Introduction
Наиболее распространенные первичные внутричерепные злокачественные опухоли головного мозга III степени астроцитомы и класс IV глиобластома (глиобластома или GBM). Эти опухоли предлагают плохие прогнозы с медианы выживаемости на один год в возрасте от 12 - 15 месяцев с текущей терапии для GBM в США 1-3. Мультимодальности методы лечения включают хирургическое вмешательство, облучение и химиотерапию, включая темозоломида (ТМЗ) и киназы-целевых агентов. сигнализации киназа часто дизрегуляции в GBM, включая подмножества опухолей с усилением или активирующие мутации в Рецептор эпидермального фактора роста (EGFR), увеличение тромбоцитарный фактор роста рецепторов (PDGFR) сигнализации, повышенной Фосфатидил-инозитол-3-киназы (PI3K) и опухоль поддерживая ангиогенный передачу сигнала через сосудистый эндотелиальный фактор роста рецепторов (VEGFR), а также других киназ приводом путей 4-6. Ток в пробирке и в естественных условиях модели часто теряют эти типичные изменения <SUP> 7. Кроме того, генетическая профилирование не предложила ожидаемые выгоды, которые могут отражать тот факт, что генетические и эпигенетические изменения не всегда прогнозирования изменений на уровне активности белка, где большинство киназа таргетингом агенты действуют непосредственно, и где терапия с другими механизмами действия могут действовать косвенно.
Традиционная увековечены клеточная линия, которая может быть пассировать до бесконечности уже давно стандарт для тестирования на наркотики из-за их простоты обслуживания и воспроизводимости. Тем не менее, эта модель страдает от среды роста высокое содержание питательных веществ (и искусственный), который выбирает для быстро растущих клеток, которые сильно отличаются от первоначальной опухоли. Таким образом, наблюдается значительный интерес к разработке более реалистичных моделей систем, которые отражают более сложную биологическую систему опухоли как присутствует в организме пациента. Ксенотрансплантатов разработан непосредственно из первичной опухоли у мышей, выращенных ( "xenoline" пациента, полученных ксенотрансплантата или PDX) ProViде более отражающими модель системы, в частности , в установлении лечения рака, так как они ощущаются более надежно прогнозировать клинический успех. 8 Несмотря на более отражающей биологии, эти модели являются дорогостоящими и трудно установить и поддерживать. К тому же, они не поддаются исследованиям с высокой пропускной способностью. Необходимость лучше развивать биологические модели, которые более точно отражают молекулярные изменения в первичных опухолях, а также к профилю и тестировать эти модели, используя прямые измерения активности киназы, не суррогатной генетические маркеры, ясно.
Хорошо известно , что в отличие от двумерных (2D) однослойных культур, 3D или многоклеточные модели анализа могут обеспечить более физиологически соответствующие конечные точки 9-11. Общие 3D культуры подходы включают матрицы с покрытием микроносителей и формирования клеток сфероид. Опухолевые сфероиды могут быть получены с помощью клеточной агрегации с использованием вращающуюся колбу, ПХЕМА пластину и висит методы падения. Ограничения для тHESE подходы включают в себя: неспособность для некоторых клеток с образованием стабильных сфероиды, изменчивость роста и проблемы со смешанными типами клеток. В качестве альтернативы, многие синтетические (гидрогель, полимер) и животного происхождения Engelbreth-Holm-Swarm матрица (ГЭП) от саркомы мыши, бычьего коллагена) матрицы разработаны для 3D культуры изучает 12-14. Матрица Mouse EHS широко используется , но , как известно, способствуют росту и дифференциации клеток в пробирке и в естественных условиях 15.
Для того , чтобы воспроизвести 3D биологии опухоли, система Biomatrix человек была разработана доктором Радж Сингх и др. 16. Фактор-свободный человек биогель естественно, рост позволяет 3D культуры строительных лесов (бусы, диски), которые поддерживают долгосрочное культивирование нескольких типов клеток. Серия 3D-дизайнов человеческой культуры биогель созданы для изучения роста опухоли, адгезии, ангиогенеза и инвазии свойства. Преимущества и свойства человеческого биогель по сравнению с общиммышь EHS гели представлены в таблице 1 и таблице 2.
| Источник: | Человек Amnions (Объединенное ткань) Патогена, IRB освобожденной / одобрено |
| ECM характер: | Неденатурированный биогелем (GLP-производство) |
| ключ Компоненты: | Col-I (38%), ламинин (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), энтактин & HSPG (<3%) |
| GF-бесплатно: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non ангиогенеза, нетоксичный) |
Таблица 1: Свойства человека Биогеля , как по сравнению с обычными EHS Гели.
| человек биогелем | EHS гели |
| Естественная человеческая матрица | Воссозданная матрица мыши |
| Контролируемый рост и дифференцировку клеток | Может способствовать росту & дифференцировки клеток |
| Выражение Физиологические гена | выражение гена вариабельной |
| 3D-ткани, как модель культуры | Тарелка-ориентированная модель культуры |
Таблица 2: Преимущества человеческого Биогеля , как по сравнению с обычными EHS Гели.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
ПРИМЕЧАНИЕ: Все ксенотрансплантатов оценки терапии проводили с использованием ортотопической опухоли для глиобластомы по протоколу, утвержденного по уходу и использованию комитета Institutional животных путем.
1. Выделение пациента, полученных GBM ксенотрансплантата клеток
- Приготовление реагентов
- Повторно представляют собой коллагеназы-I в стерильной воде до концентрации 5 мг / мл и стерильный фильтр. Хранить в 1 мл аликвоты при -20 ° С (конечная концентрация 50 мкг / мл в растворе фермента 100 мл).
- Растворить 100 мкг эпидермальный фактор роста (EGF) в 2 мл стерильного фосфатно-буферном солевом растворе (ФБР). Хранить в 100 мкл (5 мкг / 100 мкл) аликвотах при -20 ° C до конечной концентрации 10 нг / мл.
- Растворите 100 мкг FGF-бета в 2 мл стерильной PBS. Хранить в 100 мкл (5 мкг / 100 мкл) аликвотах при -20 ° C до конечной концентрации 10 нг / мл.
- Добавьте следующие строки в одну 500 мл бутылку Neurobasal MedIA (НБМ) подготовить полную NBM: 10 мл B-27 без добавки витамина А, 5 мл N2 добавка, 100 мкл EGF, 100 мкл фактор роста фибробластов (FGF) -базисных, 5 мл амфотерицина B, 0,5 мл гентамицин, 5 мл L-глутамин.
- Готовят свежий раствор фермента путем объединения: 98,5 мл PBS, 1 мл коллагеназы-1, 0,5 мл 10х трипсина / ЭДТК и стерилизуют путем фильтрации через поры 0,22 мкм фильтр.
- Подготовка или получить небольшой объем стерильная среда Игла в модификации Дульбекко (DMEM), / F12, среда для культивирования клеток с 7% фетальной бычьей сыворотки (FBS) и 1X PBS без кальция или магния.
- Опухоль Разбивка
Примечание: бестимусной Nu / Nu мыши предварительно вводили опухолевые клетки в правый бок и позволили из пальпируемая массы опухоли необходимо для этой процедуры. В примерах , показанных здесь, мы использовали пациентов происхождения ксенотрансплантатов GBM клетки, JX10 и JX12 17.- Стерилизовать рабочую зону путем распыления 2% хлоргексидин и настройка рабочей зоны остроумиеч необходимые инструменты / расходные материалы , включая одноразовую патроном, пинцетом, скальпелем, стеклянной чашке Петри, ферментного раствора, PBS и хлоргексидин (смотри рисунок 2А).
- Эвтаназии мыши / мышей укрывательство опухоль фланговую. Стремитесь к скорости перемещения на 20% / мин СО 2 с использованием 30% CO 2. После того, как мышь показывает остановку дыхания, поддержания потока СО 2 в течение примерно 1 мин (обычно 3 мин общего). Мышей извлекают из камеры и цервикальной дислокации осуществляется в качестве вторичного подтверждения эвтаназии. Спрей животное с 3% хлоргексидина дезинфицировать кожу.
- Удерживая мышь устойчиво, делают полукруглый разрез кожи ~ 1,5 см от массы опухоли (флангом имплантировали опухоли) с использованием стерильного одноразового использования скальпеля с # 11 лезвием, начиная от головы к опухолевой массы и надрезывая к животу мыши и вокруг него к Хвостовой конец.
- Отражать кожу над опухолевой массы с помощью пальцев с нежным тяги на хвостовом конце разреза, а затем нажать на кожуповерхность для того чтобы поднять опухоль , чтобы иметь лучший доступ , не прикасаясь к опухоли (см Рисунок 2B).
- Используйте тупым пинцетом осторожно свободную массу опухоли от брюшную стенки и из кожи (см рисунок 2в).
- опухолевой массы Передача с пинцетом в стерильную стеклянную чашку Петри (не используйте пластиковые тарелки, чтобы предотвратить нарушения во время мясорубки) и надлежащим образом отказаться от туши и поместить эти инструменты в сторону.
- Используйте новый набор стерильных инструментов (скальпель с № 11 лезвие, полутвердого изогнутых щипцов), чтобы предотвращать опухолевая ткань некротических тканей и перепончатые хозяина соединительной ткани, покрывающей опухоли.
- Поместите 15 мл раствора фермента в стерильном вентилируемой-trypsinizing колбу с мешалкой и начинают медленно помешивая в капюшоне.
- В стерильную стеклянную чашку Петри, моют добытой опухолей 3 - 5 раз стерильной PBS для удаления избытка крови (может залить или использовать шприц, чтобы промыть их с PBS). Осторожно наклоните блюдо и пипетку или аспирация промывочного материала. Фарш еinely с помощью двух # 11 лезвий скальпеля (Смотрите рисунок 2D).
- Добавить 14 мл раствора фермента для фарша опухоли и пипетку осторожно вверх и вниз 2 - 3 раза. Передача смеси в вентилируемом trypsinizing колбу и помешивайте в течение 20 мин. Подготовьте 5 50 мл конические пробирки, добавляя 1,5 мл FBS к каждому, чтобы нейтрализовать трипсина на этапе 1.2.11.
- Через 20 мин собирают 14 мл раствора клеток из trypsinizing колбу и добавляют в одну ампулу с FBS. Добавьте 14 мл свежего раствора фермента в колбу и продолжают перемешивание.
- Центрифуга собранные клетки при 150 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант. Добавить 45 мл полной NBM к осадку, осторожно перемешать, и повторяют центрифугирование промыть сыворотку. Повторное приостановить осадок в 5 мл полной НБМ и держать на льду.
- Повторите шаги для уборки клеток в общей сложности 5 урожаев, объединяющим все заготовленные-клетки в одной конической трубе на льду.
- Поместите ячейки фильтра 40 мкм на вершине 50 мл коническую трубку. Prep тон клеточный фильтр путем пропускания 10 мл DMEM / F12 + 7% ЭТС через и затем промыванием 10 мл PBS.
- Медленно добавляют суспензию клеток в сетчатый фильтр, что позволяет ему капать через (Смотрите рисунок 2M). Аккуратно поднимите язычок ячейки сетчатого фильтра между каждым новым дополнением разорвать любой вакуум и позволить подвешенные клетки свободно проходить (Смотрите рисунок 2N).
- Центрифуга отфильтрованной клеточной суспензии, как описано выше. Повторное приостановить в 10 мл полной NBM и подсчета, чтобы определить общее число жизнеспособных клеток с использованием 0,04% трипанового синего и гемоцитометра. Держите клетки на льду до поколения microtumor.
2. Альтернативные ткани Разбивка Протокол
- Автоматизированная Диссоциатор ткань и система дезагрегации.
- Поместите дезагрегации трубку в клеточную диссоциатора, выберите программу "Опухоль _02_02" и нажмите кнопку запуска и работать в течение 32 сек. Передача трубки ротатора место в 37 ° C инкубаторе в течение 40 мин.
- Центрифуга подвешенный-клетки при 150 мкг в течение 8 минут при комнатной температуре и отбросить супернатант. В то время как центрифугирование клетки, установить реагенты для обработки суспензии клеток. Добавьте 10 мл бессывороточной NBM и осторожно растирают подвески.
- После центрифугирования получить клеточный осадок , содержащий ~ 10 - 30 х 10 6 жизнеспособных клеток (~ 0,3 мл). Ресуспендировали осадок в 10 мл бессывороточной NBM (см рисунок 2O). Определение жизнеспособных клеток путем исключения анализа (Шаг 3.2.2).
3. Microtumor поколение
- Приготовление реагентов
- Подготовить полный NBM, как в 1.1.4 и подготовить нейтрализованный высокой плотности человеческого биогелем (HuBiogel) (HDHG в дозе 3 мг / мл) на внутренний протокол. Подобные матрицы Биогель могут быть также использованы.
- Microtumor Производство и культура
- Получение свежих диссоциированных клеток PDX как суспензии отдельных клеток в полной NBM, на льду.
- Смешайте клетку суspension с равным объемом трипанового синего раствора (0,4% в ПБС) и анализируют с помощью гемоцитометра , чтобы определить число клеток и жизнеспособность путем трипанового синего 18. Удалить объем, необходимый для создания 50000 клеток / microtumor где объем = (50000 клеток / опухоль * # опухоли) / (количество жизнеспособных клеток / 1 мл) и помещают в свежую коническую трубку.
- Концентрат клеток путем центрифугирования при 150 мкг, в течение 8 минут при комнатной температуре. Жидкость над осадком сливают и ресуспендируют осадок клеток с льдом раствору HDHG в конечном соотношении 1 часть клеток в ФБС и 4-х частей HDHG.
- С помощью электронного многоканальную пипетку, чтобы дозировать по 10 мкл на контакт клеток-HDHG смеси на стальную пластину с 96-контактным (с гидрофобным покрытием) для генерации microtumors (2 мм бусин каждый из которых содержит 50000 клеток).
- Поместите 3D бусинки опухолевые внутри инкубаторе тканевых культур (37 ° C, 5% CO 2, увлажненный) в течение 15 мин для желатинирования бусинки.
- После желатинизации передачи microtumors (10 мкм; Л) к пользовательскому культуральной суспензии камеры (50 мл) или большой объем культуральной чашке (10 см), содержащий полный NBM с использованием электронного пипетку многоканальный и пользовательский пин-устройства.
- Через 1 - 2 дней в культуре ткани инкубаторе, передавать microtumors в 96-луночные культуральные планшеты, содержащие 50 мкл / лунку NBM, используя широким горлом дозирующий пипетку и выполнять различные опробования и анализа протоколов.
- Лечение наркомании и поддержание microtumors
- Выберите конечные концентрации для тестирования на наркотики.
Примечание: Если препарат известен эффективность в 2D культуре, выберите 2x IC 50 как концентрацию средней дозы и выбрать 3-кратных серийных разведений выше и ниже в течение в общей сложности 5 уровней доз. Например, если IC 50 составляет 9 мкМ для лекарственного средства в 2D культуре, выберите 2 мкМ, 6 мкМ, 18 мкМ, 54 мкМ и 162 мкМ в качестве конечной концентрации для тестирования на наркотики. - Приготовьте раствор 2x дозирования лекарственного средства в полном NBM из диметилового sulfoxiде (ДМСО) акций. Развести дозирование раствора в 1% ДМСО среды для подготовки 5 дозы, 3-кратное серийное разведение.
- Добавляют 50 мкл раствора дозирующего в microtumor лунку, содержащую 50 мкл в планшеты для анализа с целью получения конечной концентрации ДМСО 0,5%. Повторите эти действия для каждой повторности (например, 4) при каждой дозе препарата , определенной в разделе 3.3.1.
- Поддержание культуры в 37 ° C, 5% CO 2, увлажненный тканевой культуры инкубатор в течение 1 - 14 дней. Кормовые культуры в два раза в неделю за счет обновления средств массовой информации и лекарственного раствора, как описано выше.
- Выберите конечные концентрации для тестирования на наркотики.
4. Морфологические и Фенотипическая Анализ Microtumors
- Определение морфологии клеток в microtumors с использованием стандартного окрашивания живых клеток.
- Подготовьте 1 мМ запас кальцеином AM в ДМСО. Алиготе и хранить при температуре -20 ° C.
- В желательных интервалах культуры (1, 7 и 14 дней), добавляют раствор кальцеин-АМ, приготовленный в PBS (без Ca / Mg) в 96-луночный планшет в течение 1 мкМ конечной концентрации.
- высиживать20 мин при 37 ° C, 5% CO 2, увлажненном инкубаторе, а также изображения с помощью флуоресцентного микроскопа в 2X, 4X и 10X (возбуждение: 450 - 490 нм полоса пропускания, эмиссия: 515 нм длинный пас, дихроичным 500 нм) ,
- Microtumor Рост / Анализ пролиферации
- Растворите порошок МТТ в PBS (без Ca / Mg) с получением 12 мМ запаса. Стерильный фильтр, аликвоты и хранят при температуре -20 ° С.
- В желательных интервалах культивирования (1, 7 и 14 дней), добавляют по 20 мкл раствора МТТ в 96-луночный планшет на 100 мкл объема культуры. Выдержите 2 ч в инкубаторе для тканевых культур.
- Подготовить лизис свежего раствора 10% SDS в 0,01 М HCl и добавляют равное количество к объему культуры к пластинам. Выдержите запечатанные пластины в течение ночи в 37 ° C инкубаторе.
- Измерить оптическую плотность при 570 нм, используя ридер с многодисковой.
- Microtumor Подготовка к анализу Kinomic
- Подготовка буфера для лизиса путем предварительного охлаждения до 4 ° С, а затем добавление 1: соотношение 100 каждый из 100х ProTein фосфатазы Ингибитор (PPI) и 100x белка ингибитор протеазы (PI). Хорошо перемешать и держать на льду.
- Передача 2 microtumors к каждому из трех 1,5 мл микроцентрифужных трубки. Удалить супернатант и добавить 40 мкл буфера для лизиса, содержащих PPI и PI в каждую пробирку и лизировать в течение 30 мин при 4 ° С.
- Пипетировать образцы энергично сломать опухолевые шарики. Центрифуга при 16000 х г в течение 10 мин при 4 ° С и хранить образцы при температуре -80 ° С до kinomic анализа.
5. Kinomic профилирование Microtumors
- Протеинтирозинкиназы (ПТК) профилирование
- Оттепель реагенты (10x протеинкиназы (PK) буфера и 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА)) до 4 ° C Нагрузка PK буфера (300 мкл 10х PK буферный запас в 2,7 мл дН 2 O) в шприц в положении # 2 на профилирование Платформа.
- Откройте программу киназа анализа программного обеспечения и загрузите файл протокола ПТК и нажмите 'Start', аннотирования образцы в пределах Softwявляются программа после сканирования чипов. Место чипы на профилирующей платформу и нагрузка 25 мкл 2% бычьим сывороточным альбумином (БСА) в массиве, а затем прижимающая нагрузка, чтобы начать программным управлением протокола стадии блокирования.
- Развести 6 мкм 100 мМ АТФ запаса с 54 мкл дН 2 O , чтобы сделать 10 мМ аденозинтрифосфата (АТФ). Когда программа начинается 3 - й и заключительный этап стирки (отображается на экране) приносят 15 мкг лизата доводят до 28 мкл с дН 2 O, перемешать и добавить в массив.
- Подготовка ПТК мастер-микс (ММ) (до 12 образцов). Добавить 32,6 мкл дН 2 O для воссоздания дитиотреитола (DTT) и добавьте 6 мкл DTT и 60 мкл 10х PK раствора, к ПТК-MM1 трубки (уже содержит 60 мкл 10х БСА).
- Подождите, пока 'Load' в строке программного обеспечения для анализа киназы появляется затем добавить 126 мкл ПТК-MM1, 60 мкл ПТК добавки и 60 мкл 10 мМ АТФ в MM2 (содержит ранее аликвоты 4,5 мкл PY20 FITC антитела) и перемешать.Добавьте 16 мкл этого ПТК мастер смеси для каждого образца лизата трубки и пипетки смеси 5 раз.
- Убедитесь, что крышка стекло чистое, а затем добавить 35 мкл лизата / мастер смеси на массив, близко карусельного крышкой и нажать кнопку LOAD.
- Серин / треонин киназа (СТК) Профилирование:
- Оттаивания реагенты (10x П.К. буфер, 10x СТК буфера и 2% бычьего сывороточного альбумина) до 4 ° С. Нагрузка PK буфер (300 мкл в 2,7 мл дН 2 0) в положение шприца # 1, 1:10 и СТК буфере (300 мкл в 2,7 мл дН 2 0) в положение шприца # 2.
- Откройте программу компьютерного программного обеспечения для анализа киназа и загрузить файл протокола СТК и нажмите START, аннотирования образцы в рамках программы после сканирования чипов. Место чипы на профилирующей платформы и нагрузки 25 мкл 2% БСА в массиве, а затем нажмите НАГРУЗКИ, чтобы начать шаг протокола блокирования программным управлением.
- Развести 6 мкМ 100 мМ АТФ с 54 мкл дН 2 O. Во время заключительного (3 - й) моют стадии смеси2 мкг лизата и довести до 32,6 мкл с дН 2 O, перемешать и добавить в массив.
- Сделать СТК мастер - микс: Добавьте 70 мкл 10х PK в STK-MM1 трубки (содержит 7 мкл 100x БСА), а затем добавляют 42 мкл дН 2 O в STK-MM1 трубки.
- Подождите, пока 'Load' в строке для анализа программного обеспечения киназы затем: Добавить 18 мкл 10 мМ АТФ в СТК-MM1, и добавьте 9 мкл mm1 для каждого образца лизата. Хорошо перемешать.
- Убедитесь, что крышка стекло чистое и добавить 35 мкл лизата / мастер смеси на массив, близко карусельного крышкой, и нажмите LOAD.
- Во время заключительного (3 - й) моют Шаг добавить 1,05 мкл СТК-FITC вторичное антитело к КСППР трубке (содержит 3,03 мкл STK первичной смеси антител), добавьте 39,6 мкл AB буфера в КСППР, добавить 356,0 мкл дН 2 O в КСППР, добавить 30 мкл к КСППР для каждого массива и нажмите НАГРУЗКИ ,
- Анализ данных Kinomic 19,20
- Открытое программное обеспечение для анализа и загрузить изображение Анализ App. SeLect папка изображения, содержащая Barcoded и отметками времени изображения весь массив для ПТК или STK данных, выберите номер статьи соответствует файл макета массива (86312 для ПТК и 87102 для СТК), и загрузить сгенерированный ранее массив аннотаций файла.
- Проверьте правильность Гридинг всех изображений, и во время выполнения экспозиции Scaling App. Статистически сравнение log2 преобразованных значений экспозиции / наклона и проверки с предварительной стиркой кинетических кривых 19-21.
- Запуск вверх по течению программного обеспечения предсказания киназа для запроса измененных kinomic профилей между условиями для восходящего канала киназ 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы показали, что 3D-система биогель культуры поддерживает долгосрочный рост и функционирование нескольких типов клеток. В этом совместном проекте, пациент полученный GBM xenolines (PDX) используются для изготовления сотни microtumors. Разъединенные клетки (3 х 10 5) или нейросферы (40 - 50) были встроены в биогель бусин (2 мм) , и после того, как быстро желатинизации они культивируют в NB-носители , заполненной таможенной биореакторе. Жизнеспособность клеток (Кальцеин-AM), профиль роста (МТТ), и kinomic активности на основе массивов анализа были определены. PDX microtumors поддерживается многоклеточной организации и высокую жизнеспособность (> 80%) в течение> 3-х недель. Мы считаем , что в естественных условиях -как биологии связано с поддержанием 3D клеточной матрицы архитектуры (не представляется возможным с 2D или сфероида культуры). Кроме того , отмечается , что 3D опухоли трудно производить с хрупкой желатиновой белковой эшафот, возможно , из - за недостатка коллагена I 14. Рабочая схема для микрофонаrotumor производства с использованием клеток PDX и системы 3D биогель приводится на рисунке 1 , и процесс диссоциации изображен на рисунке 2.
С помощью изображений живых клеток через кальцеин-АМ, мы определили клеточный рост и жизнеспособность, а также влияния препаратов на клетки GBM, полученных из опухоли PDX JX10, как показано снижение флуоресценции, сигнализируя гибель клеток. Рост опухоли измеряли на 0, 7 и 14 для microtumors отображающих непрерывного роста , как показано на фигуре 3А. Это microtumor, JX10, как известно, быть устойчивыми к TMZ. При воздействии 1 - 10 мкМ TMZ, было отмечено минимальное подавление роста (рис 3B). Тем не менее, тестирование опухоли PDX JX12, которая , как известно, чувствительны к TMZ, продемонстрировал чувствительность за счет МТТ через 14 дней , что было подтверждено Кальцеин-AM визуализации (рисунок 4).
er.within-страница = "1"> Для того, чтобы изучить потенциальные механизмы лекарственной устойчивости, мы измерили сигнализации киназы в устойчивых microtumors ТМЗ (JX10). Kinomic профили для 144 тирозина и 144 серин / треонин Phosphopeptide цели были захвачены для ДМСО и 10 мкМ ТМЗ обрабатывали microtumors. Kinomic интенсивности фосфорилирования для всех пептидных мишеней, за один цикл, и в несколько раз экспозиция была захвачена (данные не показаны). Представитель Heatmap отображения пептидов , которые значительно измененными интенсивности с 10 мкМ лечения ТМЗ (р <0,05, непарные студентов T-тест) отображается на рисунке 5А. Kinomic профили , которые были изменены в TMZ лечение JX10 microtumors анализировали с использованием программного обеспечения , вверх по течению предсказания киназа , что идентифицированный SYK, LCK, и СТК киназ , как увеличилось в TMZ обработанных образцов по отношению к ДМСО (Фиг.5В). Анализ серин / треонин киназа kinome вверх по течению также была проведена (5С).
Содержание "ВОК: Keep-together.within-страница =" 1 ">
Рисунок 1:. Схема работы опухолей Microtumor Производство GBM-PDX диссоциируют из мышиного хозяина, и отдельные клетки встраиваются в биогеля матрице с образованием microtumors. Анализы затем выполняются на microtumors. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2:. Разобщение PDX опухолевых клеток Опухоли удалены от мышей - хозяев и измельчали перед смешиванием с раствором фермента (AG). Разобщенность проявляется после 40 мин (H). Опухолевой клетки Диссоциатор показан (I). Растирание в средствах массовой информации и фильтрации (JN) показан с конечным RESUл 0,3 мл окатышей (O) , содержащего 29,5 х 10 6 жизнеспособных клеток (P) , которые образуют сфероиды в NBM в 24 ч (Q). Шкала бар составляет 20 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Рост Microtumors JX10 microtumor роста измеряется по оптической плотности (OD) МТТ и репрезентативных изображений в течение 14 дней, как базально (А), и в ответ на 1-10 мкМ лечения ТМЗ (В).. Изображения показываются в 4-кратным увеличением (шкала бар = 500 мкм). Стандартное отклонение указывается. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры. 
Рисунок 4:. Рост Microtumors JX12 microtumor рост измеряется OD МТТ и репрезентативных изображений в течение 14 дней, как базально (день 1), а также в ответ на 0, 1, или 10 мкМ ТМЗ лечения (масштаб бар = 500 мкм). Стандартное отклонение указывается. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Kinomic Профили TMZ Обработанные Microtumors Heatmap от воздействия интегрированных значений (log2 преобразованные трассы (х 100) от 10, 20, 50, 100 и 200 мс медиана минус сигнал фоновых значений экспозиции) отображаются для значительно ТМЗ-изменен. измененные пептиды (р <0,05). Красный указывает на усиление, а синий снизился относительно ДМСО означает, за пептида. ТМЗ измененные профили сравнивали с использованием вверх по течению программного обеспечения предсказания киназа и измененными киназ. Нормализованная киназа Статистика (НКС) оценка> 1,0 и специфичность оценка> 1.3 (красный) считаются весьма изменены. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Критические шаги в рамках протокола в основном относятся к microtumor поколения, а также дозирование лекарственного средства и обслуживание. Поскольку microtumor шарики являются хрупкими и легко рвутся, крайняя осторожность необходима в обеих стадиях развития анализе и технического обслуживания. При возникновении ошибки во время любого из этих процессов, экспериментальная интерпретация может быть поставлена под угрозу, вызывая расширение или ненужного повторения экспериментов или даже исключение данных.
Модификации и устранение неисправностей, особенно в процессе разработки microtumor, включали в себя проектирование и изготовление пользовательских гидрофобного инструмента для использования изготовления microtumor бусы. Этот инструмент позволяет быстрее и более точные производства microtumors. Кроме того, небольшие изменения к содержанию в microtumors помогли ускорить процесс изменения среды и дозирования клеток. Некоторые из этих модификаций включены, но не ограничиваясь ими, с помощью многоканальногоэлектронные пипетки для удаления и замены среды из 96-луночных планшетов и предварительного смешивания свежих растворов препарата дозирования и упорядочивание 2-х кратному растворы в соответствующем 2 мл 96-луночного планшета.
Основные оптимизации для условий культивирования в 3D моделирования включает в себя определение подходящих дозировок для лекарственных соединений, так как есть плохое отношение между 2D моделирования и 3D моделирования. Поэтому серийных разведений для создания кривой титрования дозы часто необходимо для перемещения системы 2D-модели к модели 3D microtumor.
Потенциальные проблемы, чтобы рассмотреть с образованием microtumor из xenoline опухолевых клеток, полученных от мыши включают бактериальной или грибковой контаминации, непоследовательное наличие первичных xenolines, а уникальные свойства роста у мышей может производить различия во времени сбора урожая и дисперсии урожайности клеток из отдельных диссоциациями. С каждой линии клеток, количество клеток, полученных, а так же, сколько microtumors может быть произведено Wiбудете меняться. Таким образом, существует необходимость установить приоритеты, которые необходимы анализы и какие из них являются "необязательно" следует выход microtumor быть недостаточной. Потенциальные ограничения с kinomic профилирования microtumors включают трудности в коррекции для инертного белковый материала загрузки, а образцы загружаются таким образом, чтобы скорректировать BCA определяли уровни белка, которые могут не различать между белками биогель на основе (ECM белков) и те из клеточный компонент киназы, который предназначен для измерения. Измерение валового microtumor массы через кальцеином AM, или с помощью домашнего хозяйства белок как фактор коррекции может смягчаться, хотя проблемы с уровнем белка в ведение домашнего хозяйства опухолей вследствие их изменения может вносить путаницу в это. За короткий промежуток времени курс сигнализации эксперименты, предполагая одинакового размера (киназа, содержащий количество живых клеток) и спаренный обработанных и необработанных образцов, это менее важной проблемой.
С помощью этого исследования, цель состоит в том, чтобы обеспечить более экономически-еffective и болезни представитель доклинические модель для точного тестирования лекарственной терапии по сравнению с ортотопической ксенотрансплантаты пациентов происхождения, в настоящее время стандартная модель для тестирования золота GBM. В последние годы несколько групп попытались смоделировать в естественных условиях окружающей среды GBM для целей тестирования на наркотики. Некоторые группы просто пытались вырастить GBM опухолевых клеток в не отличающих условиях для сохранения GBM стволовых клеток или , по крайней мере , опухоли головного мозга инициируя клетки (BTIC) 24,25. Эти tumorsphere или нейросфера культуры могут быть использованы для тестирования на наркотики и, скорее всего, превосходит традиционные модели. Однако, так как они до сих пор не хватает опухоли стромы, что взаимодействие сохраняется в нашей модели microtumor, то tumorsphere подход по-прежнему ограничен. Другие группы попытались применить технические принципы для улучшения модели GBM 26-28. Эти подходы включали камеры потока, переменные белки ECM и опухолевой клетки / нормальные клеточные смеси. В то время как перспективные, почти все эти репортс использовали иммортализованные клеточные линии с предостережений, упомянутых ранее. Таким образом, мы считаем, что модель microtumor PDX на основе описанной здесь более клинически значимым.
В будущем модель microtumor может быть использован либо как истинный аватара опухоли или '' пробанда системы. С пробанда системе, PDX разработана с конкретного пациента непосредственно не дают врачу дополнительную информацию о терапии, что конкретные пациента, а с системой Опухоль аватаров. Вместо того , опухоль пациента является "соответствие" к ранее существовавшие, хорошо охарактеризованы (как и фенотипически молекулярно) PDX 29. На самом деле, эта модель могла бы служить в качестве "идти к" аватар или находиться в библиотеке пробанда в качестве сравнительного профиля. С традиционными аватарами, рост опухолевых клеток пациента у мышей параллельно к лечению пациента не только потребляют, так как это может занять несколько месяцев для первичного прохода, но и дорогостоящее время, как тестирование несколько dковер терапии у мышей генерируют подавляющую цену. Для борьбы с этим, первичная опухоль пациент может быть имплантирован непосредственно в матрицу биогеля. С microtumors, результаты могут быть получены быстро и по более низкой стоимости.
В качестве пробанда модели, профили данных microtumor kinome и ответ лекарственного средства могут быть добавлены в библиотеку пробанда ',' наряду с профилями и данными из предыдущего 3D моделей в лабораторных условиях , существующих PDXs, исследованиях на животных, других пациентов, и т.д.. Теоретически, опухолевые клетки пациента может затем быть 'omically' (genomically, kinomically, transcriptomically и т.д.) согласован с аналогичным профилем существующего microtumor для определения точной обработки для достижения наилучшего результата.
Резюме: Здесь мы определяем, что эти модели microtumor могут быть использованы для измерения как фенотипический роста и могут быть запрошены как на базальном уровне активности киназы и в ответ на медикаментозное лечение, которое может быть полезнымкак поступательной инструмент для дальнейшего доклинических исследований. Разработка точных и достоверных проверяемые молекулярно моделей опухолей человека крайне важно для эффективного развития наркотиков.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
При поддержке гранта NIH R21 (PI: С. Уилли, CA185712-01), Brain награду Опухоль SPORE (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) и договор SBIR (PI: Р. Сингх, N43CO-2013-00026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
