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Microtumors 3 डी मानव Biogel संस्कृति प्रणाली का प्रयोग और Kinomic रूपरेखा और दवा प्रतिक्रिया परीक्षण के लिए रोगी व्युत्पन्न ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं की पीढ़ी

Published: June 9, 2016 doi: 10.3791/54026
Automatic Translation
1, 4, 2, 3, 2, 3, 4, 2
1Biomedical Engineering, University of Alabama at Birmingham, 2Radiation Oncology, University of Alabama at Birmingham, 3Neurosurgery, University of Alabama at Birmingham, 4Vivo Biosciences, Inc.

Introduction

सबसे आम प्राथमिक intracranial घातक ब्रेन ट्यूमर ग्रेड III astrocytomas और ग्रेड चतुर्थ ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (ग्लियोब्लास्टोमा या जीबीएम) कर रहे हैं। अमेरिका में 1-3 जीबीएम के लिए वर्तमान चिकित्सा के साथ 15 माह - ये ट्यूमर 12 के बीच मंझला एक साल के अस्तित्व के साथ गरीब prognoses प्रदान करते हैं। Multimodality उपचारों सर्जरी, विकिरण, और temozolomide (TMZ) और काइनेज-लक्षित एजेंट सहित कीमोथेरेपी शामिल हैं। काइनेज सिगनल अक्सर जीबीएम में dysregulated है epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGFR) में वृद्धि के संकेत, बढ़ Phosphatidyl-Inositol -3 kinase (PI3K) और प्रवर्धन के साथ ट्यूमर के सबसेट या सक्रिय म्यूटेशन सहित, ट्यूमर संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर (VEGFR) के साथ ही अन्य काइनेज संचालित रास्ते 4-6 के माध्यम से एन्जियोजेनिक संकेतन का समर्थन। इन विट्रो में और vivo मॉडल अक्सर ये प्रतिनिधि परिवर्तन खो वर्तमान <sup> 7। इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक प्रोफाइलिंग प्रत्याशित लाभ है कि तथ्य यह है कि आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन हमेशा प्रोटीन गतिविधि का स्तर है, जहां सबसे काइनेज को निशाना एजेंटों सीधे अधिनियम में परिवर्तन की भविष्यवाणी नहीं है, और जहां कार्रवाई की अन्य तंत्र के साथ चिकित्सा कार्य कर सकते हैं प्रतिबिंबित कर सकते हैं की पेशकश नहीं किया गया है परोक्ष रूप से।

पारंपरिक अमर सेल लाइन है कि विज्ञापन अनन्त passaged किया जा सकता भर के रखरखाव और reproducibility के अपने आसानी के कारण दवा के परीक्षण के लिए मानक किया गया है। हालांकि, इस मॉडल एक उच्च पोषक तत्व (और कृत्रिम) विकास वातावरण है कि तेजी से कोशिकाओं है कि मूल ट्यूमर से काफी भिन्न उगाने के लिए चुनता से ग्रस्त है। जैसे, वहाँ और अधिक यथार्थवादी मॉडल प्रणाली के रूप में रोगी में मौजूद है कि एक अधिक जटिल ट्यूमर जैविक प्रणाली को प्रतिबिंबित विकसित करने में काफी रुचि रही है। ट्यूमर xenografts एक प्राथमिक ट्यूमर चूहों में उगाया ( "xenoline," मरीज व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट या PDX) प्रावधानों से सीधे विकसितडी एक अधिक चिंतनशील मॉडल प्रणाली, विशेष रूप से कैंसर चिकित्सा विज्ञान की स्थापना में, के रूप में वे और अधिक मज़बूती से नैदानिक ​​सफलता की भविष्यवाणी करने के लिए। 8 अधिक चिंतनशील जीव विज्ञान के बावजूद महसूस कर रहे हैं, इन मॉडलों महंगे हैं और स्थापित करने और बनाए रखने के लिए मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, वे उच्च throughput अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। जरूरत को बेहतर जीवविज्ञान का मॉडल है कि अधिक सही प्राथमिक ट्यूमर में आणविक परिवर्तन को प्रतिबिंबित, और प्रोफ़ाइल के लिए और kinase गतिविधि के प्रत्यक्ष उपायों का उपयोग इन मॉडलों का परीक्षण, आनुवंशिक मार्करों सरोगेट नहीं विकसित करने के लिए, स्पष्ट है।

यह अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है कि दो-आयामी (2 डी) monolayer संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी या बहुकोशिकीय परख मॉडल और अधिक physiologically प्रासंगिक समापन 9-11 प्रदान कर सकते हैं। आम 3D संस्कृति मैट्रिक्स लेपित microcarriers और सेल अंडाकार आकृति के गठन को शामिल दृष्टिकोण। ट्यूमर spheroids स्पिनर फ्लास्क, pHEMA प्लेट का उपयोग और ड्रॉप तकनीक फांसी सेलुलर एकत्रीकरण के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है। टी के लिए सीमाओंhese दृष्टिकोण शामिल हैं: कुछ कोशिकाओं स्थिर spheroids, परिवर्तनशीलता विकास में और मिश्रित प्रकार की कोशिकाओं के साथ चुनौतियों के रूप में करने के लिए असमर्थता। वैकल्पिक रूप से, कई सिंथेटिक (हाइड्रोजेल, बहुलक) और पशु व्युत्पन्न Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा से मैट्रिक्स, गोजातीय कोलेजन) matrices 3 डी संस्कृति के लिए विकसित किया गया है अध्ययन 12-14। माउस EHS मैट्रिक्स बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया लेकिन इन विट्रो और इन विवो 15 में सेल के विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है।

आदेश में 3 डी ट्यूमर जीव विज्ञान को दोहराने के लिए, एक मानव biomatrix प्रणाली डॉ। राज सिंह एट अल 16 से विकसित किया गया था। प्राकृतिक, वृद्धि कारक मुक्त मानव biogel 3D संस्कृति scaffolds (मोती, डिस्क) है, जो अनेक प्रकार की कोशिकाओं के लंबे समय तक खेती का समर्थन करता है। 3 डी मानव biogel संस्कृति डिजाइन की एक श्रृंखला ट्यूमर के विकास, आसंजन, angiogenesis और आक्रमण गुण के अध्ययन के लिए स्थापित कर रहे हैं। फायदे और मानव biogel के गुणों को आम की तुलना मेंमाउस EHS जैल तालिका 1 और 2 टेबल में संक्षेप हैं।

स्रोत: मानव Amnions (जमा ऊतक)
पैथोजन मुक्त, आईआरबी मुक्त / अनुमोदित
ईसीएम प्रकृति: गैर विकृत Biogel (जीएलपी उत्पादन)
कुंजी
अवयव: 		कर्नल-मैं (38%), laminin (22%), कर्नल IV (20%), कर्नल III (7%), Entactin और HSPG (<3%)
GF-मुक्त: Undetectable EGF, FGF, TGF, वीईजीएफ़, PDGF (गैर-एन्जियोजेनिक, गैर विषैले)

तालिका 1: मानव Biogel के गुण के रूप में आम EHS जैल की तुलना में।

मानव Biogel EHS जैल
प्राकृतिक मानव मैट्रिक्स पुनर्गठन माउस मैट्रिक्स
नियंत्रित सेल के विकास और भेदभाव सेल के विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने के कर सकते हैं
शारीरिक जीन अभिव्यक्ति चर जीन अभिव्यक्ति
3 डी ऊतक की तरह संस्कृति मॉडल प्लेट आधारित संस्कृति मॉडल

तालिका 2: मानव Biogel के लाभ के रूप में आम EHS जैल की तुलना में।

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Protocol

नोट: सभी जेनोग्राफ्ट चिकित्सा मूल्यांकन एक प्रोटोकॉल संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित पर ग्लियोब्लास्टोमा के लिए एक orthotopic ट्यूमर मॉडल का उपयोग किया गया।

1. रोगी व्युत्पन्न जीबीएम Xenograft कोशिकाओं के अलगाव

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. 5 मिलीग्राम / एमएल और बाँझ फिल्टर की एकाग्रता के लिए बाँझ पानी में पुन: गठन कोलैजिनेज़-मैं। -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिलीलीटर aliquots में स्टोर (अंतिम एकाग्रता 100 मिलीलीटर एंजाइम समाधान में 50 माइक्रोग्राम / एमएल) है।
    2. 2 मिलीलीटर में 100 माइक्रोग्राम एपिडर्मल ग्रोथ फैक्टर (EGF) भंग बाँझ फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस)। 100 μl (5 माइक्रोग्राम / 100 μl) 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर।
    3. 2 मिलीलीटर में 100 माइक्रोग्राम FGF-β बाँझ पीबीएस भंग। 100 μl (5 माइक्रोग्राम / 100 μl) 10 एनजी / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में स्टोर।
    4. Neurobasal मेड के निम्नलिखित के लिए एक 500 मिलीलीटर की बोतल जोड़ेआइए (NBM) तैयार करने के लिए पूरा NBM: विटामिन ए के बिना 10 मिलीलीटर बी -27 पूरक, 5 मिलीलीटर एन 2 पूरक, 100 μl EGF, 100 μl fibroblast वृद्धि कारक (FGF) बुनियादी, 5 मिलीलीटर Amphotericin बी, 0.5 मिलीग्राम gentamycin, 5 मिलीलीटर एल glutamine।
    5. संयोजन से ताजा एंजाइम समाधान तैयार: 98.5 मिलीलीटर पीबीएस, 1 मिलीलीटर कोलैजिनेज़-1, 0.5 मिलीग्राम 10x / trypsin EDTA और के माध्यम से 0.22 माइक्रोन ताकना फिल्टर निस्पंदन द्वारा बाँझ।
    6. तैयार करें या एक छोटी मात्रा बाँझ Dulbecco संशोधित ईगल मध्यम (DMEM) 7% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS) और 1x पीबीएस कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना साथ / F12 सेल संस्कृति के माध्यम से प्राप्त करते हैं।
  2. ट्यूमर disaggregation
    नोट: पहले एक स्पष्ट ट्यूमर जन से करने के लिए सही दिशा में ट्यूमर कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन और अनुमति दी athymic परमाणु / परमाणु माउस इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक है। यहाँ दिखाए गए उदाहरण में, हम रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट जीबीएम कोशिकाओं, JX10 और JX12 17 का इस्तेमाल किया।
    1. 2% chlorhexidine छिड़काव द्वारा कार्य क्षेत्र जीवाणुरहित और कार्य क्षेत्र बुद्धि की स्थापनाज आवश्यक उपकरण / आपूर्ति डिस्पोजेबल चक, संदंश, छुरी, कांच पेट्री डिश, एंजाइम समाधान, पीबीएस, और chlorhexidine (2A चित्रा देखें) भी शामिल है।
    2. एक ओर ट्यूमर को शरण देने के लिए माउस / चूहों euthanize। सीओ 2 के एक 20% / मिनट विस्थापन की दर 30% सीओ 2 का उपयोग करने के लिए निशाना लगाओ। बाद माउस सांस की गिरफ्तारी से पता चलता है, के बारे में 1 मिनट (आमतौर पर 3 मिनट कुल) के लिए सीओ 2 प्रवाह बनाए रखने के। चूहे कक्ष से हटा रहे हैं और गर्भाशय ग्रीवा अव्यवस्था एक माध्यमिक इच्छामृत्यु पुष्टि के रूप में किया जाता है। 3% chlorhexidine के साथ पशु स्प्रे त्वचा को साफ करने के लिए।
    3. माउस स्थिर पकड़े, बनाने अर्द्ध परिपत्र त्वचा चीरा ~ ट्यूमर जन (पार्श्व प्रत्यारोपित ट्यूमर) से 1.5 सेमी # 11 ब्लेड के साथ एक बाँझ डिस्पोजेबल स्केलपेल का उपयोग ट्यूमर जन को कपाल शुरुआत और करने के लिए माउस के पेट की ओर incising और चारों ओर दुम का अंत।
    4. चीरा की दुम अंत पर कोमल कर्षण के साथ उंगलियों का प्रयोग ट्यूमर जन पर त्वचा को प्रतिबिंबित और फिर त्वचा पर धक्काट्यूमर को छूने के बिना सबसे अच्छा उपयोग किया है ट्यूमर तरक्की की सतह (चित्रा 2B देखें)।
    5. संदंश के साथ कुंद विच्छेदन का प्रयोग धीरे पेरिटोनियल दीवार से और त्वचा से मुक्त ट्यूमर जन (चित्रा -2 सी देखें)।
    6. बाँझ कांच पेट्री डिश (प्लास्टिक के बर्तन का प्रयोग नहीं करते नख़रेबाज़ दौरान तोड़ने को रोकने के लिए) और ठीक से शव त्यागने और इन उपकरणों के लिए अलग जगह के लिए संदंश के साथ स्थानांतरण ट्यूमर जन।
    7. बाँझ उपकरणों के नए सेट का उपयोग करें (# 11 ब्लेड, अर्द्ध घुमावदार संदंश के साथ छुरी) परिगलित ऊतक और झिल्लीदार मेजबान संयोजी ऊतक को कवर ट्यूमर का ट्यूमर के ऊतक debride करने के लिए।
    8. हलचल पट्टी के साथ एक बाँझ निकाल-trypsinizing फ्लास्क में 15 मिलीलीटर एंजाइम समाधान की जगह और हुड में धीरे-धीरे सरगर्मी शुरू करते हैं।
    9. बाँझ पीबीएस के साथ 5 बार अतिरिक्त रक्त दूर करने के लिए (डालना या उन्हें पीबीएस के साथ कुल्ला करने के लिए सिरिंज का उपयोग कर सकते हैं) - एक बाँझ कांच पेट्री डिश में, काटा ट्यूमर 3 धो लें। धीरे पकवान और pipet झुकाव या धोने सामग्री aspirate। कीमा चinely दो # 11 स्केलपेल ब्लेड का उपयोग कर (चित्रा 2 डी देखें)।
    10. 3 बार - 2 धीरे ऊपर और नीचे कीमा ट्यूमर और pipet के लिए एंजाइम समाधान के 14 मिलीलीटर जोड़ें। निकाल-trypsinizing स्थानांतरण मिश्रण करने के लिए फ्लास्क और 20 मिनट के लिए धीरे-धीरे हलचल। आदेश में कदम 1.2.11 में trypsin बेअसर करने के लिए प्रत्येक को 1.5 मिलीलीटर FBS जोड़कर 5 से 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब तैयार।
    11. 20 मिनट के बाद, trypsinizing कुप्पी से सेल के समाधान के 14 मिलीलीटर इकट्ठा करने और FBS के साथ एक ट्यूब में जोड़ें। फ्लास्क और सरगर्मी जारी रखने के लिए 14 मिलीलीटर ताजा एंजाइम समाधान जोड़ें।
    12. अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 150 XG पर कोशिकाओं एकत्र की है और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। गोली के लिए पूरा NBM के 45 मिलीलीटर जोड़ें, धीरे मिश्रण है, और सीरम बाहर कुल्ला करने के लिए centrifugation दोहराएँ। पुनः निलंबित 5ml पूरा NBM में गोली और बर्फ पर पकड़।
    13. 5 फसल की कुल के लिए दोहराएँ सेल फसल कदम, बर्फ पर एक भी शंक्वाकार ट्यूब में सभी काटा कोशिकाओं के संयोजन।
    14. एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के शीर्ष पर एक 40 माइक्रोन सेल झरनी रखें। तैयारी टीवह माध्यम DMEM / F12 + 7% FBS की 10 मिलीलीटर से गुजर रहा है और उसके बाद 10 मिलीलीटर पीबीएस के साथ धोने से छलनी सेल।
    15. धीरे-धीरे झरनी के लिए सेल निलंबन जोड़ने, यह (चित्रा 2 एम देखें) के माध्यम से ड्रिप के लिए अनुमति देता है। धीरे प्रत्येक नए इसके अलावा किसी भी वैक्यूम तोड़ने के लिए और निलंबित कोशिकाओं को स्वतंत्र रूप से पारित करने के लिए अनुमति देने के लिए बीच में सेल झरनी के टैब उठा (चित्रा 2N देखें)।
    16. जैसा कि ऊपर फ़िल्टर सेल निलंबन अपकेंद्रित्र। पूरा NBM 10 मिलीलीटर में फिर से निलंबित और 0.04% trypan नीले और एक hemocytometer का उपयोग व्यवहार्य कोशिकाओं की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए गिनती। microtumor पीढ़ी तक बर्फ पर कोशिकाओं पकड़ो।

2. वैकल्पिक ऊतक disaggregation प्रोटोकॉल

  1. स्वचालित ऊतक dissociator और disaggregation प्रणाली।
    1. disaggregation ट्यूब सेलुलर dissociator में रखें, कार्यक्रम "ट्यूमर _02_02" और प्रेस प्रारंभ चयन और 32 सेकंड के लिए चला रहे हैं। स्थानांतरण ट्यूब 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रोटेटर करने, जगह है।
    2. अपकेंद्रित्र कमरे के तापमान पर 8 मिनट के लिए 150 XG पर निलंबित कर दिया कोशिकाओं और सतह पर तैरनेवाला त्यागें। कोशिकाओं centrifuging, वहीं सेल निलंबन के प्रसंस्करण के लिए अभिकर्मकों की स्थापना की। 10 मिलीलीटर सीरम मुक्त NBM और धीरे Triturate निलंबन जोड़ें।
    3. 30 x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं (~ 0.3 मिलीलीटर) - centrifugation के बाद, ~ 10 से युक्त एक सेल गोली प्राप्त करते हैं। (चित्रा 2O देखें) 10 मिलीलीटर सीरम मुक्त NBM में गोली पुनः निलंबित कर दिया। बहिष्कार परख द्वारा व्यवहार्य कोशिकाओं का निर्धारण करते हैं (चरण 3.2.2 देखें)।

3. Microtumor जनरेशन

  1. अभिकर्मकों की तैयारी
    1. पूरा NBM 1.1.4 के रूप में तैयार है और आंतरिक प्रोटोकॉल के अनुसार (3 मिलीग्राम / एमएल HDHG) निष्प्रभावी उच्च घनत्व मानव biogel (HuBiogel) तैयार करें। इसी biogel matrices के रूप में अच्छी तरह से इस्तेमाल किया जा सकता है।
  2. Microtumor उत्पादन और संस्कृति
    1. पूरा NBM में एकल कक्ष निलंबन, बर्फ के रूप में हौसले से अलग PDX कोशिकाओं को प्राप्त।
    2. सेल सु मिक्सtrypan नीले समाधान (पीबीएस में 0.4%) और के एक बराबर मात्रा के साथ spension trypan नीले बहिष्कार 18 से सेल नंबर और व्यवहार्यता का निर्धारण करने के लिए hemacytometer का उपयोग का विश्लेषण। मात्रा आवश्यक हटाये 50,000 कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए / microtumor जहां मात्रा = (50,000 कोशिकाओं / ट्यूमर * # ट्यूमर) / (व्यवहार्य सेल / 1 मिलीलीटर गिनती) और एक ताजा शंक्वाकार ट्यूब में जगह है।
    3. 150 XG पर centrifugation द्वारा कोशिकाओं ध्यान लगाओ, 8 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर। सतह पर तैरनेवाला त्यागें और FBS में 1 भाग की कोशिकाओं और 4 भागों HDHG के अंतिम अनुपात में ठंडा HDHG समाधान के साथ सेल गोली resuspend।
    4. एक 96-पिन स्टील प्लेट (हाइड्रोफोबिक कोटिंग के साथ) पर प्रति पिन सेल HDHG मिश्रण 10 μl बांटना microtumors (2 मिमी मोती प्रत्येक 50,000 कोशिकाओं से युक्त) उत्पन्न करने के लिए एक इलेक्ट्रॉनिक मल्टीचैनल पिपेट का प्रयोग करें।
    5. टिशू कल्चर इनक्यूबेटर (37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, humidified) के अंदर 3 डी ट्यूमर मोती 15 मिनट के लिए रखें मोती gelate करने के लिए।
    6. जमाना बाद, microtumors 10 μ हस्तांतरण (; ठ) एक कस्टम निलंबन संस्कृति कक्ष (50 एमएल) या बड़ी मात्रा में संस्कृति डिश (10 सेमी) इलेक्ट्रॉनिक मल्टी चैनल पिपेट और कस्टम पिन डिवाइस का उपयोग कर पूरा NBM से युक्त।
    7. 1 के बाद - टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 दिन, 96 अच्छी तरह से संस्कृति 50 μl NBM / विभिन्न परख और विश्लेषण प्रोटोकॉल अच्छी तरह से एक चौड़े मुंह पिपेट वितरण का उपयोग और प्रदर्शन से युक्त प्लेटों के लिए microtumors हस्तांतरण।
  3. दवा उपचार और microtumors का रखरखाव
    1. दवा परीक्षण के लिए अंतिम सांद्रता का चयन करें।
      नोट: दवा 2 डी संस्कृति में प्रभावकारिता जाना जाता है, तो चुनिंदा 2x आईसी 50 मध्यम खुराक एकाग्रता के रूप में और ऊपर और नीचे 5 खुराक स्तरों के एक कुल के लिए धारावाहिक dilutions 3 गुना का चयन करें। उदाहरण के लिए, यदि आईसी 50 2 डी संस्कृति में दवा के लिए 9 माइक्रोन है, 2 माइक्रोन, 6 माइक्रोन, 18 माइक्रोन के 54 माइक्रोन के, और नशीली दवाओं के परीक्षण के लिए अंतिम एकाग्रता के रूप में 162 माइक्रोन के चयन करें।
    2. डाइमिथाइल sulfoxi से पूरा NBM में 2x दवा खुराक समाधान तैयारडे (DMSO) शेयर। एक 5 खुराक, 3 गुना धारावाहिक कमजोर पड़ने तैयार करने के लिए 1% DMSO के माध्यम में खुराक समाधान पतला।
    3. 0.5% की एक अंतिम DMSO एकाग्रता को प्राप्त करने के लिए अच्छी तरह से परख प्लेटों में 50 μl युक्त microtumor को खुराक समाधान के 50 μl जोड़ें। प्रत्येक दवा 3.3.1 में निर्धारित मात्रा में प्रत्येक को दोहराने (जैसे, 4) के लिए दोहराएँ।
    4. 37 डिग्री सेल्सियस में संस्कृतियों को बनाए रखने, 5% सीओ 2, 1 के लिए humidified टिशू कल्चर इनक्यूबेटर - 14 दिनों के लिए। फ़ीड संस्कृतियों दो बार ऊपर के रूप में मीडिया और दवा समाधान ताज़ा द्वारा साप्ताहिक।

4. रूपात्मक और Microtumors की प्ररूपी विश्लेषण

  1. मानक रहते सेल धुंधला का उपयोग microtumors में सेल आकृति विज्ञान का निर्धारण करते हैं।
    1. DMSO में Calcein-AM के 1 मिमी स्टॉक तैयार करें। अशेष और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर।
    2. वांछित संस्कृति अंतराल (1, 7, और 14 दिन) में Calcein-AM पीबीएस में 1 माइक्रोन अंतिम एकाग्रता के लिए 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए (सीए / एमजी बिना) तैयार समाधान जोड़ें।
    3. सेतेएक 37 डिग्री सेल्सियस, 5% सीओ 2, humidified इनक्यूबेटर, और छवि 2X, 4X पर एक प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी का उपयोग करने में 20 मिनट, और 10X (उत्तेजना: 450 - 490 एनएम बैंड पास, उत्सर्जन: 515 एनएम लंबे पास, 500 एनएम dichroic) ।
  2. Microtumor विकास / प्रसार परख
    1. (सीए / एमजी के बिना) 12 मिमी स्टॉक तैयार करने के लिए पीबीएस में MTT पाउडर भंग। बाँझ फिल्टर, विभाज्य, और दुकान -20 डिग्री सेल्सियस पर।
    2. वांछित संस्कृति अंतराल (1, 7, और 14 दिन) में प्रति 100 μl संस्कृति मात्रा 96 अच्छी तरह से थाली करने के लिए MTT समाधान के 20 μl जोड़ें। टिशू कल्चर इनक्यूबेटर में 2 घंटा सेते हैं।
    3. 0.01 एम एचसीएल में 10% एसडीएस के ताजा सेल समाधान तैयार है और प्लेटों के लिए संस्कृति मात्रा के बराबर राशि जोड़ें। रात भर 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में बंद प्लेटें सेते हैं।
    4. एक बहु-प्लेट रीडर का उपयोग 570 एनएम पर absorbance पढ़ें।
  3. Kinomic विश्लेषण के लिए Microtumor तैयारी
    1. 100 अनुपात 100x प्रो के प्रत्येक: 4 डिग्री सेल्सियस के लिए पूर्व द्रुतशीतन और फिर एक 1 जोड़कर lysis बफर तैयारTein फॉस्फेट अवरोध करनेवाला (पीपीआई) और 100x प्रोटीन protease अवरोध करनेवाला (पीआई)। अच्छी तरह मिक्स और बर्फ पर रख।
    2. स्थानांतरण तीन 1.5 मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब से प्रत्येक के लिए 2 microtumors। तैरनेवाला निकालें और 4 डिग्री सेल्सियस पर प्रत्येक ट्यूब और 30 मिनट के लिए lyse करने के लिए पल्स पोलियो टीकाकरण और पीआई युक्त lysis बफर के 40 μl जोड़ें।
    3. पिपेट नमूने सख्ती ट्यूमर मोती तोड़ने के लिए। -80 डिग्री सेल्सियस kinomic विश्लेषण जब तक 4 डिग्री सेल्सियस और दुकान के नमूने पर 10 मिनट के लिए 16,000 XG पर अपकेंद्रित्र।

5. Microtumors की Kinomic प्रोफाइलिंग

  1. प्रोटीन tyrosine kinase (PTK) की रूपरेखा
    1. पिघलना अभिकर्मकों (10x प्रोटीन काइनेज (पी) बफर और 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए)) की रूपरेखा पर 4 डिग्री सेल्सियस लोड पी बफर (300 μl 10x पी बफर स्टॉक में 2.7 मिलीलीटर DH 2 हे) सिरिंज में # 2 की स्थिति में करने के लिए मंच।
    2. काइनेज परख सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और PTK प्रोटोकॉल फ़ाइल और प्रेस 'आरंभ' लोड, softw भीतर नमूने व्याख्यास्कैनिंग चिप्स के बाद कार्यक्रम कर रहे हैं। प्रोफाइलिंग मंच और लोड 2% गोजातीय सीरम albumin (बीएसए) के 25 μl सरणी प्रति और फिर पर जगह चिप्स सॉफ्टवेयर नियंत्रित प्रोटोकॉल कदम अवरुद्ध शुरू करने के लिए लोड दबाएँ।
    3. 54 μl DH 2 हे के साथ 100 मिमी एटीपी स्टॉक से 6 माइक्रोन पतला 10 मिमी adenosine triphosphate (एटीपी) बनाने के लिए। सॉफ्टवेयर शुरू होता है जब 3, और अंतिम धोने कदम (स्क्रीन पर दिखाई) लाने lysate के 15 माइक्रोग्राम DH 2 हे के साथ 28 μl तक लाया, मिश्रण और सरणी में जोड़ें।
    4. PTK मास्टर मिश्रण (एम एम) (अप करने के लिए 12 नमूने के लिए) तैयार करें। 32.6 μl DH 2 हे dithiothreitol पुनर्गठित (डीटीटी) और 6 μl डीटीटी, और 60 μl 10x पी समाधान जोड़ने, PTK-MM1 ट्यूब को जोड़ने के लिए (पहले से ही 60 μl 10x बीएसए शामिल हैं)।
    5. जब तक काइनेज परख सॉफ्टवेयर में 'लोड' शीघ्र रुको तो PTK-MM1 के 126 μl, 60 μl PTK additive, और जोड़ने प्रकट होता है 60 μl 10 मिमी एटीपी MM2 करने के लिए (पहले 4.5 μl PY20 FITC एंटीबॉडी aliquoted शामिल हैं) और मिश्रण।प्रत्येक नमूना lysate ट्यूब और पिपेट मिश्रण 5 बार इस PTK मास्टर मिश्रण के 16 μl जोड़ें।
    6. सुनिश्चित कवर कांच साफ है और फिर जोड़ने के 35 μl lysate / सरणी, बंद हिंडोला ढक्कन, और प्रेस लोड बटन प्रति मास्टर मिश्रण।
  2. सेरीन / threonine kinase (STK) रूपरेखा:
    1. पिघलना अभिकर्मकों (10x पी बफर, 10x STK बफर, और 2% बीएसए) 4 डिग्री सेल्सियस के लिए। लोड पी बफर में # सिरिंज स्थिति 1, 1:10 और STK बफर में सिरिंज स्थिति # 2 (2.7 मिलीलीटर DH 2 0 में 300 μl) (2.7 मिलीलीटर DH 2 0 में 300 μl)।
    2. काइनेज परख कंप्यूटर सॉफ्टवेयर प्रोग्राम खोलें और STK प्रोटोकॉल फ़ाइल और शुरू प्रेस लोड, स्कैनिंग चिप्स के बाद कार्यक्रम के भीतर नमूने व्याख्या। प्रोफाइलिंग मंच और लोड सरणी प्रति 2% BSA के 25 μl, और फिर सॉफ्टवेयर नियंत्रित प्रोटोकॉल अवरुद्ध कदम शुरू करने के लिए लोड प्रेस पर जगह चिप्स।
    3. 54 μl DH 2 ओ के साथ 100 मिमी एटीपी के 6 माइक्रोन पतला अंतिम (3) धोने कदम मिश्रण के दौरानLysate के 2 माइक्रोग्राम और DH 2 हे के साथ 32.6 μl अप करने के लिए लाने के लिए, मिश्रण और सरणी में जोड़ें।
    4. बनाओ STK मास्टर मिश्रण: STK-MM1 ट्यूब के लिए 70 μl 10x पीके जोड़ें (7 μl 100x बीएसए शामिल है), और फिर STK-MM1 ट्यूब के लिए 42 μl DH 2 हे जोड़ें।
    5. जब तक काइनेज परख सॉफ्टवेयर में 'लोड' शीघ्र प्रतीक्षा करें तो: STK-MM1 के लिए 18 μl 10 मिमी एटीपी जोड़ें, और प्रत्येक नमूना lysate के लिए 9 μl MM1 जोड़ें। अच्छी तरह मिलाएं।
    6. सुनिश्चित कवर कांच साफ है और जोड़ने के 35 μl lysate / सरणी, बंद हिंडोला ढक्कन, और प्रेस लोड प्रति मास्टर मिश्रण।
    7. के दौरान अंतिम (3) धोने कदम DMAB ट्यूब के लिए 1.05 μl STK-FITC माध्यमिक एंटीबॉडी जोड़ने (3.03 μl STK प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण होता है), DMAB 39.6 μl एबी बफर जोड़ने के लिए, जोड़ने 356.0 μl DH 2 हे DMAB करने के लिए, प्रत्येक सरणी के लिए DMAB के लिए 30 μl जोड़ने के लिए, और प्रेस लोड ।
  3. Kinomic डेटा के विश्लेषण से 19,20
    1. ओपन विश्लेषण सॉफ्टवेयर और छवि विश्लेषण अनुप्रयोग लोड। Select की छवि PTK या STK डेटा, का चयन आलेख संख्या का मिलान नहीं हुआ सरणी लेआउट फ़ाइल (PTK के लिए 86312 और 87102 STK के लिए) के लिए बारकोड और समय की मुहर लगी पूरी सरणी छवियों वाले फ़ोल्डर, और लोड पहले से सरणी एनोटेशन फ़ाइल उत्पन्न।
    2. सभी छवियों का सही gridding जाँच करें, और अनुप्रयोग स्केलिंग एक्सपोजर समय चला रहे हैं। सांख्यिकीय जोखिम / ढलान log2 तब्दील मूल्यों की तुलना, और prewash गतिज घटता 19-21 के साथ मान्य।
    3. नदी के ऊपर kinases 22,23 के लिए परिस्थितियों के बीच बदल kinomic प्रोफाइल क्वेरी करने के लिए नदी के ऊपर काइनेज भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर चलाते हैं।

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Representative Results

हम पता चला 3D biogel संस्कृति प्रणाली लंबी अवधि के विकास और अनेक प्रकार की कोशिकाओं के समारोह का समर्थन करता है। इस सहयोगी परियोजना में, रोगी व्युत्पन्न जीबीएम xenolines (PDX) microtumors के सैकड़ों के उत्पादन के लिए उपयोग किया जाता है। अलग कोशिकाओं (3 x 10 5) या neurospheres (40 - 50) biogel मोती (2 मिमी) में एम्बेडेड थे और जल्दी जमाना बाद वे एक नायब मीडिया भरा कस्टम बायोरिएक्टर में सुसंस्कृत हैं। सेलुलर व्यवहार्यता (Calcein-AM), विकास प्रोफ़ाइल (MTT), और kinomic गतिविधि सरणी आधारित विश्लेषण निर्धारित किया गया है। PDX microtumors> 3 सप्ताह के लिए बहुकोशिकीय संगठन और उच्च व्यवहार्यता (> 80%) बनाए रखा। हम मानते हैं कि यह इन विवो तरह जीव विज्ञान 3 डी सेल मैट्रिक्स वास्तुकला के रखरखाव (2 डी या अंडाकार आकृति संस्कृति के साथ संभव नहीं है) की वजह से है। यह भी देखा गया है कि 3 डी ट्यूमर संभवतः कोलेजन मैं 14 की कमी के कारण, नाजुक पतला प्रोटीन पाड़ के साथ उत्पादन करने के लिए मुश्किल हो जाता है। mic के लिए एक काम कर योजनाrotumor PDX कोशिकाओं और 3 डी biogel प्रणाली का उपयोग कर उत्पादन चित्रा 1 में संक्षेप है और पृथक्करण प्रक्रिया चित्रा 2 में दिखाया गया है।

Calcein-AM के माध्यम से लाइव सेल इमेजिंग के माध्यम से, हम के रूप में प्रतिदीप्ति में कमी के संकेत, कोशिका मृत्यु का संकेत, सेल के विकास और व्यवहार्यता के साथ ही PDX ट्यूमर JX10 से निकाली गई जीबीएम कोशिकाओं पर दवाओं के प्रभाव को निर्धारित की। ट्यूमर के विकास को सतत विकास को प्रदर्शित करने के लिए 14 दिन की microtumors 0, 7 और कम से मापा गया था के रूप में चित्रा 3 ए में दिखाया गया है। इस microtumor, JX10, TMZ के लिए प्रतिरोधी हो जाना जाता है। जब 1 से अवगत कराया - 10 माइक्रोन के TMZ, कम से कम विकास दमन का उल्लेख किया गया था (चित्रा 3 बी)। हालांकि, परीक्षण के PDX ट्यूमर JX12, जो TMZ के प्रति संवेदनशील हो जाता है, 14 दिनों कि Calcein-AM इमेजिंग (चित्रा 4) द्वारा पुष्टि की गई पर MTT परख द्वारा संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया।

er.within-पेज = "1"> दवा प्रतिरोध की क्षमता तंत्र का पता लगाने के लिए आदेश में, हम TMZ प्रतिरोधी microtumors (JX10) में काइनेज सिगनल मापा। 144 tyrosine और 144 सेरीन के लिए Kinomic प्रोफाइल / threonine phosphopeptide लक्ष्यों DMSO के लिए कब्जा कर लिया गया है और 10 माइक्रोन के TMZ microtumors इलाज किया। सभी पेप्टाइड लक्ष्यों के लिए Kinomic फोस्फोराइलेशन तीव्रता, प्रति चक्र, और प्रति एकाधिक जोखिम बार कब्जा कर लिया था (डेटा) नहीं दिखाया। पेप्टाइड्स है कि काफी बदल दिया था 10 माइक्रोन TMZ उपचार के साथ तीव्रता प्रदर्शित एक प्रतिनिधि हीटमैप (पी <0.05, अयुगल छात्रों टी परीक्षण) चित्रा 5 ए में प्रदर्शित किया जाता है। Kinomic प्रोफाइल है कि TMZ में बदल रहे थे इलाज किया JX10 microtumors DMSO (चित्रा 5 ब) के सापेक्ष नमूने अपस्ट्रीम काइनेज भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर है कि पहचान SYK, LCK, और CTK kinases के रूप में TMZ में वृद्धि का उपयोग कर इलाज विश्लेषण किया गया। सेरीन / threonine kinome अपस्ट्रीम काइनेज विश्लेषण भी (चित्रा 5C) का प्रदर्शन किया गया था।

सामग्री "के लिए: रखने together.within-पेज =" 1 "> आकृति 1
चित्रा 1:। Microtumor उत्पादन जीबीएम-PDX ट्यूमर के लिए कार्य योजना murine मेजबान से अलग कर रहे हैं, और एकल कक्षों biogel मैट्रिक्स में एम्बेडेड रहे हैं microtumors के रूप में। विश्लेषण तो microtumors पर प्रदर्शन कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। PDX ट्यूमर कोशिकाओं की हदबंदी ट्यूमर मेजबान चूहों से हटा दिया है और एंजाइम समाधान (एजी) के साथ मिश्रण से पहले कीमा बनाया जाता है। हदबंदी 40 मिनट (एच) के बाद दिखाया गया है। ट्यूमर कोशिका dissociator दिखाया गया है (मैं)। मीडिया और निस्पंदन (जे एन) में Trituration एक अंत resu के साथ दिखाया गया है0.3 मिलीलीटर गोली (ओ) 24 घंटा (क्यू) में NBM में 29.5 x 10 6 व्यवहार्य कोशिकाओं (पी) कि फार्म spheroids युक्त एलटी। स्केल बार 20 माइक्रोन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3:। Microtumors JX10 microtumor विकास की ग्रोथ 14 दिनों में MTT और छवियों प्रतिनिधि के ऑप्टिकल घनत्व (ओवर ड्राफ्ट) द्वारा मापा जाता है, दोनों basally (ए), और 1-10 माइक्रोन के TMZ उपचार (बी) के जवाब में। छवियाँ 4X बढ़ाई (पैमाने बार = 500 माइक्रोन) पर दिखाया गया है। मानक विचलन का संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें। चित्रा 4
चित्रा 4:। Microtumors JX12 microtumor विकास की ग्रोथ 14 दिनों में MTT और छवियों प्रतिनिधि के आयुध डिपो से मापा जाता है, दोनों basally दिवस (1), और 0, 1, या 10 माइक्रोन के TMZ उपचार (पैमाने बार = 500 माइक्रोन) के जवाब में। मानक विचलन का संकेत दिया। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 5
चित्रा 5: TMZ के Kinomic प्रोफाइल इलाज Microtumors जोखिम से एकीकृत मूल्यों का हीटमैप (log2 तब्दील ढलानों (x 100) 10, 20, 50, 100, और 200 एमएस मंझला संकेत शून्य पृष्ठभूमि जोखिम मूल्यों का) काफी TMZ-बदल के लिए प्रदर्शित कर रहे हैं। बदल पेप्टाइड्स (पी <0.05)। लाल वृद्धि हुई इंगित करता है, और नीले रंग DMSO के सापेक्ष कमी आई है इंगित करता है पेप्टाइड प्रति मतलब है। TMZ बदल प्रोफाइल अपस्ट्रीम काइनेज भविष्यवाणी सॉफ्टवेयर और बदल kinases का उपयोग कर की तुलना में थे। सामान्यीकृत Kinase आँकड़ा (NKS) स्कोर> 1.0 और विशिष्टता स्कोर> 1.3 (लाल) अत्यधिक बदल माना जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम मुख्य रूप से पीढ़ी है, साथ ही दवा खुराक और रखरखाव microtumor से संबंधित हैं। क्योंकि microtumor मोती नाजुक और आसानी से फाड़ रहे हैं, अत्यधिक ध्यान दोनों एक परख और रखरखाव के विकास के चरणों में की जरूरत है। इन प्रक्रियाओं के दोनों दौरान कोई त्रुटि होती है, प्रयोगात्मक व्याख्या समझौता किया जा सकता, विस्तार या प्रयोगों के अनावश्यक पुनरावृत्ति या डेटा का भी बहिष्कार के कारण।

संशोधन और निवारण microtumor विकास की प्रक्रिया के लिए विशेष रूप से डिजाइन और microtumor मोती बनाने के उपयोग के लिए एक कस्टम हाइड्रोफोबिक उपकरण का उत्पादन भी शामिल है। यह उपकरण तेजी से और अधिक सटीक microtumors के उत्पादन के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, microtumors के रखरखाव के लिए छोटे संशोधनों मध्यम बदल रहा है और कोशिकाओं खुराक की प्रक्रिया में तेजी लाने में मदद की। इन संशोधनों के कई शामिल हैं, लेकिन तक सीमित नहीं थे, एक का उपयोग कर मल्टीचैनलहटाने और 96 अच्छी तरह प्लेटें और से मध्यम जगह के लिए इलेक्ट्रॉनिक पिपेट पूर्व मिश्रण ताजा दवा खुराक समाधान और एक इसी 2 मिलीलीटर 96 अच्छी तरह से थाली में 2x समाधान की व्यवस्था।

3 डी मॉडलिंग में संस्कृति की स्थिति के लिए मेजर अनुकूलन, दवा यौगिकों के लिए उचित मात्रा का निर्धारण भी शामिल है के रूप में वहाँ 2 डी और 3 डी मॉडलिंग मॉडलिंग के बीच एक गरीब रिश्ता नहीं है। इसलिए, धारावाहिक dilutions की स्थापना के लिए एक खुराक अनुमापन वक्र अक्सर 3 डी microtumor मॉडल के लिए एक 2 डी मॉडल प्रणाली जाने के लिए आवश्यक है।

संभावित मुद्दों के लिए एक माउस से काटा xenoline ट्यूमर कोशिकाओं से microtumor पीढ़ी के साथ विचार करने के लिए बैक्टीरियल या फंगल संक्रमण, प्राथमिक xenolines के असंगत उपलब्धता, के रूप में चूहों में अद्वितीय विकास गुण अलग dissociations से सेल पैदावार में फसल समय और विचरण में मतभेद उत्पन्न कर सकते हैं शामिल हैं। प्रत्येक कोशिका लाइन, प्राप्त कोशिकाओं की संख्या, और इसी तरह, कितने microtumors उत्पादन किया जा सकता वाई के साथभिन्न हो जाएगा। जैसे, प्राथमिकता करने के लिए जो assays के लिए आवश्यक हैं और जो लोग "वैकल्पिक" microtumor उपज अपर्याप्त होना चाहिए रहे हैं की जरूरत है। नमूने के रूप में चुना गया बीसीए प्रोटीन का स्तर, कि biogel आधारित प्रोटीन (ईसीएम प्रोटीन) और के उन लोगों के बीच भेद नहीं कर सकते हैं के लिए सही करने के लिए एक तरह से भरी हुई हैं microtumors की kinomic रूपरेखा के साथ संभावित सीमाएं, अक्रिय प्रोटीन सामग्री लोड करने के लिए सही करने में कठिनाई शामिल सेलुलर काइनेज घटक है कि इरादा है मापा जाएगा। सकल microtumor जन की मापने Calcein-AM के माध्यम से, या एक सुधार कारक इस को कम कर सकते हैं के रूप में एक हाउसकीपिंग प्रोटीन का उपयोग, हालांकि ट्यूमर में गृह व्यवस्था प्रोटीन के स्तर के साथ मुद्दों पर इस उलझाना सकता है परिवर्तित किया जा रहा। थोड़े समय के पाठ्यक्रम प्रयोगों संकेत, यह मानते हुए समान रूप से आकार (लाइव सेल नंबर युक्त काइनेज) और इलाज बनती है और इलाज के नमूने लिए, इस एक मुद्दे के कम है।

इस अनुसंधान के साथ, लक्ष्य एक और अधिक लागत ई प्रदान करने के लिए हैओर्थोटोपिक रोगी व्युत्पन्न xenografts की तुलना में सटीक दवा चिकित्सा परीक्षण के लिए ffective और रोग-प्रतिनिधि preclinical मॉडल, जीबीएम के परीक्षण के लिए वर्तमान सोने के मानक मॉडल। हाल के वर्षों में, कई समूहों दवा परीक्षण प्रयोजनों के लिए इन विवो जीबीएम पर्यावरण मॉडल करने के लिए प्रयास किया है। कुछ समूहों बस में कम से कम ब्रेन ट्यूमर की शुरुआत कोशिकाओं (BTIC) 24,25 जीबीएम स्टेम कोशिकाओं को संरक्षित करने के लिए गैर फर्क परिस्थितियों में जीबीएम ट्यूमर कोशिकाओं को विकसित करने की कोशिश की है या। ये tumorsphere या neurosphere संस्कृतियों दवा के परीक्षण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और संभावना पारंपरिक मॉडल से बेहतर हैं। हालांकि, बाद से वे अभी भी ट्यूमर स्ट्रोमा परस्पर क्रिया है कि हमारे microtumor मॉडल में संरक्षित है की कमी है, tumorsphere दृष्टिकोण अभी भी सीमित है। अन्य समूहों जीबीएम मॉडल 26-28 सुधार करने के लिए इंजीनियरिंग के सिद्धांतों को लागू करने की कोशिश की है। इन तरीकों प्रवाह कक्षों, चर ईसीएम प्रोटीन और ट्यूमर सेल / सामान्य सेल मिश्रण को शामिल किया है। जबकि होनहार इन रेपो के लगभग सभीआरटीएस निरंतर पहले उल्लेख के साथ अमर कोशिकाओं लाइनों का इस्तेमाल किया है। जैसे, हम मानते हैं कि PDX-आधारित microtumor मॉडल यहाँ वर्णित अधिक चिकित्सकीय प्रासंगिक है।

भविष्य में, microtumor मॉडल या तो एक सच्चे ट्यूमर अवतार या एक 'proband' प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है। proband प्रणाली के साथ, PDX सीधे, कि विशिष्ट रोगी की चिकित्सा के बारे में चिकित्सक को सूचित नहीं करता ट्यूमर अवतार प्रणाली के साथ के रूप में एक विशेष रोगी से विकसित की है। इसके बजाय, एक मरीज ​​के ट्यूमर एक पूर्व मौजूदा, अच्छी तरह से विशेषता (दोनों molecularly और phenotypically) PDX 29 "मिलान" है। दरअसल, इस मॉडल एक 'जाने के लिए' अवतार के रूप में सेवा करते हैं या एक तुलनात्मक प्रोफ़ाइल के रूप में एक proband पुस्तकालय में निवास कर सकता है। पारंपरिक बदलते रूपों के साथ, रोगी के इलाज के लिए समानांतर में चूहों में एक मरीज की ट्यूमर कोशिकाओं से बढ़ ही नहीं, समय लेने वाली है, के रूप में यह प्राथमिक पारित होने के लिए कई महीने लग सकते हैं, लेकिन यह भी महंगा है कई डी परीक्षण के रूप मेंचूहों में गलीचा उपचारों एक भारी कीमत उत्पन्न करते हैं। इस लड़ाई, प्राथमिक रोगी ट्यूमर biogel मैट्रिक्स में सीधे प्रत्यारोपित किया जा सकता है। microtumors के साथ, परिणाम जल्दी और एक कम कीमत पर उत्पन्न किया जा सकता है।

एक proband मॉडल के रूप में, microtumor kinome डेटा प्रोफाइल और दवा प्रतिक्रिया विट्रो मॉडल में पिछले 3 डी, मौजूदा PDXs, जानवरों के अध्ययन, अन्य रोगियों, आदि से प्रोफाइल और डेटा के साथ ', पुस्तकालय' एक proband में जोड़ा जा सकता है। सिद्धांत रूप में, मरीज ​​के ट्यूमर कोशिकाओं तो सबसे अच्छा संभव परिणाम के लिए सही उपचार का निर्धारण करने के लिए हो सकता है 'omically' (genomically, kinomically, transcriptomically, आदि) एक समान मौजूदा microtumor प्रोफ़ाइल करने के लिए मिलान।

सारांश: यहाँ हम पहचान है कि इन microtumor मॉडल दोनों प्ररूपी विकास को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है और दोनों बेसल काइनेज गतिविधि के स्तर पर और नशीली दवाओं के उपचार के लिए प्रतिक्रिया है कि उपयोगी हो सकता है में पूछे जा सकते हैंआगे preclinical अनुसंधान के लिए एक उपकरण के रूप में translational। मानव ट्यूमर के लिए सही है, और molecularly वैध परीक्षण योग्य मॉडल के विकास के लिए प्रभावी दवा के विकास के लिए जरूरी है।

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Acknowledgments

, ब्रेन ट्यूमर बीजाणु पुरस्कार (पीडी: GY गिलेस्पी, P20CA 151129-03) और एसबीआईआर अनुबंध (पीआई: आर सिंह, N43CO-2013-00026): एनआईएच R21 अनुदान (सी विले, CA185712-01 पीआई) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10x) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/ml final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/ml final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 µg/ml final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/ml final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10x BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100x BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100 mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50 ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 ml disposable HARV

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References

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चिकित्सा अंक 112 रोगी व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट मानव biogel microtumors ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी 3 डी संस्कृति प्रणाली kinomics neurospheres
Microtumors 3 डी मानव Biogel संस्कृति प्रणाली का प्रयोग और Kinomic रूपरेखा और दवा प्रतिक्रिया परीक्षण के लिए रोगी व्युत्पन्न ग्लयोब्लास्टोमा कोशिकाओं की पीढ़ी
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Gilbert, A. N., Shevin, R. S.,… More

Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

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