Introduction
De vanligste primære intrakraniale ondartede hjernesvulster er klasse III astrocytomas og klasse IV glioblastoma multiforme (glioblastom eller GBM). Disse svulstene har dårlige prognoser med median ett-års overlevelse mellom 12 - 15 måneder med dagens terapi for GBM i USA 1-3. Multimodalitet behandlinger inkluderer kirurgi, stråling og kjemoterapi, inkludert temozolomid (TMZ) og kinase-målrettede midler. Kinase signalering blir ofte dysregulerte i GBM, blant annet undersett av tumorer med forsterkning eller aktiverende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), en økning i blodplateavledet vekstfaktor reseptor (PDGFR) signalering, økt Phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) og tumorbærende angiogen signalering gjennom vaskulær endotel vekstfaktor reseptor (VEGFR) så vel som andre kinase drevet veier 4-6. Current in vitro- og in vivo-modeller ofte miste disse representative forandringer <sup> 7. I tillegg har genetisk profilering ikke tilbudt forventede fordeler som kan gjenspeile det faktum at genetiske og epigenetiske endringene ikke alltid forutsi endringer på nivået av protein aktivitet, der de fleste kinase målsøkende midler handle direkte, og hvor behandling med andre virkningsmekanismer kan handle indirekte.
Den tradisjonelle udødeliggjort cellelinje som kan passeres ad infinitum har lenge vært standard for narkotika testing på grunn av deres enkle vedlikehold og reproduserbarhet. Imidlertid lider denne modellen fra et høyt næringsinnhold (og kunstig) vekst miljø som selekterer for hurtigvoksende celler som avviker sterkt fra den opprinnelige tumor. Som sådan, har det vært betydelig interesse for å utvikle mer realistiske modellsystemer som reflekterer en mer kompleks svulst biologisk system som er til stede i pasienten. Tumorxenotransplantater utviklet direkte fra en primær svulst vokst i mus ( "xenoline," pasient-avledet xenograft eller PDX) provide en mer reflekterende modellsystem, spesielt i innstillingen av kreftbehandling, som de følte seg til mer pålitelig måte å forutsi klinisk suksess. 8 Til tross for den mer reflekterende biologi, disse modellene er kostbare, og er vanskelig å etablere og vedlikeholde. Dessuten er de ikke mottagelig for high-throughput-studier. Behovet for å bedre utvikle biologiske modeller som mer nøyaktig gjenspeiler molekylære endringer i de primære svulster, og for å profilere og teste disse modellene bruker direkte tiltak av kinase aktivitet, ikke surrogat genetiske markører, er klart.
Det er velkjent at i motsetning til to-dimensjonale (2D) monolagskulturer, kan 3D- eller flercellede analysemodeller gi mer fysiologisk relevante endepunkter 9-11. Felles 3D kultur tilnærminger involvere matrix-belagt mikro og celle spheroid formasjon. Tumor kuler kan genereres via mobilnettet aggregering bruker spinner kolbe, PHEMA plate og henger slipp teknikker. Begrensninger for these tilnærminger inkluderer: manglende evne for noen celler til å danne stabile kuler, variasjon i vekst og utfordringer med blandede celletyper. Alternativt mange syntetiske (hydrogel, polymer) og dyr-avledet Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrise fra mus sarkomer, kollagen) matriser er utviklet for 3D kultur studerer 12-14. Mus EHS matrise blir brukt i stor utstrekning, men er kjent for å fremme cellevekst og differensiering in vitro og in vivo 15.
For å gjenskape 3D tumorbiologi, ble et menneske BioMatrix system utviklet av Dr. Raj Singh et al. 16. Den naturlige, vekstfaktor-frie menneske Biogel tillater 3D kultur stillaser (perler, plater), som støtter langsiktig dyrking av flere celletyper. En serie av 3D menneske Biogel kultur design er etablert for å studere tumorvekst, vedheft, angiogenese og invasjon egenskaper. Fordeler og egenskaper til human Biogel sammenlignet med vanligmus EHS geler er oppsummert i tabell 1 og tabell 2.
| Kilde: | Menneskelig Amnions (Felles vev) Patogen-fri, IRB-fritak / godkjent |
| ECM naturen: | Non-denaturert Biogel (GLP-produksjon) |
| Nøkkel komponenter: | Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin og HSPG (<3%) |
| GF-free: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogen, Giftfri) |
Tabell 1: Egenskaper for menneskelig Biogel i forhold til vanlige HMS-Gel.
| menneskelig Biogel | HMS gels |
| Naturlig menneskelig matrise | Rekonstituert mus matrise |
| Kontrollert cellevekst og differensiering | Kan fremme cellevekst og differensiering |
| Fysiologisk genuttrykk | Variabel genuttrykk |
| 3D vev-lignende kulturmodell | Plate-baserte kulturmodell |
Tabell 2: Fordeler med Menneskelig Biogel i forhold til vanlige HMS-Gel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
MERK: Alle xenograft terapi evalueringer ble gjort ved hjelp av en orthotopic tumormodell for glioblastom på en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité.
1. Isolering av pasient-avledet GBM xenograft Cells
- Utarbeidelse av reagenser
- Re-utgjøre kollagenase-I i sterilt vann til en konsentrasjon på 5 mg / ml og sterilfilter. Lagres i 1 ml alikvoter ved -20 ° C (endelig konsentrasjon er 50 ug / ml i 100 ml enzymoppløsning).
- Oppløs 100 ug epidermal vekstfaktor (EGF) i 2 ml sterilt fosfatbuffret saltoppløsning (PBS). Lagres i 100 pl (5 ug / 100 ul) alikvoter ved -20 ° C til en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml.
- Oppløs 100 ug FGF-β i 2 ml sterilt PBS. Lagres i 100 pl (5 ug / 100 ul) alikvoter ved -20 ° C til en endelig konsentrasjon på 10 ng / ml.
- Legg til følgende til en 500 ml flaske Neurobasal Media (NBM) for å forberede komplett NBM: 10 ml B-27 supplement uten vitamin A, 5 ml N2 supplement, 100 ul EGF, 100 pl fibroblastvekstfaktor (FGF) -Grunnmetaller, 5 ml amfotericin B, 0,5 ml gentamycin, 5 ml L-glutamin.
- Fremstille frisk enzymløsning ved å kombinere: 98,5 ml PBS, 1 ml kollagenase-1, 0,5 ml 10x trypsin / EDTA og sterilisere ved filtrering gjennom 0,22 um pore-filter.
- Forbered eller få et lite volum sterilt Dulbeccos modifiserte Eagle-medium (DMEM) / F12 cellekulturmedium med 7% føtalt bovint serum (FBS) og 1 x PBS uten kalsium eller magnesium.
- tumor Disaggregering
MERK: atymisk nu / nu mus tidligere injisert med tumorceller i den høyre flanke og fikk fra en følbar tumor massen er nødvendig for denne fremgangsmåten. I de eksemplene som er vist her, brukte vi pasient avledet xenograft GBM celler, JX10 og JX12 17.- Steriliser arbeidsområdet ved sprøyting 2% klorheksidin og sette opp arbeidsområdet viddh nødvendige instrumenter / utstyr inkludert engangs chuck, tang, skalpell, glass petriskål, enzym løsning, PBS, og klorheksidin (se figur 2A).
- Avlive mus / mus skjuler en flanke svulst. Målet for en 20% / min forskyvning frekvensen av CO 2 ved bruk av 30% CO 2. Etter mus viser respirasjonsstans, opprettholde CO 2 flyt i ca 1 min (vanligvis 3 min totalt). Mus blir fjernet fra kammeret og cervikal dislokasjon er utført som et sekundært eutanasi bekreftelse. Spray dyret med 3% klorhexidin til å rense huden.
- Mens du holder musen stødig, gjør semi-sirkulær hud innsnitt ~ 1,5 cm fra tumormasse (flanke implantert tumor) ved hjelp av en steril engangs skalpell med # 11 blad begynner kranie til tumormassen og incising mot buken på musen og rundt til haleenden.
- Reflekter huden over tumormasse ved hjelp av fingrene med milde trekkraft på hale enden av snittet og trykk på hudenoverflaten for å heve svulst å ha best tilgang uten å berøre tumor (se figur 2B).
- Bruk stump disseksjon med pinsett for å forsiktig gratis tumormasse fra peritoneal vegg og fra huden (se figur 2C).
- Transfer tumormasse med pinsett til sterile glass petriskål (IKKE bruk plast retter for å unngå å bryte løpet hakking) og riktig kast kadaveret og plassere disse instrumentene til side.
- Bruk nytt sett med sterile instrumenter (skalpell med # 11 blad, semi-buede tang) til debride svulstvev av nekrotisk vev og membran verten bindevev som dekker svulst.
- Plasser 15 ml enzymoppløsning i en steril ventilert-trypsinizing kolbe med rørestav og begynne omrøring langsomt i hetten.
- I et sterilt glass petriskål, vaske høstet svulster 3 - 5 ganger med steril PBS for å fjerne overflødig blod (kan helle eller bruke sprøyte for å skylle dem med PBS). Forsiktig vippe parabol og pipette eller suge vaskemateriale. Finhakk finely bruke to # 11 skalpellblader (Se figur 2D).
- Legg 14 ml enzymoppløsning til hakket tumor og pipettes forsiktig opp og ned til 2 - 3 ganger. Overfør blandingen til ventilert-trypsinizing kolbe og omrørt langsomt i 20 min. Fremstille 5 50 ml koniske rør ved å tilsette 1,5 ml FBS til hverandre for å nøytralisere trypsin i trinn 1.2.11.
- Etter 20 minutter, samle 14 ml celleløsning fra trypsinizing kolbe og tilsett til en tube med FBS. Legg 14 ml frisk enzym løsning kolbe og fortsette omrøring.
- Sentrifuger samles cellene ved 150 x g i 8 min ved romtemperatur og kast supernatanten. Legg 45 ml komplett NBM til pelleten, bland forsiktig, og gjenta sentrifugering for å skylle ut serum. Re-suspendere pellet i 5 ml komplett NBM og holde på is.
- Gjenta cellen høste trinn for totalt 5 avlinger, som kombinerer alle høstet-celler i en enkelt konisk rør på is.
- Plasser en 40 um celle sil på toppen av en 50 ml konisk rør. prep than cellefilter ved å føre 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS gjennom og deretter vasket med 10 ml PBS.
- Tilsett langsomt cellesuspensjon til sil, slik at det å dryppe gjennom (se figur 2 M). Løft forsiktig kategorien av cellen sil i mellom hver nye tillegg til å bryte noen vakuum og la de suspenderte cellene til å passere fritt (se figur 2 N).
- Sentrifuger den filtrerte cellesuspensjonen som ovenfor. Re-suspendere i 10 ml komplett NBM og teller for å bestemme antall levedyktige celler ved hjelp av 0,04% trypanblått og et hemocytometer. Hold celler på is inntil microtumor generasjon.
2. Alternativ Tissue Disaggregering Protocol
- Automatisert vev dissociator og disaggregation system.
- Plasser disaggregation røret inn i mobilnettet dissociator, velg programmet "Tumor _02_02" og trykk start og kjøre for 32 sek. Overføringsrøret til Rotator, plass i 37 ° C inkubator i 40 min.
- Sentrifuger suspen-celler ved 150 xg i 8 minutter ved romtemperatur og kast supernatanten. Mens sentrifugering av cellene, satt opp reagenser for behandling av cellesuspensjonen. Tilsett 10 ml serumfritt NBM og forsiktig triturate suspensjon.
- Etter sentrifugering, oppnå en celle-pellet som inneholdt ~ 10 - 30 x 10 6 levedyktige celler (~ 0,3 ml). Re-suspendert pellet i 10 ml serumfritt NBM (Se figur 2o). Bestem levedyktige celler ved utelukkelse analysen (Se trinn 3.2.2).
3. Microtumor Generation
- Utarbeidelse av reagenser
- Forbered komplett NBM som i 1.1.4 og forberede nøytralisert High Density menneskelig Biogel (HuBiogel) (HDHG på 3 mg / ml) per interne protokoll. Lignende Biogel matriser kan brukes i tillegg.
- Microtumor Produksjon og kultur
- Skaff ferskt dissosierte PDX celler som enkelt celle suspensjon i fullstendig NBM, på is.
- Bland cellen suspension med et like stort volum av trypanblått-oppløsning (0,4% i PBS) og analyseres ved hjelp av et hemacytometer for å bestemme celletallet og levedyktigheten ved trypan blå eksklusjon 18. Fjerne volumet nødvendig for å generere 50.000 celler / microtumor hvor volum = (50.000 celler / tumor * # tumorer) / (levedyktige celletelling / 1 ml) og plasseres i en ny konisk rør.
- Konsentrer celler ved sentrifugering ved 150 xg, i 8 min, ved romtemperatur. Kast supernatanten og cellepelleten suspenderes med is-kald HDHG oppløsning i et sluttforhold på 1 del celler i FBS og 4 deler HDHG.
- Bruke en elektronisk multikanal pipette for å dispensere 10 ul pr tapp celle-HDHG blanding på en 96-pinners stålplate (med hydrofobisk belegg) for å generere microtumors (2 mm kuler som hver inneholdende 50.000 celler).
- Sette inn 3D-tumor kulene inne i vevskultur-inkubator (37 ° C, 5% CO2, fuktig) i 15 min for å gelate kulene.
- Etter gele, overføre microtumors (10 μ; L) til en tilpasset suspensjonskultur kammer (50 ml) eller stort volum kulturskål (10 cm) inneholdende komp NBM ved hjelp av den elektroniske flerkanals pipette og tilpasset tapp-anordning.
- Etter 1 - 2 dager i vevsdyrkningsinkubator, overføre microtumors til 96-brønners kulturplater som inneholder 50 mikroliter NBM / godt med et bredt munn utlevering pipette og utføre ulike analyse og analyseprotokoller.
- Drug behandling og vedlikehold av microtumors
- Velg sluttkonsentrasjoner for narkotika testing.
MERK: Hvis stoffet er kjent effekt ved 2D-kultur, velger 2x IC 50 som midt dosekonsentrasjon og velg 3-gangers seriefortynninger over og under for en total av 5 dosenivåer. For eksempel, hvis IC50 er 9 uM for medikamentet i 2D kultur, velger 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM og 162 uM endelig konsentrasjon som for medikamenttesting. - Forbered 2x doseringsløsning i fullstendig NBM fra dimetyl sulfoxide (DMSO) lager. Fortynn dosering oppløsning i 1% DMSO medium for å fremstille en 5 dose, 3-gangers seriell fortynning.
- Tilsett 50 ul dosering løsning på microtumor brønn inneholdende 50 ul i analyseplatene for å oppnå en endelig DMSO-konsentrasjon på 0,5%. Gjenta for hver replikere (for eksempel 4) ved hver medikamentdose bestemmes i 3.3.1.
- Opprettholde kulturene i 37 ° C, 5% CO2, fuktet vevskulturinkubator i 1 - 14 dager. Fôr kulturer to ganger ukentlig ved forfriskende media og narkotika løsning som ovenfor.
- Velg sluttkonsentrasjoner for narkotika testing.
4. morfologiske og Fenotypisk Analyse av Microtumors
- Bestem celle morfologi i microtumors ved hjelp av standard levende celle farging.
- Forbered en mM lager av Calcein-AM i DMSO. Delmengde og oppbevares ved -20 ° C.
- Ved ønskede intervaller kultur (1, 7 og 14 dager), tilsett Calcein-AM-løsning fremstilt i PBS (uten Ca / Mg) til 96-brønns plate i 1 mM sluttkonsentrasjon.
- Inkuber20 min i en 37 ° C, 5% CO 2, fuktet inkubator, og bildet ved hjelp av en fluorescens mikroskop med 2X, 4X, og 10X (eksitasjon: 450-490 nm band pass, emisjon: 515 nm langpasning, dichroic 500 nm) .
- Microtumor Vekst / Proliferation Assay
- Løs opp MTT pulver i PBS (uten Ca / Mg) for å forberede 12 mM lager. Steril filter, delmengde, og oppbevar ved -20 ° C.
- Ved ønskede intervaller kultur (1, 7 og 14 dager), tilsett 20 ul MTT-løsning til 96-brønns plate per 100 ul kulturvolum. Inkuber 2 timer i vevsdyrkningsinkubator.
- Forbered fersk lysis løsning av 10% SDS i 0,01 M HCl og legge like mye til kultur volum til plater. Inkuber forseglede plater over natten i 37 ° C inkubator.
- Les absorbansen ved 570 nm ved anvendelse av en multi-plateleser.
- Microtumor Forberedelse til Kinomic Analysis
- Forbered lysis buffer av pre-chilling til 4 ° C og deretter legge til en 1: Forholdet 100 hver av 100x Protein fosfatase inhibitor (PPI) og 100x Protein proteasehemmer (PI). Bland godt og holde på is.
- Transfer 2 microtumors til hver av tre 1,5 ml mikrosentrifugerør. Fjern supernatant og tilsett 40 ul lyseringsbuffer inneholdende PPI og PI til hvert rør og lyse i 30 minutter ved 4 ° C.
- Pipettes prøver kraftig for å bryte kreft perler. Sentrifuger ved 16000 x g i 10 min ved 4 ° C og lagre prøver ved -80 ° C inntil analyse kinomic.
5. Kinomic Profilering av Microtumors
- Protein Tyrosine Kinase (PTK) profilering
- Tine-reagenser (10x proteinkinase (PK) buffer og 2% bovint serumalbumin (BSA)) til 4 ° C Last PK-buffer (300 pl 10x PK buffer lager i 2,7 ml dH 2 O) inn i sprøyten i stilling # 2 på profilering plattform.
- Åpne kinase analysen programvare og laste PTK protokollen filen og trykk 'START', kommentere prøver innen programvare;er programmet etter skanning chips. Plasser chipsene ut mot profilering plattform og last 25 mL av 2% bovint serumalbumin (BSA) per rekke og trykk LAST å starte programvarestyrt protokoll blokkeringstrinn.
- Fortynnet 6 mikrometer av 100 mM ATP lager med 54 mL dH 2 O for å gjøre 10 mM adenosintrifosfat (ATP). Når programvaren begynner 3. og siste vask trinn (synlig på skjermen) ta 15 mikrogram av lysat brakt opp til 28 mL med dH 2 O, mikse og legge til array.
- Forbered PTK mester mix (MM) (for opp til 12 prøver). Legg 32,6 mL dH 2 O for å rekonstituere ditiotreitol (DTT) og tilsett 6 mL DTT og 60 ul 10x PK løsning, til PTK-MM1 tube (allerede inneholder 60 mikroliter 10x BSA).
- Vent til 'Load' rask i kinase analysen programvare vises deretter legge 126 mL av PTK-MM1, 60 mL PTK additiv og 60 mL 10 mM ATP til MM2 (inneholder tidligere porsjonert 4,5 mL PY20 FITC antistoff) og bland.Legg 16 ul av denne PTK konsentrat-blanding til hver prøve lysat rør og pipette blanding 5 ganger.
- Sørg for dekkglass er ren og deretter legge til 35 mL lysat / masterblanding per rekke, i nærheten karusell lokket, og trykk på Load knappen.
- Serine / treoninkinase (STK) Profilering:
- Tine-reagenser (10x PK buffer, 10x STK buffer, og 2% BSA) til 4 ° C. Belastning PK-buffer (300 ul i 2,7 ml dH 2 0) til sprøyten posisjon # 1, 1:10 og STK-buffer (300 ul i 2,7 ml dH 2 0) til sprøyten posisjon # 2.
- Åpne kinase analysen dataprogram og laste STK protokollen filen og trykk START, kommentere prøvene i programmet etter skanning chips. Plasser chipsene ut mot profilering plattform og last 25 mL av 2% BSA per rekke, og trykk deretter LAST å starte programvarestyrt protokoll blokkeringstrinn.
- Fortynnet 6 mikrometer av 100 mM ATP med 54 mL dH 2 O. Under finalen (3.) vasketrinn mix2 mikrogram av lysat og få opp til 32,6 mL med dH 2 O, mikse og legge til array.
- Gjør STK mester mix: Legg 70 mL 10x PK til STK-MM1 tube (inneholder 7 mL 100x BSA), og deretter legge til 42 mL dH 2 O til STK-MM1 tube.
- Vent til 'Load' rask i kinase analysen programvare så: Legg 18 mL 10 mM ATP til STK-MM1, og legg 9 mL MM1 til hver prøve lysat. Bland godt.
- Sørg for dekkglass er ren og tilsett 35 mL lysat / masterblanding per rekke, i nærheten karusell lokket, og trykk på LOAD.
- Under finalen (3.) Wash Step legge 1,05 mL STK-FITC sekundært antistoff mot DMAB tube (inneholder 3,03 mL STK primært antistoff mix), tilsett 39,6 mL AB Buffer til DMAB, legge til 356,0 mL dH 2 O til DMAB, tilsett 30 mL til DMAB til hver array, og trykk på LOAD .
- Analyse av Kinomic data 19,20
- Åpne analyse programvare og laste bildeanalyse App. Sepå Velg bildemappe som inneholder strekkode og tidsstemplede hel rekke bilder for PTK eller STK data, velger du artikkelnummeret matchet rekke layout fil (86312 for PTK og 87102 for STK), og last tidligere generert utvalg merknad fil.
- Kontroller korrekt slipe av alle bilder, og kjøre Exposure Time Scaling App. Statistisk sammenligne eksponering / skråningen log2 transformerte verdier, og bekrefter med forvask kinetiske kurver 19-21.
- Kjør oppstrøms kinase prediksjon programvare for å spørre endrede kinomic profiler mellom vilkår for oppstrøms kinaser 22,23.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi har vist at 3D Biogel kultur systemet støtter langsiktig vekst og funksjon av flere celletyper. I dette samarbeidsprosjektet, er pasient avledet GBM xenolines (PDX) brukes for å produsere hundrevis av microtumors. Dissosierte celler (3 x 10 5) eller neurosfærer (40 - 50) ble innleiret i Biogel perler (2 mm), og etter rask gele de dyrkes i en NB-media fylt tilpasset bioreaktor. Cellular levedyktighet (Calcein-AM), vekstprofil (MTT), og kinomic aktivitet rekke basert analyse ble bestemt. PDX microtumors opprettholdt flercellet organisering og høy levedyktighet (> 80%) for> 3 uker. Vi tror dette in vivo -lignende biologi skyldes vedlikehold av 3D celle-matrix arkitektur (ikke mulig med 2D eller spheroid kultur). Det er også observert at 3D-svulster er vanskelig å produsere med skjøre geléaktig protein stillas, muligens på grunn av mangel på kollagen I 14. En arbeidsgruppe ordning for microtumor produksjon ved hjelp av PDX-celler og 3D Biogel system er oppsummert i figur 1 og dissosiasjon prosessen er vist på figur 2.
Gjennom levende celle avbildning via Calcein-AM, bestemte vi cellevekst og levedyktighet, samt effekter av medikamentene på GBM-celler avledet fra PDX tumor JX10, som indikert ved en reduksjon i fluorescens, aliserte celledød. Tumorvekst ble målt på dag 0, 7 og 14 for microtumors viser kontinuerlig vekst som vist i figur 3A. Dette microtumor, JX10, er kjent for å være motstandsdyktig mot TMZ. Når de utsettes for 1-10 mikrometer TMZ, ble minimal vekst undertrykkelse bemerket (figur 3B). Imidlertid testing PDX tumor JX12, som er kjent for å være følsomme for TMZ, viste følsomhet ved MTT-analyse etter 14 dager som ble bekreftet av Calcein-AM imaging (figur 4).
er.within-page = "1"> For å utforske mulige mekanismer for legemiddelresistens, målte vi kinase signal i TMZ resistente microtumors (JX10). Kinomic profiler for 144 tyrosin og 144 serin / treonin phosphopeptide målene ble tatt for DMSO og 10 mikrometer TMZ behandlet microtumors. Kinomic fosforylering intensitet for alle peptid mål, per syklus, og per flere eksponeringstider ble tatt til fange (data ikke vist). En representant heatmap viser peptider som hadde betydelig endret intensitet med 10 mm TMZ behandling (p <0,05, uparede studenter T-test) vises i figur 5A. Kinomic profiler som ble endret i TMZ behandlet JX10 microtumors ble analysert ved bruk av oppstrøms kinase prediksjon programvare som identifiseres SYK, LCK, og CTK kinaser som økte i TMZ behandlede prøver i forhold til DMSO (figur 5B). Serine / treonin kinome oppstrøms kinase analyse ble også utført (figur 5C).
innhold "fo: keep-together.within-page =" 1 ">
Figur 1:. Arbeidsordningen for Microtumor Produksjon GBM-PDX svulster er skilt fra murine vert, og enkeltceller er innebygd i Biogel matrise for å danne microtumors. Analyser utføres deretter på microtumors. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Fig. 2: Dissosiasjon av PDX tumorceller Tumorene blir fjernet fra vertmus og oppmalt før blanding med enzymløsning (AG). Dissosiasjon er vist etter 40 min (H). Tumorcelle dissociator er vist (I). Triturering i media og filtrering (JN) er vist med en slutt result av 0,3 ml pellet (O) som inneholder 29,5 x 10 6 levedyktige celler (P) som danner sfæroider i NBM i 24 timer (Sp). Scale bar er 20 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Vekst av Microtumors JX10 microtumor vekst målt ved optisk densitet (OD) av MTT og representative bilder i løpet av 14 dager, både basalt (A), og som reaksjon på 1-10 uM TMZ behandling (B).. Bildene vises på 4X forstørrelse (skala bar = 500 mikrometer). Standardavvik er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. 
Fig. 4: Vekst av Microtumors JX12 microtumor vekst målt ved OD av MTT og representative bilder i løpet av 14 dager, både basalt (dag 1), og som reaksjon på 0, 1 eller 10 uM TMZ behandling (skala bar = 500 pm). Standardavvik er angitt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kinomic Profiler av TMZ Behandlet Microtumors Heatmap av eksponerings integrerte verdier (log2 forvandlet bakkene (x 100) på 10, 20, 50, 100, og 200 ms median signal minus bakgrunnseksponeringsverdier) vises for betydelig TMZ-endret. endrede peptider (p <0,05). Red indikerer økt, og blått indikerer redusert i forhold til DMSO bety per peptid. TMZ endrede profiler ble sammenliknet med oppstrøms kinase prediksjon programvare og endret kinaser. Normalisert Kinase statistikk (NKS) score> 1,0 og spesifisitet score> 1,3 (rød) er vurdert som svært forandret. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kritiske trinnene i protokollen overveiende knyttet til microtumor generasjon, så vel som medikamentdosering og vedlikehold. Fordi microtumor perler er skjøre og lett revet, er ekstrem forsiktighet nødvendig i både utviklingsstadier av en analyse og vedlikehold. Hvis det oppstår en feil under en av disse prosessene kan eksperimentell tolkning bli kompromittert, forårsaker utvidelse eller unødvendig repetisjon av forsøkene eller eksklusjon av data.
Modifikasjoner og feilsøking, spesielt av microtumor utviklingsprosessen, inkludert design og produksjon av en tilpasset hydrofob verktøy til bruk for å gjøre microtumor perler. Dette verktøyet gjør det mulig for raskere og mer nøyaktig produksjon av microtumors. I tillegg små endringer i vedlikehold av microtumors bidratt til å fremskynde prosessen med å endre medium og dosering cellene. Flere av disse modifikasjoner er inkludert, men var ikke begrenset til, ved anvendelse av en flerkanalsElektronisk pipette for å fjerne og erstatte medium fra 96-brønners plater og pre-blande friske medikamentdoserings løsninger og arrangere 2x oppløsninger i et tilsvarende 2 ml 96-brønns plate.
Store optimaliseringer for dyrkningsforhold i 3D modellering inkluderer bestemme passende doser for narkotika forbindelser, så er det et dårlig forhold mellom 2D-modellering og 3D-modellering. Derfor serielle fortynninger for å etablere en dose titreringskurven er ofte nødvendig for å bevege et 2D-modellsystem for å 3D microtumor modell.
Potensielle problemer å vurdere med microtumor generasjon fra xenoline tumorceller høstet fra en mus inkluderer bakteriell eller soppsporer, inkonsekvent tilgjengeligheten av primære xenolines, som unike vekstegenskaper hos mus kan produsere forskjeller i tid for innhøsting og varians i celleutbytte fra separate dissociations. I hver cellelinje, det antall celler som mottas, og på samme måte, hvor mange microtumors kan produseres will variere. Som sådan, er det et behov for å prioritere hvilke analyser er nødvendig, og hvilke som er "valgfri" skal det microtumor utbyttet være utilstrekkelig. Potensielle begrensninger med kinomic profilering av microtumors omfatter vanskeligheten med å korrigere for inert proteinholdig materiale lasting, som eksempler er lastet inn på en måte for å korrigere for BCA bestemmes proteinnivåer, som kanskje ikke skiller mellom Biogel basert proteiner (ECM proteiner) og de av cellulære kinase-komponent som er beregnet på å bli målt. Måling av brutto microtumor masse via Calcein-AM, eller bruke en rengjøring protein som en korreksjonsfaktor kan redusere dette, selv om problemer med rengjøring protein nivåer i svulster blir endret kan forvirre dette. For kort tid-retters signale eksperimenter, forutsatt like størrelse (kinase som inneholder levende celle nummer) og paret behandlede og ubehandlede prøvene, er dette mindre av et problem.
Med denne forskningen, er målet å gi en mer kostnadseffektiv effective og sykdom-representant preklinisk modell for nøyaktig medikamentell behandling testing i forhold til ortotopiske pasient avledet xenografter, dagens gullstandarden modell for GBM testing. I de senere år har flere grupper forsøkt å modellere in vivo GBM miljø for medikamenttestformål. Noen grupper har rett og slett prøvd å vokse GBM tumorceller i ikke-differensierende forhold til å bevare GBM stamceller eller minst hjernesvulst initiere celler (BTIC) 24,25. Disse tumorsphere eller neurosfære kulturer kan anvendes for medikamenttesting, og er sannsynligvis overlegen i forhold til tradisjonelle modeller. Men siden de mangler fortsatt den tumor-stroma samspill som er bevart i vår microtumor modell, tumorsphere tilnærmingen er fortsatt begrenset. Andre grupper har forsøkt å anvende tekniske prinsipper for å forbedre GBM modeller 26-28. Disse metodene har tatt med flyt kamre, variable ECM proteiner og tumorcelle / normal celle blandinger. Mens lovende, nesten alle disse reports har brukt foreviget cellelinjer med de begrensningene som er nevnt tidligere. Som sådan, mener vi at PDX-baserte microtumor modellen beskrevet her er mer klinisk relevant.
I fremtiden kan det microtumor modellen brukes enten som en ekte svulst avatar eller en "proband" -system. Med proband systemet, PDX utviklet fra en spesiell pasient ikke direkte kontakt med klinikeren om den spesifikke pasients terapi, som sammen med tumoren avataren system. I stedet er en pasients svulst "matchet" til en pre-eksisterende, godt karakterisert (begge molekylært og fenotypisk) PDX 29. Faktisk kan denne modellen fungere som en "gå-til" avatar eller ligge i en proband bibliotek som en sammenlignende profil. Med tradisjonelle avatarer, vokser pasientens tumorceller i mus i parallell med pasientens behandling er ikke bare tidkrevende, ettersom det kan ta flere måneder for primærkanalen, men også kostbart, da teste flere drug terapi hos mus generere en overveldende prislapp. For å bekjempe dette, kan den primære tumor pasienten implanteres direkte i Biogel matrisen. Med microtumors, kan resultatene bli generert raskt og til en lavere kostnad.
Som en proband modell, kunne microtumor kinome dataprofiler og narkotika respons legges til en proband "bibliotek", sammen med profiler og data fra tidligere 3D in vitro-modeller, eksisterende PDXs, dyrestudier, andre pasienter, osv. I teorien kan pasientens kreftceller da være "omically '(genomisk, kinomically, transcriptomically, etc.) passer til en lignende eksisterende microtumor profil for å fastslå nøyaktig behandling for best mulig resultat.
Sammendrag: Her identifiserer vi at disse microtumor modeller kan anvendes for å måle både fenotypisk vekst og kan undersøkes i både basal kinase aktivitetsnivå, og i respons til medikamentbehandling som kan være nyttigsom en translasjonsforskning verktøy for videre preklinisk forskning. Utvikling nøyaktige, og molekylært gyldige testbare modeller for humane tumorer er avgjørende for effektiv legemiddelutvikling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Støttet av NIH R21 stipend (PI: C. Willey, CA185712-01), hjernesvulst SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) og SBIR kontrakt (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
- Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
- Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
- Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
- Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
- Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
- Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
- De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
- Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
- Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
- Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
- Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
- Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
- Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
- Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
- Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
- Uab Research Foundation. Biologically active native biomatrix composition. US patent. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. , 7727550 B2 (2010).
- Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
- Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
- Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
- Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
- Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
- Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
- Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
- Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
- Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
- Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
- Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).
