionárias de rato. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. cultura ampliada da endoderme definitivo sobre andaimes pulmonares naturais dirige a diferenciação de células epiteliais das vias aéreas. (A) células progenitoras pulmonar proximal (NKX2-1 + / SOX2 +) são detectados após sete dias de cultura em andaimes descelularizados. Barra de escala = 15 mm. (B) mostra imagem da esquerda maduro pseudo-estruturas de células epiteliais (CDH1 +) revestidas por laminina proteína da membrana basal no lado basal das estruturas. Centro e mostra imagem certa epitélio das vias aéreas maduras completas com células ciliadas (TUBB4A +), club células (SCGB1A1 +) e células basais (KRT5 + / TRP63 +). barra de escala de imagem para a esquerda = 30 mm; centro e barra de escala imagem da direita = 15 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo aqui descrito gera epitélio das vias aéreas ESC-derivado maduros usando apenas andaimes naturais pulmonares à diferenciação com nenhuma outra suplementação dirigir. Esta configuração é definida cultura,, barato e reprodutível isento de soro. Nenhuma suplementação do factor de crescimento dos meios de diferenciação base é necessária. Métodos publicados anteriormente para a geração de células epiteliais do pulmão derivadas de células-tronco têm usado estratégias de 2-dimensional com a suplementação do fator de crescimento para promover a linhagem restrição 3,4,8,18,19. A técnica descrita aqui é vantajosa em relação a esses métodos, por várias razões, incluindo: condições de cultura definido, eficiência elevada diferenciação de células das vias respiratórias funcionais, contaminação limitada de outras linhagens endoderme (tireóide, fígado, pâncreas), e um microambiente diferenciação 3D. Esta técnica produz resultados semelhantes com o ECM derivadas de ratinho e, portanto, pode ser modificado para gerar andaimes descelularizados utilizando pulmões de ratinho. CES derivadas de rato diferenciada para endoderme definitivo e semeadas em andaimes usando este protocolo também se diferenciam para epitélio das vias aéreas.
andaimes descelularizados podem ser armazenados na solução de descontaminação, a 4 ° C durante até 7 dias antes da recelularização. Scaffolds mantidos por períodos mais longos pode ser funcional, no entanto, não ter testado para confirmar isso. Para alcançar organização e diferenciação eficiente é necessário para enriquecer endoderme definitiva por FACS após a indução com activina A. As células não endoderme no dia 6 EBs muitas vezes expressam pluripotência marcador Oct4 e se semeadas em andaimes continuarão a proliferar sem organização e especificação à linhagem de pulmão. A densidade de sementeira também pode ser ajustada com base na linha de células da especificidade para alcançar recelularização completa de andaimes.
Uma limitação deste protocolo é a sua incapacidade para promover a diferenciação de células epiteliais alveolares. embora NKX2-1 + / células progenitoras distais SOX9 + são detectadas após sete dias de cultura em andaimes, esta população não está presente no dia 14 e dia 21. Os marcadores de tipo maduro I alveolar células epiteliais (AQP5) e II células epiteliais alveolares tipo (SFTPB, SFTPC) não são detectadas em qualquer fase durante a cultura andaime. Isto pode ser devido a uma necessidade de suplementação com factor de crescimento adicional e condições de cultura submersa para promover a especificação linhagem alveolar, enquanto, como descrito aqui, proteínas de matriz e os factores de crescimento ligadas à matriz remanescente sobre andaimes descelularizados é suficiente para promover a diferenciação das vias aéreas linhagem.
O passo crítico para a promoção da diferenciação de endoderme definitivo para vias aéreas células epiteliais que utilizam andaimes de pulmão é a otimização do processo de descelularização. componentes celulares deve ser completamente removido, enquanto componentes da matriz são preservados. coloração de tecidos para o material nuclear utilizando DAPI, ultra-structanálise ural de andaimes com varrimento e a microscopia electrónica de transmissão, e ensaios de DNA podem ser usadas para confirmar a remoção de todos os componentes celulares. Composição de proteína de ECM de andaimes que pode ser avaliada usando Se a coloração e análise de imunotransferência para proteínas da matriz de colagénio: I, colagénio IV, elastina, fibronectina, proteoglicanos de sulfato de heparina, 16 e laminina.
Estes epitélios do pulmão de células estaminais derivadas podem ser utilizados nos modelos de doença e fármaco-discovery plataformas de patologias relacionadas com o das vias respiratórias, tais como a fibrose cística. O potencial destas construções de células-matriz em aplicações regenerativas, tais como a reparação dos tecidos e a terapia celular pode ser analisada por transplante in vivo das construções modificadas em vários modelos de ratinho. Além disso, este 3D método in vitro para a diferenciação das vias aéreas pode ser facilmente adaptado para estudar vários parâmetros que afectam a linhagem especificação de pulmão através da manipulação de crescimento e factor de disponibilidade de células-matriz de sinalizaçãode culturas durante diferentes estágios de diferenciação sobre andaimes.
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Disclosures
Não há concorrentes interesses financeiros a declarar.
Acknowledgments
Queremos agradecer Dr. Rossant e Dr. Bilodeau para o ESC mCherry NKX2-1 usados em experimentos descritos nas Figuras 1-3. FACS foi realizada na instalação SickKids-UHN Citometria de Fluxo. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e uma subvenção de infra-estrutura (CSCCD) da Fundação Canadense de Inovação.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| Perfusion solution | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparin |
| Perfusion solution | Gibco | 14170112 | dissolved in Hank's balanced salt solution (HBSS-) |
| Decellularization solution | BioShop | CHA003 | 8 mM CHAPS |
| Decellularization solution | Sigma | E9884 | 25 mM EDTA |
| Decellularization solution | BioShop | SOD002 | 1 M NaCl |
| Decellularization solution | Gibco | 14190-144 | dissolved in PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15140 | 200 U/ml penicillin streptomycin |
| Antimicrobial solution | Gibco | 15290 | 25 μg/ml amphotericin B |
| Antimicrobial solution | Gibco | 14190-144 | diluted in PBS |
| Trypsinization | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | 3:1 ratio of IMDM and Ham’s modified F12 medium |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 12587-010 | B27 supplement (50x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 17502-048 | N2 supplement (100x dilution) |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0.05% (Fraction V) bovine serum albumin |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μM monothioglycerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0.05 mg/ml ascobic acid |
| Endoderm induction | R&D | 338-AC/CF | Activin A |
| Antibodies | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Mouse, non-conjugated, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rat, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rat, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Rabbit, non-conjugated, 1:1,000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Rabbit, non-conjugated, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Goat, non-conjugated, 1:1,000 |
| SOX2 | R&D Systems | AF2018 | Goat, non-conjugated, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, non-conjugated, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, non-conjugated, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-21206 | Donkey, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Rabbit IgG | Invitrogen | A-31573 | Donkey, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Other Materials | |||
| Low adherent plates | Nunc | Z721050 | Low cell binding plates, 6 wells |
| Air-liquid interface membranes | Whatman | 110614 | Hydrophobic Nucleopore membrane, 8 μm pore size |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Tissue Adhesive | Ted Pella | 10033 | Pelco tissue adhesive |
References
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
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