Introduction
De vanligaste primära intrakraniella elakartade hjärntumörer är grad III astrocytom och grad IV glioblastoma multiforme (glioblastom eller GBM). Dessa tumörer har dålig prognos med median ettårsöverlevnad mellan 12 - 15 månader med nuvarande terapier för GBM i USA 1-3. Multimodalitet behandlingar inkluderar kirurgi, strålning och kemoterapi inklusive temozolomid (TMZ) och kinasinriktade medel. Kinassignalerings ofta dysreglerad i GBM, inklusive undergrupper av tumörer med amplifiering eller aktiverande mutationer i den epidermala tillväxtfaktorreceptorn (EGFR), ökningar i Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) signalering, ökade fosfatidyl-inositol-3-kinas (PI3K) och tumör stödja angiogena signalering genom Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) såväl som andra kinas drivna banor 4-6. Ström in vitro- och in vivo-modeller förlorar ofta dessa representativa förändringar <sup> 7. Dessutom har genetisk profilering erbjuds inte de förväntade fördelarna som kan återspegla det faktum att genetiska och epigenetiska förändringar inte alltid förutsäga förändringar i nivå med proteinaktivitet, där de flesta kinasmålsökande medel verkar direkt, och där behandlingar med andra verkningsmekanismer kan fungera indirekt.
Den traditionella immortaliserad cellinje som kan passe det oändliga har länge varit standard för drogtestning på grund av att de är lätta att underhåll och reproducerbarhet. Men lider denna modell från en hög näringsämne (och artificiell) tillväxtmiljö som väljer för snabbväxande celler som skiljer sig avsevärt från den ursprungliga tumören. Som sådan, har det funnits ett stort intresse för att utveckla mer realistiska modellsystem som återspeglar en mer komplex tumör biologiskt system som är närvarande i patienten. Tumörxenografter utvecklats direkt från en primärtumör odlad i möss ( "xenoline," patient-derived xenotransplantat eller PDX) bestämde en mer reflekterande modellsystem, särskilt i fastställandet av cancerterapi, eftersom de upplevs mer tillförlitligt förutsäga klinisk framgång. 8 Trots mer reflekterande biologi, dessa modeller är dyra och svåra att införa och upprätthålla. Dessutom är de inte mottagliga för hög genomströmning studier. Behovet av att bättre utveckla biologiska modeller som mer exakt speglar molekylära förändringar i de primära tumörer och att profilera och testa dessa modeller med hjälp av direkta åtgärder av kinasaktivitet, inte surrogat genetiska markörer, är tydlig.
Det är väl känt att 3D eller flercelliga analysmodeller till skillnad från två-dimensionella (2D) monolagerkulturer kan ge mer fysiologiskt relevanta endpoints 9-11. Gemensam 3D kultur närmar innebär matrisbelagda mikrobärare och cell sfäroid formation. Tumör sfäroider kan genereras via cellulär aggregering med hjälp av spinnkolv, PHEMA plattan och droppe tekniker. Begränsningar för tessa strategier inkluderar: oförmåga för vissa celler att bilda stabila sfäroider variationer i tillväxt och utmaningar med blandade celltyper. Alternativt, många syntetiska (hydrogel, polymer) och djur-härledda Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matris från mus sarkom, bovint kollagen) matriser har utvecklats för 3D kulturstudier 12-14. Mus EHS matris används flitigt men känt för att gynna celltillväxt och differentiering in vitro och in vivo 15.
För att replikera 3D tumörbiologi, var en människa biomatris system som utvecklats av Dr. Raj Singh et al. 16. Den naturliga, tillväxtfaktor-fri människa Biogel tillåter 3D kultur ställningar (pärlor, skivor), som stöder långsiktig odling av flera celltyper. En serie av 3D mänsklig Biogel kultur mönster etableras för att studera tumörtillväxt, adhesion, angiogenes och invasion egenskaper. Fördelar och egenskaper hos mänskliga Biogel jämfört med vanligtmus EHS-geler är sammanfattade i Tabell 1 och Tabell 2.
| Källa: | Human Amnions (poolade vävnad) Patogenfria, IRB-befriad / godkänd |
| ECM natur: | Icke-denaturerad Biogel (GLP-produktion) |
| Nyckel Komponenter: | Col-I (38%), laminin (22%), col-IV (20%), col-III (7%), entaktin & HSPG (<3%) |
| GF-free: | Oidentifierbart EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (icke-angiogena, Giftfri) |
Tabell 1: Egenskaper för Human Biogel Jämfört med vanliga EHS Gel.
| human Biogel | EHS-geler |
| Naturlig mänsklig matris | Rekonstituerade matrisen mus |
| Kontrollerad celltillväxt och differentiering | Kan främja celltillväxt och differentiering |
| Fysiologisk genuttryck | Variabel genuttryck |
| 3D vävnadsliknande odlingsmodell | Plattbaserad odlingsmodell |
Tabell 2: Fördelar med Human Biogel Jämfört med vanliga EHS Gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla xenograft terapi utvärderingar gjordes med hjälp av en orthotopic tumör modell för glioblastom på ett protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén.
1. Isolering av patientgenererade GBM xenotransplantat Cells
- Beredning av reagenser
- Åter utgör kollagenas-I i sterilt vatten till en koncentration av 5 mg / ml och sterilfilter. Butik i 1 ml alikvoter vid -20 ° C (slutlig koncentration är 50 | j, g / ml i 100 ml enzymlösning).
- Lös 100 pg epidermal tillväxtfaktor (EGF) i 2 ml steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Butik i 100 | j, l (5 | j, g / 100 | il) alikvoter vid -20 ° C för en slutkoncentration av 10 ng / ml.
- Lös 100 pg FGF-β i 2 ml steril PBS. Butik i 100 | j, l (5 | j, g / 100 | il) alikvoter vid -20 ° C för en slutkoncentration av 10 ng / ml.
- Lägg till följande till en 500 ml flaska Neurobasal Media (NBM) att förbereda komplett NBM: 10 ml B-27 tillskott utan vitamin A, 5 ml N2 supplement, 100 ^ EGF, 100 pl fibroblasttillväxtfaktor (FGF) -Grundläggande, 5 ml amfotericin B, 0,5 ml gentamycin, 5 ml L-glutamin.
- Bered färsk enzymlösning genom att kombinera: 98,5 ml PBS, 1 ml kollagenas-1, 0,5 ml 10x trypsin / EDTA och sterilisera genom filtrering genom 0,22 um porstorlek filter.
- Förbereda eller erhålla en liten volym sterilt Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM) / F12 cellkulturmedium med 7% fetalt bovint serum (FBS) och 1 x PBS utan kalcium eller magnesium.
- tumör Disaggregering
OBS: Atymiska nu / nu-mus som tidigare injicerats med tumörceller i den högra flanken och tillåts från en palpabel tumörmassa är nödvändig för detta förfarande. I exemplen som visas här, använde vi patientgenererade xenograft GBM-celler, JX10 och JX12 17.- Sterilisera arbetsområdet genom att spraya 2% klorhexidin och ställa in arbetsområdet with nödvändiga instrumenten / förnödenheter inklusive engångs chuck, pincett, skalpell, glas petriskål, enzymlösningen, PBS, och klorhexidin (se figur 2A).
- Avliva mus / möss som härbärgerar en flank tumör. Sikta på en / min förflyttningshastighet 20% av CO 2 med användning av 30% CO2. Efter musen visar andningsstillestånd, underhålla CO2 flöde under ca 1 min (typiskt 3 min totalt). Möss avlägsnas från kammaren och halsdislokation utförs som en sekundär dödshjälp bekräftelse. Spraya djuret med 3% klorhexidin att sanera huden.
- Håll musen stadig, göra halvcirkelformad hudsnitt ~ 1,5 cm från tumörmassa (flank implanterad tumör) med hjälp av en steril engångs skalpell med # 11 blad börjar hjärn till tumörmassan och incising mot magen av musen och runt till caudal ände.
- Reflektera huden över tumörmassan med fingrarna med mild grepp på svans änden av snittet och tryck sedan på hudenytan för att höja tumör att ha bästa tillgång utan att röra tumören (se figur 2B).
- Använd trubbig dissektion med pincett för att försiktigt fri tumörmassan från peritoneal väggen och från huden (se figur 2C).
- Transfer tumörmassan med pincett till steril glaspetriskål (ANVÄND INTE plastskålar för att förhindra att bryta under mals) och riktigt kassera stommen och placera dessa instrument åt sidan.
- Använd ny uppsättning av sterila instrument (skalpell med # 11 blad, halv böjda pincett) att debridera tumörvävnad av nekrotisk vävnad och membran värd bindväv som täcker tumören.
- Placera 15 ml enzymlösning i en steril ventilerad-trypsinizing kolv med omrörare och börja röra långsamt i huven.
- I en steril glaspetriskål, tvätta skördade tumörer 3 - 5 gånger med steril PBS för att avlägsna överskott av blod (kan hälla eller använd spruta för att skölja dem med PBS). luta försiktigt skålen och pipett eller aspirera tvätt material. mince finely med två # 11 skalpellblad (se figur 2D).
- Lägg 14 ml enzymlösning till malet tumör och pipett försiktigt upp och ned 2 - 3 gånger. Transfer blandningen till ventilerad-trypsinizing kolv och rör långsamt under 20 minuter. Förbereda 5 50 ml koniska rör genom tillsats av 1,5 ml FBS till varje för att neutralisera trypsinet i steg 1.2.11.
- Efter 20 min, samla 14 ml cell lösning från trypsinizing kolv och tillsätt till ett rör med FBS. Lägga 14 ml färsk enzymlösning till kolv och fortsätt omröring.
- Centrifugera uppsamlades cellerna vid 150 xg under 8 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Lägg 45 ml komplett NBM till pellets, blanda försiktigt och upprepa centrifugering för att skölja ur serum. Återsuspendera pelleten i 5 ml komplett NBM och hålla på is.
- Upprepa cell skörd steg för totalt 5 skördar, som kombinerar alla skördade-celler i en enda koniskt rör på is.
- Placera en 40 ìm cell sil på toppen av en 50 ml koniska rör. prep than cell sil genom att leda 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS genom och därefter tvättning med 10 ml PBS.
- Tillsätt långsamt cellsuspension till sil, så att den kan droppa igenom (Se Figur 2 M). Lyft försiktigt fliken på cellfilter mellan varje nytt tillägg för att bryta någon vakuum och låta de suspenderade cellerna att passera fritt (se figur 2 N).
- Centrifugera den filtrerade cellsuspensionen som ovan. Återsuspendera i 10 ml komplett NBM och räkna för att bestämma totala antalet livskraftiga celler med användning av 0,04% trypanblått och en hemocytometer. Håll celler på is tills microtumor generation.
2. Alternate Tissue Uppdelnings Protocol
- Automatiserad vävnads dissociator och uppdelning systemet.
- Placera uppdelning röret i den cellulära dissociator väljer tryck på start programmet "Tumör _02_02" och och kör för 32 sek. Överföringsröret till rotator, placera i 37 ° C inkubator i 40 min.
- Centrifug suspenderades-cellerna vid 150 xg under 8 minuter vid rumstemperatur och kassera supernatanten. Medan centrifugering av cellerna, inrätta reagens för behandling av cellsuspensionen. Tillsätt 10 ml serumfritt NBM och försiktigt finfördela suspension.
- Efter centrifugering, erhålla en cellpellet innehållande ~ 10 - 30 x 10 6 levande celler (~ 0,3 ml). Återsuspenderades pelleten i 10 ml serumfritt NBM (se figur 2O). Bestäm livsdugliga celler genom uteslutningsanalys (se steg 3.2.2).
3. Microtumor Generation
- Beredning av reagenser
- Förbered komplett NBM som i 1.1.4 och förbereda neutraliserade High Density mänsklig Biogel (HuBiogel) (HDHG vid 3 mg / ml) per internt protokoll. Liknande Biogel matriser kan användas också.
- Microtumor Produktion och kultur
- Skaffa nyligen dissocierade PDX celler som enda cell suspension i fullständig NBM, på is.
- Blanda cellen SUspension med en lika stor volym av lösning av trypanblått (0,4% i PBS) och analysera med användning av hemacytometer för att bestämma antalet celler och livsduglighet genom trypan blå exklusion 18. Ta bort volym som behövs för att generera 50.000 celler / microtumor där volym = (50.000 celler / tumör * # tumörer) / (livsduglig cell räkna / 1 ml) och placera i ett nytt koniskt rör.
- Koncentrera cellerna genom centrifugering vid 150 x g, under 8 minuter, vid rumstemperatur. Kassera supernatanten och resuspendera cellpelleten med iskall HDHG lösning i ett slutligt förhållande av 1 del celler i FBS och 4 delar HDHG.
- Använd en elektronisk multikanalspipett att fördela 10 pl per stift cell HDHG blandningen på en platta med 96 stift stål (med hydrofoba beläggning) för att generera microtumors (2 mm pärlor vardera innehållande 50.000 celler).
- Placera 3D tumör pärlor inuti vävnadsodlingsinkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktad) under 15 minuter för att gelatinera pärlorna.
- Efter gelning, överföra microtumors (10 μ; L) till en anpassad suspensionsodlingskammare (50 ml) eller stor volym odlingsskål (10 cm) innehåller fullständiga NBM hjälp av det elektroniska multikanalpipett och anpassade pin-enhet.
- Efter 1 - 2 dagar i vävnadskultur inkubator överföra microtumors till 96-brunnsodlingsplattor innehållande 50 ^ NBM / brunn med hjälp av en bred mun dispense pipett och utför olika analys och analysprotokoll.
- Läkemedelsbehandling och underhåll av microtumors
- Välj slutkoncentrationer för drogtestning.
OBS: Om läkemedlet har känt effekt i 2D kultur väljer 2x IC 50 som mellan koncentration dosen och välj 3-faldiga serieutspädningar över och under för totalt 5 dosnivåer. Till exempel, om IC 50 är 9 | iM för läkemedlet i 2D kultur, väljer 2 pM, 6 pM, 18 pM, 54 pM och 162 pM som slutlig koncentration för drogtestning. - Förbered 2x läkemedelsdosering lösning i fullständig NBM från dimetyl sulfoxide (DMSO) lager. Späd doseringslösning i 1% DMSO medium för att framställa en 5 dos, 3-faldig seriespädning.
- Tillsätt 50 pl av doseringslösning till microtumor brunn innehållande 50 pl i analysplattorna för att uppnå en slutlig DMSO-koncentration av 0,5%. Upprepa för varje replikat (t.ex. 4) vid varje läkemedelsdos som fastställts i 3.3.1.
- Bibehålla kulturer i 37 ° C, 5% CO2, fuktad vävnadskulturinkubator för 1 - 14 dagar. Foderkulturer två gånger i veckan genom att uppdatera media och läkemedelslösning som ovan.
- Välj slutkoncentrationer för drogtestning.
4. morfologisk och fenotypisk analys av Microtumors
- Bestäm cellmorfologin i microtumors med standard levande cell färgning.
- Förbered en mM lager av kalcein-AM i DMSO. Alikvot och förvara vid -20 ° C.
- Vid önskade odlings intervall (1, 7, och 14 dagar), tillsätt Calcein-AM-lösning framställd i PBS (utan Ca / Mg) till 96-brunnar för 1 ^ M slutlig koncentration.
- inkubera20 min i en 37 ° C, 5% CO2, fuktad inkubator, och bilden med ett fluorescensmikroskop på 2X, 4X och 10X (excitation: 450-490 nm bandpass, emission: 515 nm lång passning, dikroiskt 500 nm) .
- Microtumor Tillväxt / proliferationsanalys
- Lös MTT pulver i PBS (utan Ca / Mg) för att framställa 12 mM lager. Sterilt filter, delprov och förvara vid -20 ° C.
- Vid önskade odlings intervall (1, 7 och 14 dagar), tillsätt 20 pl MTT-lösning till 96-brunnars platta per 100 | il odlingsvolym. Inkubera 2 timmar i vävnadskultur inkubator.
- Framställ färsk lys lösning av 10% SDS i 0,01 M HCl och tillsätt lika mycket till odlingsvolymen till plattor. Inkubera förseglade plattorna över natten i 37 ° C inkubator.
- Läs absorbans vid 570 nm med användning av en multi-plattläsare.
- Microtumor Förberedelse för Kinomic Analys
- Förbereda lysbuffert genom för-kylning till 4 ° C och därefter tillsats av en 1: 100-förhållande var och en av 100x Protein fosfatasinhibitor (PPI) och 100x Protein proteashämmare (PI). Blanda väl och hålla på is.
- Överföring 2 microtumors till var och en av tre 1,5 ml mikrocentrifugrör. Avlägsna supernatanten och tillsätt 40 pl lysbuffert innehållande PPI och PI till varje rör och lyserar under 30 min vid 4 ° C.
- Pipette prover kraftfullt för att bryta tumör pärlor. Centrifugera vid 16.000 xg under 10 min vid 4 ° C och lagra proverna vid -80 ° C tills kinomic analys.
5. Kinomic Profilering av Microtumors
- Proteintyrosinkinas (PTK) profilering
- Tina reagens (10x proteinkinas (PK) buffert och 2% bovinserumalbumin (BSA)) till 4 ° C Last PK buffert (300 pl 10x PK buffertlager i 2,7 ml dH 2 O) i sprutan i position # 2 på profilering plattform.
- Öppna kinasanalys programvara och ladda PTK protokollfilen och tryck på "START", kommenteringen prover inom prog.uppdär programmet efter scanning chips. Placera marker Onto profilering plattform och belastning 25 | il av 2% bovint serumalbumin (BSA) per matris och sedan på LOAD för att påbörja programvarustyrt protokoll blockeringssteg.
- Späd 6 iM 100 mM ATP lager med 54 pl dH 2 O för att göra 10 mM adenosintrifosfat (ATP). När programmet börjar den 3: e och sista tvättsteget (synlig på skärmen) ta 15 mikrogram av lysat växte upp till 28 pl med dH 2 O, blanda och lägg till matris.
- Förbered PTK Master Mix (MM) (för upp till 12 prover). Lägga 32,6 pl dH 2 O för att rekonstituera ditiotreitol (DTT) och tillsätt 6 pl DTT och 60 pl 10x PK lösning, för att PTK-MM1 rör (redan innehåller 60 | j, l 10x BSA).
- Vänta tills "Load" prompt i kinasanalys programvara visas sedan lägga 126 pl PTK-MM1, 60 pl PTK tillsats, och 60 pl 10 mM ATP till MM2 (innehåller tidigare alikvoteras 4,5 l PY20 FITC antikropp) och blanda.Lägg 16 pl av denna PTK Master Mix till varje prov lysat rör och pipetten mix 5 gånger.
- Se till täckglaset är ren och sedan lägga till 35 l lysat / Master Mix per array, nära karusell lock och tryck knappen LOAD.
- Serin / treonin kinas (STK) profilering:
- Tina reagens (10x PK buffert, 10x STK buffert, och 2% BSA) till 4 ° C. Last PK buffert (300 pl i 2,7 ml dH 2 0) i sprutan läge # 1, 01:10 och STK buffert (300 pl i 2,7 ml dH 2 0) i sprutan läge # 2.
- Öppna kinasanalys datorprogram och ladda STK protokollfilen och tryck på START, kommenteringen prover inom programmet efter scanning chips. Placera marker på profilering plattform och lasten 25 pl 2% BSA per matris och tryck LOAD att börja mjukvarustyrd protokoll blockeringssteg.
- Späd 6 iM av 100 mM ATP med 54 pl dH 2 O. Under sista (3: e) tvättsteg mix2 ug av lysat och ta upp till 32,6 l med dH 2 O, blanda och lägg till matris.
- Gör STK Master Mix: Tillsätt 70 l 10x PK till STK-MM1 röret (innehåller 7 pl 100x BSA), och sedan lägga till 42 l dH 2 O till STK-MM1 rör.
- Vänta tills "Load" prompt i kinasanalys programvara sedan: Lägg 18 pl 10 mM ATP till STK-MM1, och tillsätt 9 pl MM1 till varje prov lysat. Blanda väl.
- Se till täckglaset är rent och tillsätt 35 pl lysat / Master Mix per array, nära karusell lock och tryck LOAD.
- Under den slutliga (3 rd) Tvätta Steg lägga till 1,05 l STK-FITC sekundär antikropp till DMAB röret (innehåller 3,03 l STK primära antikroppen mix), tillsätt 39,6 l AB buffert till DMAB, tillsätt 356,0 l dH 2 O till DMAB, tillsätt 30 pl till DMAB till varje grupp, och tryck på LOAD .
- Analys av Kinomic Data 19,20
- Öppen analys programvara och ladda bildanalys App. SElect bildmapp som innehåller streckkodade och tidsstämplade hel rad bilder för PTK eller STK uppgifter väljer artikelnummer matchas array layoutfilen (86.312 för PTK och 87102 för STK), och lasten tidigare genererade array anteckning fil.
- Verifiera korrekt gridding av alla bilder, och kör Exponeringstid Skalning App. Statist jämföra exponering / lutnings log2 transformerade värdena och bekräfta med fördisk kinetiska kurvor 19-21.
- Kör uppströms kinas förutsägelse programvara för att söka förändrade kinomic profiler mellan villkoren för uppströms kinaser 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har visat att 3D Biogel kultur Systemet stöder långsiktig tillväxt och funktion av flera celltyper. I detta samarbetsprojekt, är patientgenererade GBM xenolines (PDX) som används för att producera hundratals microtumors. Dissocierade celler (3 x 10 5) eller neurosfärer (40 - 50) inbäddades i Biogel pärlor (2 mm) och efter snabb gelning de odlas i ett NB-medium fyllda anpassade bioreaktor. Cellulär viabilitet (kalcein-AM), tillväxtprofil (MTT), och kinomic aktivitets array baserad analys bestämdes. PDX microtumors hållna multicellulär organisation och hög viabilitet (> 80%) i> 3 veckor. Vi tror att detta in vivo -liknande biologi beror på underhåll av 3D cellmatrixet arkitektur (inte möjligt med 2D eller sfäroid kultur). Det är också observeras att 3D-tumörer är svåra att framställa med bräckliga geléform proteinbyggnadsställning, möjligen på grund av brist på kollagen I 14. En arbetsgrupp system för microtumor produktion med hjälp av PDX celler och 3D Biogel systemet sammanfattas i figur 1 och dissociation processen visas i figur 2.
Genom levande cell imaging via kalcein-AM, bestämde vi celltillväxt och lönsamhet samt effekterna av läkemedel på GBM celler från PDX tumör JX10, vilket indikeras av en minskning av fluorescens, vilket signalerar celldöd. Tumörtillväxt mättes vid dag 0, 7 och 14 för microtumors uppvisar kontinuerlig tillväxt, såsom visas i fig 3A. Detta microtumor, JX10, är känd för att vara resistent mot TMZ. När de exponeras för 1 - 10 pM TMZ ades minimal tillväxthämning observeras (figur 3B). Testning PDX tumör JX12, som är känd för att vara känslig för TMZ visade känsligheten genom MTT-analys på 14 dagar som bekräftades av Calcein-AM avbildning (Figur 4).
er.within-page = "1"> För att undersöka potentiella mekanismer för läkemedelsresistens, mätt vi kinas signalering i TMZ resistenta microtumors (JX10). Kinomic profiler för 144 tyrosin och 144 serin / treonin-fosfopeptiden mål fångades för DMSO och 10 | iM TMZ behandlade microtumors. Kinomic fosforylering intensitet för alla peptid mål per cykel och per flera exponeringstider fångades (data visas ej). Ett representativt heatmap visar peptider som hade signifikant förändrade intensiteter med 10 iM TMZ behandling (p <0,05, oparade studenter t-test) visas i figur 5A. Kinomic profiler som förändrades i TMZ behandlade JX10 microtumors analyserades med hjälp av uppströms kinas förutsägelse programvara som identifierats SYK, LCK och CTK kinaser som ökat i TMZ-behandlade prover i förhållande till DMSO (figur 5B). Serin / treonin kinome uppströms kinas analys genomfördes också (figur 5C).
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1:. Arbetsschema för Microtumor Production GBM-PDX tumörer skiljas från mus värd, och enstaka celler är inbäddade i Biogel matris för att bilda microtumors. Analyser utförs sedan på microtumors. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2:. Dissociation av PDX tumörceller Tumörer avlägsnas från värdmöss och malet före blandning med enzymlösning (AG). Dissociation visas efter 40 min (H). Tumörcell dissociator visas (I). Finfördelning i media och filtrering (JN) visas med en slut Result av 0,3 ml pellet (O) innehållande 29,5 x 10 6 levande celler (P) som bildar sfäroider i NBM i 24 h (Q). Skala bar är 20 nm. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Tillväxt av Microtumors JX10 microtumor tillväxt mättes genom optisk densitet (OD) av MTT och representativa bilder under 14 dagar, både basalt (A), och som svar på 1-10 | iM TMZ behandling (B).. Bilderna visas på 4X förstoring (skala bar = 500 nm). Standardavvikelse anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra. 
Figur 4:. Tillväxt av Microtumors JX12 microtumor tillväxt mättes genom OD av MTT och representativa bilder under 14 dagar, både basalt (Dag 1), och som svar på 0, 1, eller 10 ^ iM TMZ behandling (skala bar = 500 | j, m). Standardavvikelse anges. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kinomic Profiler av TMZ behandlade Microtumors Heatmap av exponeringsintegrerade värdena (log2 transformerade sluttningar (x 100) av 10, 20, 50, 100 och 200 ms median signal minus bakgrundsexponeringsvärden) visas för betydligt TMZ-förändras. förändrade peptiderna (p <0,05). Rött indikerar ökat och blått indikerar minskat i förhållande till DMSO betyda per peptid. TMZ förändrade profiler jämfördes med den uppströms kinas förutsägelse programvara och förändrade kinaser. Normaliserad Kinase Statistik (NKS) poäng> 1,0 och specificitet score> 1,3 (röd) anses mycket förändras. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiska steg i protokollet avser främst att microtumor generation, liksom läkemedelsdosering och underhåll. Eftersom microtumor pärlorna är ömtåliga och lätt sönder, krävs extrem försiktighet i både utvecklingsstadier av en analys och underhåll. Om ett fel inträffar under någon av dessa processer, kan experimentell tolkning äventyras, vilket förlängningen eller onödig upprepning av experimenten eller uteslutning av data.
Modifieringar och felsökning, särskilt när det gäller den microtumor utvecklingsprocessen, ingår design och produktion av en anpassad hydrofob verktyg för användning av göra microtumor pärlor. Detta verktyg möjliggör snabbare och mer exakt tillverkning av microtumors. Dessutom, små modifieringar av underhåll av microtumors bidragit till att påskynda processen att byta medium och dosering cellerna. Flera av dessa modifieringar ingår, men var inte begränsade till, användning av en flerkanaligelektronisk pipett för att ta bort och ersätta mediet från de 96-brunnsplattor och förblandning färska läkemedelsdosering lösningar och ordna 2x lösningar i en motsvarande 2 ml 96-brunnar.
Större optimeringar för odlingsbetingelser i 3D-modellering inkluderar bestämma lämpliga doser för läkemedelssubstanser, eftersom det är en dålig relation mellan 2D modellering och 3D-modellering. Därför, för att serieutspädningar etablera en dostitrering kurva är ofta nödvändigt för att flytta en 2D-modellsystem för att 3D microtumor modellen.
Potentiella problem att tänka på med microtumor generation från xenoline tumörceller skördade från en mus inkluderar bakterie- eller svampskada, inkonsekvent tillgång till primära xenolines, som unika tillväxtegenskaper hos möss kan producera skillnader i skördetid och varians i cellutbyten från separata dissociations. Med varje cellinje, antalet celler emot, och på liknande sätt, hur många microtumors kan produceras will variera. Som sådan, det finns ett behov av att prioritera vilka analyser som krävs och vilka som är "frivilligt" bör microtumor avkastningen vara otillräcklig. Potentiella begränsningar med kinomic profilering av microtumors inkluderar svårigheten att korrigera för inert proteinhaltigt material lastning, eftersom proven laddas på ett sätt att korrigera för BCA bestämdes proteinnivåer, som inte kan särskilja mellan Biogel proteiner (ECM proteiner) och de i cellulär kinas-komponent som är avsedd att mätas. Mätning av brutto microtumor massa via kalcein-AM, eller med hjälp av en hushållning protein som en korrektionsfaktor kan mildra detta, även om problem med hushållning proteinnivåer i tumörer som förändras kan förväxla detta. För korta tidsförlopp signalering experiment, förutsatt lika stora (kinas innehållande levande cell nummer) och parat behandlade och obehandlade prover, är detta ett mindre problem.
Med denna forskning, är målet att ge en mer kostnads effective och sjukdoms representativ preklinisk modell för exakt läkemedelsbehandling testning i jämförelse med orthotopic patientgenererade xenografter, den nuvarande guldstandardmodellen för GBM testning. Under de senaste åren har flera grupper försökt att modellera in vivo-GBM miljö för läkemedelsteständamål. Vissa grupper har helt enkelt försökt att odla GBM tumörceller i icke-differentierande förhållanden för att bevara GBM stamceller eller åtminstone hjärntumör inleda celler (BTIC) 24,25. Dessa tumorsphere eller neurosfärkulturer kan användas för drogtestning och kommer sannolikt överlägsna traditionella modeller. Men eftersom de fortfarande saknar tumör stroma samspel som finns bevarad i vår microtumor modell, tumorsphere tillvägagångssätt är fortfarande begränsad. Andra grupper har försökt att tillämpa tekniska principer för att förbättra GBM modeller 26-28. Dessa metoder har inkluderat flödeskammare, variabla ECM-proteiner och tumörcell / normala cellblandningar. Medan lovande, nästan alla dessa reparts har använt odödliggjorda cellinjer med varningar tidigare nämnda. Som sådan, vi tror att PDX-baserade microtumor modell som beskrivs här är mer kliniskt relevant.
I framtiden skulle microtumor modellen användas som antingen en sann tumör avatar eller en "proband" system. Med proband-systemet, PDX utvecklats från en särskild patient inte direkt informera läkaren om den specifika patientens terapi, såsom med tumören avatar systemet. Istället en patients tumör "matchas" till ett befintligt, väl karakteriserad (både molekylärt och fenotypiskt) PDX 29. I själva verket kan denna modell tjäna som en "gå-till" avatar eller uppehålla sig i ett proband bibliotek som en jämförande profil. Med traditionella avatars, odling av en patients tumörceller i möss parallellt med patientens behandling är inte bara tidskrävande, eftersom det kan ta flera månader för den primära passagen, men också kostsamt, eftersom testning flera dmatta behandlingar hos möss genererar en överväldigande prislapp. För att bekämpa detta kan den primära patienten tumören implanteras direkt in i Biogel matrisen. Med microtumors kan utgången genereras snabbt och till en lägre kostnad.
Som ett proband modell kunde microtumor kinome dataprofilerna och läkemedelssvar tillsättas i ett proband "bibliotek" tillsammans med profiler och data från tidigare 3D in vitro-modeller, befintliga PDXs, djurstudier, andra patienter, osv. I teorin skulle patientens tumörceller då vara "nomiskt" (genomiskt, kinomically, transcriptomically, etc.) matchas till en liknande befintlig microtumor profil för att fastställa korrekt behandling för bästa möjliga resultat.
Sammanfattning: Här identifierar vi att dessa microtumor modeller kan användas för att mäta både fenotypisk tillväxt och man kan söka på både basal kinasaktivitetsnivån och som svar på läkemedelsbehandling som kan vara användbarsom en translationell verktyg för ytterligare preklinisk forskning. Utveckla exakta och molekylärt giltiga testbara modeller för mänskliga tumörer är viktigt för effektiv läkemedelsutveckling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Med stöd av NIH R21 bidrag (PI: C. Willey, CA185712-01), hjärntumör SPORE tilldelning (PD: GY Gillespie, P20CA 151.129 till 03) och SBIR kontrakt (PI: R. Singh, N43CO-2013 till 00.026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
