Introduction
גידולים ממאירים במוח הנפוצים ביותר תוך גולגולתי העיקריים הם כיתה III astrocytomas ו multiforme גליובלסטומה IV כיתה (גליובלסטומה או GBM). גידולים אלה מציעים בפרוגנוזה גרועה עם הישרדות לשנה אחת החציוני בין 12 - 15 חודשים עם טיפולים הקיימים כיום עבור GBM בארה"ב 1-3. טיפולי Multimodality כוללים ניתוח, הקרנות, וכימותרפיה כולל temozolomide (TMZ) וסוכנים במיקוד קינאז. איתות קינאז הוא dysregulated תדיר GBM, כולל תת קבוצות של גידולים עם הגברה או מוטציות הפעלת ב הקולטן לגורם הגדילה באפידרמיס (EGFR), עליות טסיות נגזר הקולטן לגורם הצמיחה (PDGFR) איתות, גדל Phosphatidyl-אינוזיטול-3 kinase (PI3K) ו הגידול בתמיכה איתות angiogenic דרך הקולטן לגורם הצמיחה דם האנדותל (VEGFR) וכן 4-6 מסלולים מונע קינאז אחרים. נוכחי במבחנה במודלים vivo לעתים קרובות לאבד שינויים נציג אלה <sup> 7. בנוסף, פרופיל גנטי לא הציע את היתרונות הצפויים בן כדי לשקף את העובדה ששינויים גנטיים אפיגנטיים לא תמיד לחזות שינויים ברמת פעילות חלבון, שבו רוב קינאז מיקוד סוכנים לפעול ישירות, והיכן טיפולים עם מנגנונים אחרים של פעולה רשאית לפעול בַּעֲקִיפִין.
שורת התא המסורתית הנציחה שניתן passaged אינסוף כבר זמן רב את הסטנדרט עבור בדיקות סמים בשל קלות תחזוקת שחזור שלהם. עם זאת, מודל זה סובל תזונתי גבוה (ומלאכותי) בסביבת גידול בוחרת עבור גדל מהר תאים שונים מאוד מן הגידול המקורי. ככזה, חלה התעניינות רבה בפיתוח מערכות מודל מציאותי יותר המשקפים מערכת ביולוגית הגידול מורכב יותר, כפי שוהה המטופל. xenografts גידול שפותח ישירות גידול ראשוני גדל בעכברים ( "xenoline," xenograft נגזרות החולות או PDX) proviדה מערכת מודל רעיונית יותר, במיוחד במקרים של בריפוי הסרטן, כפי שהם מורגשים יותר לנבא הצלחה קלינית. 8 למרות הביולוגיה שמשקפת בצורה טובה יותר, המודלים האלה הם יקרים קשים להקים ולתחזק. יתר על כן, הם לא מקובל מחקרי תפוקה גבוהה. הצורך טוב יותר לפתח מודלים ביולוגיים שיותר לשקף במדויק שינויים מולקולריים גידולים ראשוניים, ו לפרופיל ולבדוק מודלים אלה באמצעות מדדים ישירים פעילות קינאז, לא פונדקאית סמנים גנטיים, ברור.
היא מוכרת היטב שבניגוד דו ממדי תרבויות monolayer (2D), 3D או מודלי assay רבים-תאיים יכול לספק יותר פיסיולוגי נקודות קצה רלוונטיות 9-11. תרבות 3D נפוצה גישות לערב microcarriers מטריקס מצופה היווצרות אליפטית תא. spheroids הגידול יכול להיות שנוצר באמצעות צבירה הסלולר באמצעות בקבוק טווה, צלחת pHEMA ותליית טכניקות טיפה. מגבלות עבור tגישות hese כוללות: חוסר יכולת של תאים מסוימים כדי ליצור spheroids יציב, השתנות בצמיחה ואתגרים עם סוגי תאים מעורבים. לחלופין, סינתטיים רבים (הידרוג'ל, פולימר) ובעלי חיים הנגזרות Engelbreth-הולם-נחיל (EHS) מטריקס מן סרקומות העכבר, קולגן שור) מטריצות פותחו לתרבות 3D לומד 12-14. מטריקס עכבר EHS נעשה שימוש נרחב אך ידוע להאיץ גדילת תאים והתמיינות במבחנה ובחי 15.
על מנת לשכפל ביולוגית גידול 3D, מערכת biomatrix אדם פותחה על ידי ד"ר ראג 'סינג et al. 16. Biogel האנושית טבעית, הצמיחה ללא הגורם מאפשרת פיגומי תרבות 3D (חרוזים, דיסקים), אשר תומכים טיפוח לטווח ארוך של סוגי תאים מרובים. סדרת עיצובי תרבות biogel האנושי 3D מוקמת ללימוד צמיחת גידול, הדבקה, תכונות אנגיוגנזה ופלישה. יתרונות ומאפיינים של biogel האדם לעומת משותף ג'לים העכבר EHS מסוכמים בטבלה 1 ולוח 2.
| מָקוֹר: | האדם Amnions (רקמת Pooled) הפתוגן- חינם, IRB-פטור / אושרה |
| טבע ECM: | ללא מפוגל Biogel (הפקת GLP) |
| מַפְתֵחַ רכיבים: | Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%) |
| GF-חינם: | לגילוי EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenic, אינו רעיל) |
טבלה 1: מאפיינים של האדם Biogel לעומת ג'לים נפוצות EHS.
| Biogel אנוש | ג'לים EHS |
| מטריקס אנושית טבעית | מטריקס עכבר מחדש |
| צמיחה & התמיינות תאים מבוקרים | יכול לקדם את צמיחת & התמיינות תאים |
| ביטוי גנים פיזיולוגי | ביטוי גנים משתנה |
| מודל בתרבית רקמה דמוית 3D | מודל ההתרבות מבוסס פלייט |
טבלה 2: יתרונות של האדם Biogel לעומת ג'לי הנפוצים EHS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
הערה: כל הערכות טיפול xenograft נעשו באמצעות מודל גידול orthotopic עבור גליובלסטומה על פרוטוקול שאושר על ידי ועדת הטיפול בבעלי החיים המוסדיים השתמש.
1. בידוד של תאי xenograft GBM נגזרות חולים
- הכנת ריאגנטים
- Re-מהווים collagenase-I מים סטריליים בריכוז של 5 מ"ג / מ"ל ולסנן סטרילית. אחסן aliquots 1 מ"ל ב -20 ° C (הריכוז הסופי הוא 50 מיקרוגרם / מ"ל פתרון אנזים 100 מ"ל).
- ממיסים 100 מיקרוגרם עוריות Growth Factor (EGF) ב 2 מ"ל פוספט שנאגרו סטרילי מלוחים (PBS). חנות ב 100 μl (5 מיקרוגרם / 100 μl) aliquots ב -20 מעלות צלזיוס למשך לריכוז סופי של 10 ng / ml.
- ממיסים 100 מיקרוגרם FGF-β ב 2 מ"ל סטרילי PBS. חנות ב 100 μl (5 מיקרוגרם / 100 μl) aliquots ב -20 מעלות צלזיוס למשך לריכוז סופי של 10 ng / ml.
- מוסיפים את בקבוק 500 מ"ל הבאים לאחד Neurobasal MedIA (NBM) להכין המלא NBM: 10 מ"ל B-27 תוספת ללא ויטמין A, 5 מ"ל תוספת N2, 100 EGF μl, 100 μl פיברובלסטים Growth Factor (FGF) -Basic, 5 מ"ל B amphotericin, 0.5 מ"ל gentamycin, 5 מ"ל L- גלוטמין.
- כן פתרון אנזים ועדכן הודות לשילוב: 98.5 מיליליטר PBS, 1 מיליליטר collagenase-1, 0.5 מיליליטר 10x טריפסין / EDTA לעקר ידי סינון דרך המסנן 0.22 מיקרומטר נקבוביים.
- כן או להשיג נפח קטן בינוני הנשר השונה של סטרילית Dulbecco (DMEM) / בינוני תרבות F12 תא עם סרום שור העובר 7% (FBS) ו 1x PBS ללא סידן או מגנזיום.
- חלוקת גידול
הערה: עכבר נו / נו athymic מוזרק בעבר עם תאים סרטניים באגף הימני ואפשר ממסת גידול מוחשית יש צורך בהליך זה. בדוגמות המוצגות כאן, השתמשנו תאי GBM חולה נגזר xenograft, JX10 ו JX12 17.- לעקר אזור העבודה על ידי ריסוס כלורהקסידין 2% ולהקים שנינות עבודה באזורh כלים דרושים / אספקה כולל צ'אק פנוי, מלקחיים, אזמל, זכוכית צלחת פטרי, פתרון אנזים, PBS, כלורהקסידין (ראה איור 2 א).
- להרדים עכבר / עכברים מחסת גידול אגף. כוון שיעור עקירה 20% / min של CO 2 באמצעות 30% CO 2. לאחר עכבר תערוכות דום נשימה, לשמור על זרימת CO 2 דקות על 1 (בדרך כלל 3 דקות בסה"כ). עכברים יוסרו מאולם נקע בצוואר רחם מבוצע כאישור המתת חסד משני. תרסיס החיה עם chlorhexidine 3% כדי לטהר עור.
- תוך כדי לחיצה על העכבר יציב, לעשות חתך בעור חצי עגול ~ 1.5 סנטימטרי מסת גידול (גידול מושתל אגף) באמצעות אזמל חד פעמי סטרילי עם 11 להב # החל גולגולתי למסת גידול חריטה כלפי הבטן של העכבר מסביב לבית סוף הזנב.
- Reflect עור מעל מסת גידול באמצעות אצבעות עם מתיחה עדינה על סוף הזנב של החתך ולאחר מכן לדחוף על עורמשטח לרומם גידול לקבל הגישה טובה ביותר בלי לגעת הגידול (ראה תרשים 2B).
- השתמש דיסקציה קהה עם מלקחיים כדי מסת הגידול בחינם בעדינות קיר הבטן ואת מהעור (ראה איור 2 ג).
- העברת מסת גידול עם מלקחי צלחת פטרי זכוכית סטרילית (אין להשתמש צלחות פלסטיק כדי למנוע שביר במהלך מיותר) ו כראוי להשליך פגר ומניחים מכשירים אלה הצידה.
- השתמש סט חדש של מכשירים סטריליים (אזמל עם להב # 11, חצי מעוקל מלקחיים) כדי debride רקמת גידול של רקמות נימקי גידול כיסוי רקמת חיבור מארח קרומי.
- מניח 15 מיליליטר פתרון אנזים בבקבוק סטרילי פרק-trypsinizing עם בר ומערבב ומתחיל לבחוש לאט בשכונה.
- בצלחת סטרילית זכוכית פטרי, לשטוף גידולים שנקטפו 3 - 5 פעמים עם PBS סטרילי כדי להסיר דם עודף (עשוי יציקה או להשתמש במזרק כדי לשטוף אותם עם PBS). בעדינות להטות צלחת pipet או לשאוב חומר הכביסה. בשר טחון finely באמצעות שני להבי # 11 אזמל (ראה איור 2).
- להוסיף 14 מ"ל של תמיסת האנזים הגידול pipet טחון בעדינות מעלה ומטה 2 - 3 פעמים. תערובת העברה פרקה-trypsinizing בקבוק ומערבבת לאט במשך 20 דקות. הכן 5 50 צינורות חרוטי מ"ל ידי הוספת FBS 1.5 מ"ל לכל מנת לנטרל את טריפסין בשלב 1.2.11.
- אחרי 20 דקות, לאסוף 14 מ"ל של תמיסת התא מן הבקבוק trypsinizing ולהוסיף צינור אחד עם FBS. הוסף פתרון אנזים טרי 14 מ"ל ל בקבוקון וממשיכים לבחוש.
- צנטריפוגה שנאספו תאים ב XG 150 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. להוסיף 45 מ"ל של שלמה NBM על גלולה, ומערבבים בעדינות, וחזור צנטריפוגה לשטוף את בסרום. Re- להשעות גלולה ב NBM 5 מ"ל המלא והחזק על הקרח.
- צעדי קציר תא חזרו עבור סכום כולל של 5 יבולים, המשלבים את כל התאים שנקטפו צינור חרוטי יחיד על קרח.
- מניחים מסננת תא 40 מיקרומטר על גבי צינור חרוטי 50 מ"ל. Prep tהוא התא מסננת ידי העברת 10 מ"ל של DMEM / F12 + 7% FBS באמצעות ולאחר מכן לשטוף עם 10 מ"ל PBS.
- לאט לאט מוסיף השעית תא מסננת, שמאפשר לו לטפטף הדרך (ראה 2M האיור). הרם בעדינות את הלשונית של מסננת התא בין כל תוספת חדשה לשבור שום ואקום ולאפשר לתאים המושעים לעבור בחופשיות (ראה 2N האיור).
- צנטריפוגה השעית התא המסוננת כנ"ל. Re- להשעות ב 10 מ"ל להשלים NBM ולספור לקבוע המספר הכולל של תאים קיימא באמצעות 0.04% trypan כחול hemocytometer. חזק תאים על קרח עד דור microtumor.
2. רקמות חלופיות פרוטוקול חלוק
- אוטומטיות Dissociator רקמות מערכת חלוקה.
- מניחים את הצינור חלוקה לתוך Dissociator הסלולר, בחר את התוכנית "גידול _02_02" ולהתחיל העיתונות ולרוץ 32 שניות. צינור העברת Rotator, מקום 37 ° C חממה עבור 40 דקות.
- צנטריפוגה מושעה תאים ב XG 150 עבור 8 דקות בטמפרטורת החדר וזורקים supernatant. בעוד centrifuging התאים, להגדיר ריאגנטים לעיבוד של השעית התא. הוסף 10 מ"ל NBM סרום ללא ההשעיה triturate בעדינות.
- לאחר צנטריפוגה, להשיג תא גלולה המכילה ~ 10 - 30 x 10 6 תאים קיימא (~ 0.3 מ"ל). מחדש תלויה גלולה ב 10 מ"ל סרום ללא NBM (ראה 2 טו איור). קבע את תאי קיימא על ידי assay דרה (ראה שלב 3.2.2).
3. Microtumor דור
- הכנת ריאגנטים
- הכן מלאה NBM כמו 1.1.4 ולהכין biogel האדם בצפיפות גבוהה המנוטרל (HuBiogel) (HDHG ב 3 מ"ג / מ"ל) לכל פרוטוקול פנימי. מטריצות biogel דומות יכולות לשמש גם כן.
- Microtumor הפקה ותרבות
- השג טרי תאים ניתקים PDX כמו השעית תא יחיד מלאה NBM, על קרח.
- מערבבים את התא suspension עם נפח שווה של פתרון הכחול trypan (0.4% ב PBS) ולנתח באמצעות hemacytometer כדי לקבוע מספר תא כדאי על ידי הרחקה הכחולה trypan 18. הסר נפח צורך ליצור 50,000 תאים / microtumor שבו נפח = (50,000 תאים / גידול * # גידולים) / (תא קיימא לספור / 1 מ"ל) ומקום לתוך צינור חרוטי טרי.
- תתרכז תאים על ידי צנטריפוגה ב XG 150 עבור 8 דקות, בטמפרטורת חדר. בטל supernatant ו resuspend התא גלול עם פתרון HDHG קר כקרח על יחס סופי של 1 תאי חלק FBS ו -4 חלקים HDHG.
- השתמש פיפטה רבה אלקטרונית לוותר 10 μl לכל תערובת סיכת התא-HDHG לצלחת פלדה 96 פינים (עם ציפוי הידרופובי) כדי ליצור microtumors (2 חרוזי מ"מ שכל אחת מהן מכיל 50,000 תאים).
- מניח חרוזי גידול 3D בתוך חממה בתרבית רקמה (37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, humidified) במשך 15 דקות כדי gelate החרוזים.
- לאחר gelation, להעביר את microtumors (10 μ; L) אל חדר תרבות השעיה מותאמת אישית (50 מיליליטר) או צלחת תרבות נפח גדולה (10 סנטימטרים) המכיל NBM המלא בעזרת פיפטה רב ערוצית האלקטרוני סיכת מכשיר מותאם אישית.
- אחרי 1 - 2 ימים בתרבית רקמה החממה, להעביר microtumors צלחות תרבות 96-היטב המכיל 50 μl NBM / גם באמצעות בעל פיה רחבה מחלק פיפטה ולבצע פרוטוקולי assay וניתוח שונות.
- טיפול תרופתי ותחזוקה של microtumors
- בחר ריכוזים סופיים עבור בדיקות סמים.
הערה: אם התרופה שידעה יעילה בתרבות 2D, בחרו פי 2 IC 50 כמו ריכוז המנה באמצע ובחר 3 דילולים סדרו מעל ומתחת עבור סכום כולל של 5 רמות מינון. לדוגמא, אם IC 50 הוא 9 מיקרומטר לתרופה בתרבות 2D, בחר 2 מיקרומטר, 6 מיקרומטר, 18 מיקרומטר, 54 מיקרומטר, ו -162 מיקרומטר כמו ריכוז סופי עבור בדיקות סמים. - כן פתרון מינון תרופת 2x ב מוחלט NBM מ דימתיל sulfoxiדה (DMSO) מניות. לדלל פתרון מינון בינוני 1% DMSO להכין דילול סדרתי 5 מנה, פי 3.
- הוסף 50 μl של פתרון מינון אל microtumor היטב המכיל 50 μl צלחות assay כדי להשיג ריכוז DMSO הסופי של 0.5%. חזור על פעולה עבור כל לשכפל (למשל, 4) בכל מנת תרופה שנקבעה 3.3.1.
- לשמור על תרבויות ב -37 מעלות צלזיוס, 5% CO 2, בתרבית רקמה החממה humidified עבור 1 - 14 ימים. תרבויות Feed פעמים בשבוע על ידי רענון תקשורת פתרון תרופה כנ"ל.
- בחר ריכוזים סופיים עבור בדיקות סמים.
מורפולוגי 4. וניתוח פנוטיפי של Microtumors
- לקבוע מורפולוגיה תא microtumors באמצעות מכתים לחיות תאים סטנדרטיים.
- כן 1 מ"מ מניות של Calcein-AM ב DMSO. Aliquot ולאחסן ב -20 ° C.
- במרווחי זמן תרבות הרצוי (1, 7, ו -14 ימים), ולהוסיף פתרון Calcein-AM ערוכים PBS (ללא Ca / Mg) לצלחת 96-גם עבור 1 מיקרומטר הריכוז הסופי.
- לִדגוֹר20 דקות בתוך CO% 37 מעלות צלזיוס, 5 2, חממת humidified, ותמונה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ב 2X, 4X, ו 10X (עירור: 450 - 490 לעבור להקת ננומטר, פליטה: 515 מסירה ארוכה ננומטר, Dichroic 500 ננומטר) .
- צמיחת Microtumor / Assay הפצת הנשק
- ממיסים אבקת MTT ב PBS (ללא Ca / Mg) להכין מלאי 12 מ"מ. סינון סטרילי, aliquot, ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס.
- במרווחי זמן תרבות הרצוי (1, 7, ו -14 ימים), להוסיף 20 μl של פתרון MTT לצלחת 96-היטב לכל 100 נפח תרבות μl. דגירה 2 שעות באינקובטור בתרבית רקמה.
- כן הפתרון תמוגה טרי של 10% SDS ב 0.01 M HCl ולהוסיף סכום השווה נפח תרבות צלחות. דגירה צלחות אטומה לילה 37 ° C חממה.
- קראו ספיגה ב 570 ננומטר באמצעות קורא רב-צלחת.
- הכנת Microtumor עבור ניתוח Kinomic
- הכן חיץ תמוגה ידי מראש מצמרר עד 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הוספת 1: יחס 100 כל אחד 100x Proחלבון phosphatase מונע (PPI) ו 100x חלבון מעכבי פרוטאז (PI). מערבבים היטב ולשמור על הקרח.
- העברת 2 microtumors לכל אחת משלוש 1.5 מ"ל צינור microcentrifuge. הסר supernatant ולהוסיף 40 μl של חיץ תמוגה המכיל PPI ו PI לצינור כל lyse למשך 30 דקות ב 4 ° C.
- דגימות פיפטה במרץ לשבור חרוזי גידול. צנטריפוגה ב XG 16,000 במשך 10 דקות ב 4 ° C דגימות ולאחסן ב -80 ° C עד לניתוח kinomic.
5. Profiling Kinomic של Microtumors
- פרופיל חלבון טירוזין קינאז (PTK)
- ריאגנטים ההפשרה (10x חלבון קינאז (PK) חיץ אלבומין בסרום שור 2% (BSA)) עד 4 ° C טען PK חיץ (300 μl 10x PK חיץ המניות 2.7 מ"ל DH 2 O) לתוך מזרק בעמדה מס '2 על פרופיל פּלַטפוֹרמָה.
- פתח את תוכנת assay קינאז ו לטעון את קובץ פרוטוקול PTK ולחץ על 'START', המפרש דגימות בתוך softwהם תוכנית לאחר שבבי סריקה. מניחים שבבי על פלטפורמת פרופיל והעומס 25 μl של 2% שור סרום אלבומין (BSA) למערך והקש LOAD להתחיל פרוטוקול שבשליטת תוכנה לחסימת צעד.
- לדלל 6 מיקרומטר של 100 המניות mM ATP עם 54 μl DH 2 O להפוך 10 מ"מ אדנוזין אדנוזין (ATP). כשהתוכנה מתחילה ה -3, ו צעד לשטוף סופי (גלוי על מסך) להביא 15 מיקרוגרם של lysate הביאו עד 28 μl עם DH 2 O, לערבב ולהוסיף למערך.
- הכן תערובת מאסטר PTK (MM) (עד 12 דגימות). להוסיף 32.6 μl DH 2 O כדי לשקם dithiothreitol (DTT) ולהוסיף 6 μl DTT, ו -60 μl 10x PK פתרון, כדי צינור PTK-MM1 (כבר מכיל 60 μl 10x BSA).
- חכה עד בתשובה לשאלה 'האם טען' בתוכנה assay קינאז מופיע ולאחר מכן להוסיף 126 μl של PTK-MM1, 60 μl כתוסף PTK, ו -60 μl 10 מ"מ ATP כדי MM2 (מכיל בעבר aliquoted 4.5 μl נוגדן PY20 FITC) ומערבבים.להוסיף 16 μl של תמהיל מאסטר PTK זה על צינור אחד lysate מדגם ו פיפטה לערבב 5 פעמים.
- ודא מכסה זכוכית נקיה ולאחר מכן להוסיף 35 lysate μl / לערבב מאסטר למערך, מכסת קרוסלה קרובה, ואת כפתור Load העיתונות.
- פרופיל סרין / תראונין קינאז (STK):
- ריאגנטים הפשרה (חיץ PK 10x, 10x STK חיץ, ו -2 BSA%) ל -4 מעלות צלזיוס. חיץ PK טען (300 μl ב 2.7 מ"ל DH 2 0) למצב מזרק # 1, 1:10 ו חיץ STK (300 μl ב 2.7 מ"ל DH 2 0) למצב מזרק # 2.
- פתח את תוכנת מחשב assay קינאז ו לטעון את קובץ פרוטוקול STK ולהתחיל עיתונות, המפרש דגימות בתכנית לאחר שבבי סריקה. מניחים שבבי על פלטפורמת פרופיל והעומס 25 μl של 2% BSA למערך, ולאחר מכן הקש LOAD להתחיל את הצעד חסימת שבשליטת תוכנה פרוטוקול.
- לדלל 6 מיקרומטר של 100 מ"מ ATP עם 54 μl DH 2 O. במהלך סופי (3 rd) לשטוף צעד תמהיל2 מיקרוגרם של lysate ולהביא עד 32.6 μl עם DH 2 O, לערבב ולהוסיף למערך.
- הפוך תערובת אב STK: הוסף 70 μl 10x PK צינור STK-MM1 (מכיל 7 μl 100x BSA), ולאחר מכן להוסיף 42 μl DH 2 O צינור STK-MM1.
- חכה עד בתשובה לשאלה 'האם טען' בתוכנה assay קינאז אז: הוסף 18 μl 10 מ"מ ATP כדי STK-MM1, ולהוסיף 9 μl MM1 לכל lysate המדגם. לערבב היטב.
- ודא מכסה זכוכית נקיה ולהוסיף 35 lysate μl / לערבב מאסטר למערך, מכסת קרוסלה קרובה, ולטעון עיתונות.
- במהלך סופי (3 rd) שלב לשטוף להוסיף נוגדנים משני 1.05 μl STK-FITC צינור DMAB (מכיל 3.03 לערבב נוגדן ראשוני STK μl), להוסיף 39.6 μl AB הצפת DMAB, להוסיף 356.0 μl DH 2 O ל DMAB, להוסיף 30 μl כדי DMAB לכל מערך, ולטעון העיתונות .
- ניתוח של Kinomic נתונים 19,20
- תוכנת ניתוח להרחיב ולטעון את ניתוח התמונה App. Select תיקיית תמונות המכילה תמונות מערך שלם המינימרקטים זמן חותם על נתוני PTK או STK, קובץ פריסת מערך מתאים מספר מאמר בחר (86,312 עבור PTK ו 87,102 עבור STK), ועומס שנוצרו בעבר קובץ ביאור מערך.
- ודא gridding הנכון של כל התמונות, ולהפעיל זמן חשיפה קנה מידה App. סטטיסטית להשוות חשיפה / מדרון ערכים טרנספורמציה log2, ולאמת עם עקומות הקינטית לכביסה מוקדמת 19-21.
- להריץ תוכנות חיזוי קינאז זרם לשאילתא פרופילי kinomic שינו בין תנאים קינאזות זרם 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
הראינו כי מערכת תרבות biogel 3D תומכת צמיחה לטווח ארוך ותפקוד של סוגי תאים מרובים. בפרויקט שיתופי זה, xenolines GBM נגזרות החולה (PDX) משמש להפקת מאות microtumors. תאים ניתקים (3 x 10 5) או neurospheres (40 - 50) היו משובצים חרוזי biogel (2 מ"מ) ואחרי gelation המהיר הם בתרבית bioreactor אישית תקשורת NB המלאה. כדאיות סלולרית (Calcein-AM), פרופיל צמיחה (MTT), וניתוח מבוסס מערך פעילות kinomic נקבעו. microtumors PDX מתוחזק ארגון רב-תאיים ואת כדאיות גבוהה (> 80%) עבור> 3 שבועות. אנו מאמינים ביולוגיה in vivo-כמו זה נובע תחזוקה של אדריכלות תא-מטריקס 3D (לא אפשרי עם 2D או תרבות אליפטית). הוא ציין גם כי גידולי 3D קשים לייצר עם פיגום חלבון דביק שברירים, ככל הנראה בשל חוסר קולגן אני 14. ערכת עבודה עבור מיקרופון rotumor ייצור באמצעות תאי PDX ומערכת 3D biogel מסוכם איור 1 ואת תהליך הניתוק מתואר באיור 2.
באמצעות הדמית תא חייה באמצעות Calcein-AM, קבענו גדילת תא כדאי וכן השפעת התרופות על תאי GBM נגזרו גידול PDX JX10, כפי שצוין על ידי ירידת קרינה, איתות מוות של תאים. צמיחת הגידול נמדדה ביום 0, 7 ו -14 עבור microtumors מוצגות צמיחה מתמשכת כפי שמוצג באיור 3 א. microtumor זה, JX10, ידוע להיות עמידים בפני TMZ. כאשר נחשף 1 - 10 מיקרומטר TMZ, דיכוי צמיחה מינימלית צוין (איור 3 ב). עם זאת, גידול PDX בדיקות JX12, אשר ידוע להיות רגיש TMZ, הפגין רגישות ידי assay MTT ב 14 ימים כי אושר על ידי Calcein-AM הדמיה (איור 4).
er.within-page = "1"> על מנת לחקור מנגנונים אפשריים של עמידות לתרופות, מדדנו איתות קינאז ב microtumors העמיד TMZ (JX10). פרופילים Kinomic עבור 144 טירוזין 144 סרין / מטרות phosphopeptide תראונין נתפסו עבור DMSO ו -10 מיקרומטר TMZ שטופלו microtumors. עוצמת זירחון Kinomic עבור כל המטרות פפטיד, בכל מחזור, ולפי זמני חשיפה מרובים נתפס (מידע לא מוצג). מפת חום נציג מוצג פפטידים אשר שינו עוצמות משמעותיות עם 10 מיקרומטר טיפול TMZ (p <0.05, מזווג סטודנטי T-test) מוצגים איור 5 א. פרופילים Kinomic כי שונו TMZ שטופלו microtumors JX10 נותחו באמצעות תוכנת חיזוי קינאז הזרם שזיהה SYK, LCK, ו קינאזות CTK כמו עלה ב TMZ שטופלו דגימות ביחס DMSO (איור 5). ניתוח קינאז סרין / תראונין kinome זרם בוצע גם (איור 5 ג).
התוכן "FO: keep-together.within-page =" 1 ">
איור 1:. עבודת Scheme עבור Microtumor ייצור גידולי GBM-PDX הם ניתקו מהמארח בעכברים ותאים יחידים המוטבעים מטריקס biogel לגבש microtumors. ניתוח ואז מבוצע על microtumors. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2:. דיסוציאציה של תאים סרטניים PDX גידולים יוסרו מעכברי מארח טחונים לפני ערבוב עם פתרון אנזים (AG). דיסוציאציה מוצג לאחר 40 דק '(H). Dissociator תאים סרטניים מוצג (אני). טחינה דקה במדיה סינון (JN) מוצגת עם resu סוףLT של גלולה 0.3 מ"ל (O) המכיל 29.5 x 10 6 תאים קיימא (P) כי spheroids הטופס NBM ב 24 שעות (Q). סרגל קנה מידה הוא 20 מיקרומטר. לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: צמיחה של Microtumors JX10 microtumor צמיחה נמדדת צפיפות אופטית (OD) של MTT ותמונות נציג למעלה מ -14 ימים, הן basally (א), ובתגובה 1-10 מיקרומטר טיפול TMZ (B).. תמונות מוצגות בהגדלת 4X (סרגל = 500 מיקרומטר). סטיית תקן מצוינת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. 
איור 4:. צמיחה של Microtumors JX12 microtumor צמיחה נמדדת OD של MTT ותמונות נציג למעלה מ -14 ימים, הן basally (יום 1), ובתגובה 0, 1, או 10 מיקרומטר טיפול TMZ (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). סטיית תקן מצוינת. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: Kinomic פרופילים של TMZ שטופלו Microtumors Heatmap של ערכים משולבי חשיפה (log2 מדרונות טרנספורמציה (x 100) של 10, 20, 50, 100, ו -200 ms ערכי חשיפת רקע האות מינוס החציוני) מוצגים עבור משמעותית TMZ שינתה. פפטידים שינו (p <0.05). אדום מציין מוגבר, וכחול מציין פחת יחסית DMSO מתכוון לכל פפטיד. פרופילים שינו TMZ הושוו באמצעות תוכנת חיזוי קינאז במעלה או קינאזות שינו. מנורמל קינאז הסטטיסטי (NKS) ציון> 1.0 וספציפיות ציון> 1.3 (אדום) נחשב שינה מאוד. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
צעדים קריטיים בתוך הפרוטוקול בעיקר מתייחסים microtumor הדור, כמו גם מינון תרופה ותחזוקה. מכיוון חרוזי microtumor הם שבירים יכולים להיקרע בקלות, בזהירות רבה נחוצה הוא בשלבי ההתפתחות של assay ותחזוקה. אם מתרחשת שגיאה במהלך אחד מהתהליכים אלה, אפשר להתפשר פרשנות ניסיון, גרימת רחבה או חזרה מיותרת של הניסויים או אפילו הדרת נתונים.
שינויים ופתרון בעיות, במיוחד של תהליך פיתוח microtumor, כללו תכנון וייצור של כלי הידרופובי מותאם אישית לשימוש וחרוזי microtumor. כלי זה מאפשר לייצור מדויק יותר מהר ויותר של microtumors. בנוסף, שינויים קטנים לשמירה על microtumors עזרו כדי לזרז את תהליך השינוי בינוני ומינון התאים. כמה שינויים אלה כללו, אבל לא היו מוגבלים, באמצעות רב ערוציתפיפטה אלקטרונית להסיר ולהחליף בינוני מצלחות 96-היטב מראש ערבוב פתרונות מינון תרופה טרי וסידור פתרונות 2x בצלחת 2 מיליליטר 96-היטב מתאימה.
אופטימיזציות סרן תנאי תרבות מודלי 3D הכוללות קביעת מינונים מתאימים תרכובות תרופה, כפי שיש קשר בין עניי דוגמנות 2D and 3D דוגמנות. לכן, דילולים סדרו להקים עקום טיטרציה מנה לעתים קרובות יש צורך להעברת מערכת מודל 2D למודל 3D microtumor.
בעיות פוטנציאליות לשקול עם דור microtumor מתאי גידול xenoline קוצרים עכבר כוללות זיהום חיידקים או פטרייתי, זמינות עקבית של xenolines העיקרי, כמו נכסי צמיחה ייחודיים בעכברים יכולים לייצר הבדלים בזמן קציר ושונה בתשואות תא מפני dissociations הנפרד. עם כל קו התא, מספר התאים שהתקבלו, ובדומה, כמה wi ניתן לייצר microtumorsיהיה להשתנות. ככזה, יש צורך לתעדף אשר מבחני נדרשים ואלו הם "פומביים" צריכה תשואת microtumor להיות מספיק. מגבלות פוטנציאליות עם פרופיל kinomic של microtumors כוללות קושי תיקון לטעינת חומר חלבוניים אינרטי, כמו דגימות נטענות באופן לתקן רמות החלבון נקבע BCA, כי לא יכול להבחין בין חלבונים מבוססים biogel (חלבוני ECM) לבין אלה של רכיב קינאז הסלולר אשר נועד למדוד. מדידת מסת microtumor ברוטו באמצעות Calcein-AM, או באמצעות חלבון משק כגורם תיקון עשוי למתן זה, למרות בעיות עם רמות חלבון משק בגידולים עוברות שינוי עלול לבלבל זו. במשך זמן-קורס קצר איתות ניסויים, בהנחה באותה מידה בגודל (קינאז המכיל מספר תא חי) לזווג מטופלי דגימות מטופל, זה פחות בעיה.
עם המחקר הזה, המטרה היא לספק עלות-e יותרffective ומחלות-נציג מודל הפרה-קליני לבדיקת טיפול התרופתי מדויקת בהשוואת xenografts חולה הנגזרת orthotopic, המודל הסטנדרטי הזהב הנוכחי לבדיקות GBM. בשנים האחרונות, מספר קבוצות ניסו לעצב את סביבת GBM in vivo למטרות בדיקות סמים. חלק מהקבוצות ניסו פשוט לגדל תאים סרטניים GBM בתנאים שאינם הבחנה לשמר תאי גזע GBM או לפחות תאי ייזום גידול במוח (BTIC) 24,25. תרבויות tumorsphere או neurosphere אלה יכולים לשמש לבדיקת סמים עדיפים סביר מודלים מסורתיים. עם זאת, מאז הם עדיין חסרים את גומלין הגידולים stroma כי נשמר במודל microtumor שלנו, גישת tumorsphere עדיין מוגבלת. קבוצות אחרות ניסו ליישם עקרונות הנדסה לשפר את מודלי GBM 26-28. גישות אלה כללו תאי זרימה, חלבוני ECM משתנים תאים סרטניים / תערובות תא נורמליות. תוך שהם מבטיחים, כמעט כל ריפו אלהRTS השתמש קווי תאים הנציחו עם האזהרות כאמורות. ככזה, אנו מאמינים כי מודל PDX-מבוסס microtumor המתואר כאן הוא יותר רלוונטי מבחינה קלינית.
בעתיד, מודל microtumor יכול לשמש גם גלגול גידול נכון או מערכת 'proband'. עם מערכת proband, את PDX שפותח מחולה מסוימת אינו ישירות ליידע את המטפל לגבי שהטיפול של החולה הספציפי, כמו עם מערכת גלגול גידול. במקום זאת, הגידול של חולה "הותאם" על מוכנות מראש, היטב מאופיין (הן מולקולריות ו phenotypically) PDX 29. אכן, המודל הזה יכול לשמש גלגול "go-to" או מתגוררים ספרייה proband כפרופיל השוואתי. עם avatars המסורתית, לגדל תאים סרטניים של המטופל בעכברים במקביל לטיפול של המטופל הוא לא רק זמן רב, כמו זה עלול לקחת כמה חודשים למעבר העיקרי, אבל גם יקר, כמו כמה בדיקות דטיפולי שטיח בעכברים ליצור תג מחיר מכריע. כדי להילחם בכך, הגידול המטופל העיקרי אפשר להשתיל ישירות לתוך מטריצת biogel. עם microtumors, התוצאות עלולות להיווצר במהירות ובעלות נמוכה יותר.
כמודל proband, פרופילי נתוני kinome microtumor ותגובת תרופה ניתן להוסיף לתוך proband 'ספרייה' יחד עם פרופילים ונתוני 3D הקודם במודלים חוץ גופייה, PDXs הקיים, מחקרים בבעלי חיים, חולים אחרים, וכו '. בתאוריה, בתאי הגידול של החולה עלולים להיות 'omically' (genomically, kinomically, transcriptomically, וכו ') מתאים לפרופיל microtumor קיים דומה כדי לקבוע טיפול מדויק על התוצאה הטובה ביותר האפשרית.
סיכום: כאן אנו מזהים כי מודלים microtumor אלה ניתן להשתמש כדי למדוד הן על ידי צמיחה פנוטיפי וניתן שאילתה על פעילות קינאז הבזליים גם אופקי וגם בתגובה טיפול תרופתי שעשוי להועילככלי translational למחקר פרה-קליני נוסף. פיתוח מודלים לבדיקה מדויק, מולקולריים תקפים גידולים אנושיים הכרחי לפיתוח תרופה יעיל.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
נתמך על ידי מענק R21 NIH (PI: ג Willey, CA185712-01), בפרס נבג גידול במוח (PD: GY גילספי, P20CA 151,129-03) וחוזה SBIR (PI: ר 'סינג, N43CO-2,013-00,026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
