Introduction
Die häufigsten primären intrakraniellen bösartigen Hirntumoren sind Grad III Astrozytome und Grad IV Glioblastom (Glioblastom oder GBM). Diese Tumoren bieten schlechten Prognosen mit Median Ein-Jahres - Überlebensrate zwischen 12 bis 15 Monaten bei den derzeitigen Therapien für GBM in den USA 1-3. Multimodalität Therapien umfassen Chirurgie, Strahlentherapie und Chemotherapie einschließlich Temozolomid (TMZ) und Kinase-bezogenen Mittel. Kinase Signalgebung in GBM, einschließlich Teilmengen von Tumoren mit Amplifikation oder aktivierende Mutationen in den epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (EGFR), erhöht sich in Platelet Derived Growth Factor Receptor (PDGFR) Signalisieren, erhöht Phosphatidyl-Inositol-3-Kinase (PI3K) häufig dysreguliert und Unterstützung Tumor 4-6 angiogenen Signalisierung durch Vascular Endothelial Growth Factor Receptor (VEGFR) sowie andere Kinase angetrieben Wege. Aktuelle In - vitro und in - vivo - Modellen diese repräsentativen Veränderungen häufig verlieren <sup> 7. Darüber hinaus hat genetische Profilierung nicht die erwarteten Vorteile angeboten, die die Tatsache, dass genetische und epigenetische Veränderungen Veränderungen auf der Ebene der Proteinaktivität vorhersagen, nicht immer widerspiegeln kann, wo die meisten Kinase Mittel wirken direkt und wo Therapien mit anderen Wirkmechanismen wirken können Targeting indirekt.
Die traditionelle immortalisierte Zelllinie, die ad infinitum agiert werden kann, ist seit langem der Standard für Drogentests aufgrund ihrer Wartungsfreundlichkeit und Reproduzierbarkeit. Jedoch leidet dieses Modell von einem hohen Nährstoff (und künstliche) Wachstumsumgebung, die Zellen für schnell wachsende, die sich stark von dem ursprünglichen Tumor auswählt. Als solches hat es bei der Entwicklung realistischer Modellsysteme ein beträchtliches Interesse, die ein komplexeres Tumor biologischen System reflektieren als in dem Patienten vorhanden ist. Tumorxenografte bei Mäusen gezüchtet direkt aus einem Primärtumor entwickelt ( "xenoline" Patienten stamm Xenotransplantat oder PDX) provide ein reflektierter Modellsystem, insbesondere im Rahmen von Krebstherapeutika, da sie zuverlässiger klinischer Erfolg vorhersagen , sind zu spüren. 8 Trotz der reflexions Biologie, diese Modelle sind teuer und schwierig herzustellen und aufrechtzuerhalten. Darüber hinaus sind sie Hochdurchsatz-Untersuchungen nicht zugänglich. Die Notwendigkeit, eine bessere biologische Modelle zu entwickeln, die genauer molekularen Veränderungen in den primären Tumoren reflektieren und zu profilieren und diese Modelle durch direkte Maßnahmen der Kinaseaktivität zu testen, nicht genetische Marker Surrogat, ist klar.
Es ist bekannt , dass im Gegensatz zu zweidimensionalen (2D) Monolayer - Kulturen, 3D oder mehrzelligen Testmodellen mehr physiologisch relevanten Endpunkten 9-11 bereitstellen kann. Gemeinsame 3D-Kultur Ansätze beinhalten Matrix beschichteten Mikrocarriern und Zell Sphäroidformation. Tumorsphäroide kann über zelluläre Aggregation mit Rührflasche, pHEMA Platte und Hänge Drop-Techniken erzeugt werden. Einschränkungen für tiese Ansätze umfassen: Unfähigkeit für einige Zellen stabil Sphäroiden, Variabilität in Wachstum und Herausforderungen mit gemischten Zelltypen zu bilden. Alternativ 12-14 viele synthetische (Hydrogel - Polymer) und tierischen Ursprungs Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) Matrix aus Maus - Sarkome, Rinder - Kollagen) Matrizen entwickelt wurden , für die 3D - Kultur studiert. Maus - EHS - Matrix weitgehend verwendet wird , aber bekannten Zellwachstum und die Differenzierung in vitro zu fördern , und in vivo 15.
Um 3D - Tumorbiologie zu replizieren, wurde ein Mensch Biomatrix System von Dr. Raj Singh et al. Entwickelte 16. Die natürliche, Wachstumsfaktor-freien menschlichen Biogel ermöglicht 3D-Kultur Gerüste (Perlen, Scheiben), die Langzeitkultivierung von mehreren Zelltypen unterstützen. Eine Reihe von 3D menschlichen Biogel Kultur Designs sind für die Untersuchung von Tumorwachstum, Adhäsion, Angiogenese und Invasion Eigenschaften etabliert. Vorteile und Eigenschaften der menschlichen Biogel im Vergleich zu gemeinsamenMaus - EHS - Gele sind in Tabelle 1 und Tabelle 2 zusammengefasst.
| Quelle: | Menschliche Amnion (gepoolte Gewebe) Pathogen-frei, IRB frei / genehmigt |
| ECM Natur: | Nichtdenaturierter Biogel (GLP-Produktion) |
| Schlüssel Komponenten: | Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin & HSPG (<3%) |
| GF frei: | Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogenen, ungiftiger) |
Tabelle 1: Eigenschaften der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.
| Menschliche Biogel | EHS - Gele |
| Natürliche menschliche Matrix | Rekonstituierte Maus Matrix |
| Controlled Zellwachstum und Differenzierung | Kann das Zellwachstum und Differenzierung fördern |
| Physiologische Genexpression | Variable Genexpression |
| 3D gewebeähnlichen Kulturmodell | Plattenbasis Kulturmodell |
Tabelle 2: Die Vorteile der Menschen Biogel als Common EHS Gele verglichen.
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Protocol
HINWEIS: Alle Xenotransplantat Therapie Auswertungen wurden unter Verwendung eines orthotopen Tumormodell für Glioblastom auf einem Protokoll getan genehmigt von der Institutional Animal Care und Use Committee.
1. Isolierung von Patienten stammenden GBM Xenotransplantatzellen
- Vorbereitung der Reagenzien
- Wieder bilden Kollagenase-I in sterilem Wasser auf eine Konzentration von 5 mg / ml und Sterilfilter. Store in 1 ml Aliquots bei -20 ° C (Endkonzentration beträgt 50 & mgr; g / ml in 100 ml Enzymlösung).
- Man löst 100 ug Epidermal Growth Factor (EGF) in 2 ml steriler Phosphat-gepufferter Saline (PBS). Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml.
- Man löst 100 ug FGF-β in 2 ml sterilem PBS. Store in 100 ul (5 ug / 100 ul) Aliquots bei -20 ° C für eine Endkonzentration von 10 ng / ml.
- Fügen Sie den folgenden auf eine 500 ml Flasche Neurobasal Media (NBM) herzustellen vollständige NBM: 10 ml B-27 Supplement ohne Vitamin A, 5 ml N2 ergänzen, 100 ul EGF, 100 ul Fibroblast Growth Factor (FGF) -Basic, 5 ml Amphotericin B, 0,5 ml Gentamycin, 5 ml L-Glutamin.
- Bereiten Sie frische Enzymlösung durch die Kombination: 98,5 ml PBS, 1 ml Kollagenase-1, 0,5 ml 10x Trypsin / EDTA und sterilisieren durch Filtration durch 0,22 um Porenfilter.
- Vorbereiten oder ein kleines Volumen steriler Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM) / F12 Zellkulturmedium mit 7% fötalem Rinderserum (FBS) und 1x PBS ohne Calcium oder Magnesium erhalten.
- Tumor Disaggregation
HINWEIS: athymischen nu / nu-Maus zuvor mit Tumorzellen in die rechte Flanke injiziert, und man ließ sie aus einer tastbaren Tumormasse ist für dieses Verfahren erforderlich. In den hier gezeigten Beispielen verwendeten wir Patienten stamm Xenotransplantat GBM Zellen, JX10 und JX12 17.- Sterilisieren Arbeitsbereich durch Sprühen 2% Chlorhexidin und eingerichtet Arbeitsbereich Witzh notwendigen Instrumente / Lieferungen einschließlich Einweg - Bohrfutter, Pinzetten, Skalpell, Glas Petrischale, Enzymlösung, PBS und Chlorhexidin (siehe Abbildung 2A).
- Euthanize Maus / Mäuse eine Flanke Tumor beherbergen. Ziel für eine 20% / min Verschiebungsrate von CO 2 unter Verwendung von 30% CO 2. Nachdem der Maus Atemstillstand zeigt, für ca. 1 min (typischerweise 3 min gesamt) CO 2 Fluss aufrechtzuerhalten. Mäuse werden aus der Kammer entfernt und zervikale Dislokation wird als Sekundär Euthanasie Bestätigung ausgeführt. Sprühen Sie das Tier mit 3% Chlorhexidin Haut zu sanieren.
- Während die Maus stabil halten, machen halbkreisförmige Hautschnitt ~ 1,5 cm von Tumormasse (Flanke implantierte Tumor) beginnt kranial der Tumormasse mit einer sterilen Einweg-Skalpell mit # 11 Klinge und in Richtung Bauch der Maus Einschneiden und um auf die Schwanzende.
- Reflektieren Haut über Massentumor Finger mit leichten Zug am Schwanzende des Einschnitts mit und drücken Sie dann auf der HautOberflächen Tumor zu erhöhen besten Zugang zu haben , ohne den Tumor zu berühren (siehe 2B).
- Verwenden Sie mit einer Pinzette stumpfe Präparation vorsichtig frei Tumormasse von Peritonealwand und von der Haut (siehe Abbildung 2C).
- Transfer Tumormasse mit einer Pinzette in sterile Glaspetrischale (NICHT Plastikgeschirr verwenden, um zu verhindern während mincing Brechen) und ordnungsgemäß Karkasse verwerfen und diese Instrumente beiseite legen.
- Verwenden Sie neue Reihe von sterilen Instrumenten (Skalpell mit # 11 Klinge, halb gebogenen Pinzette) Tumorgewebe des nekrotischen Gewebes und membranösen Wirts Bindegewebe bedeckt Tumor debride.
- Legen 15 ml Enzymlösung in einem sterilen entlüftet-Trypsinisierung Kolben mit Rührstab und beginnen langsam in der Haube gerührt wurde.
- In einer sterilen Petrischale aus Glas, waschen geerntet Tumoren 3-5 mal mit sterilem PBS überschüssiges Blut zu entfernen (Spritze gießen oder verwenden Sie können sie mit dem PBS spülen). kippen vorsichtig Schale und Pipette oder das Waschmaterial absaugen. Mince finely zwei # 11 Skalpellklingen mit (siehe 2D).
- In 14 ml Enzymlösung auf gehacktes Tumor und pipettieren sanft auf und ab 2 - 3 mal. Transfer Gemisch entlüftet-Trypsinisierung Kolben und rühren langsam für 20 min. Bereiten 5 50 ml konische Röhrchen durch Zugabe von 1,5 ml FBS zu jeder um das Trypsin in Schritt 1.2.11 zu neutralisieren.
- Nach 20 min von Trypsinisierung Kolben 14 ml Zelllösung zu sammeln und mit FBS zu einem Röhrchen hinzufügen. In 14 ml frischer Enzymlösung in den Kolben und das Rühren fortgesetzt.
- Zentrifuge gesammelten Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. In 45 ml Komplett NBM zum Pellet, vorsichtig mischen und wiederholen Zentrifugation Serum auszuspülen. Re-suspend Pellet in 5ml komplette NBM und halten Sie auf dem Eis.
- Wiederholen Zellernte Schritte für insgesamt 5 Ernten, alle geernteten-Zellen in einem einzigen konischen Röhrchen auf Eis kombinieren.
- Legen Sie eine 40 & mgr; m Zellsieb auf der Oberseite eines 50 ml konischen Röhrchen. Prep ter Zellsieb von 10 ml DMEM / F12 + 7% FBS und dann durch Waschen mit 10 ml PBS geben.
- Langsam Zellsuspension Sieb hinzufügen, es (siehe Abbildung 2 M) zu durchtropfen ermöglicht. Das Register der Zelle Sieb zwischen jedem neuen Zusatz jedes Vakuum zu brechen und erlauben die suspendierten Zellen frei zu passieren (siehe Abbildung 2 N) vorsichtig anheben.
- Zentrifugieren Sie die gefilterte Zellsuspension wie oben. Re-suspend in 10 ml Voll-NBM und zählen Gesamtzahl der lebenden Zellen zu bestimmen, unter Verwendung von 0,04% Trypanblau und einer Zählkammer. Halten Sie Zellen auf Eis, bis microtumor Generation.
2. Alternative Tissue Disaggregation Protokoll
- Automatisierte Gewebe Dissociator und Disaggregation System.
- Legen Sie die Disaggregation Rohr in das zelluläre Dissociator, wählen Sie das Programm "Tumor _02_02" und drücken Sie auf Start und laufen für 32 Sekunden. Übertragungsrohr an Rotator, in 37 ° C Inkubator für 40 min.
- Zentrifuge suspendiert-Zellen bei 150 g für 8 Minuten bei Raumtemperatur und den Überstand verwerfen. Während die Zellen zentrifugiert, Reagenzien für die Verarbeitung der Zellsuspension auf. 10 ml Serum-freien NBM und sanft verreiben Suspension.
- 30 x 10 6 lebende Zellen (~ 0,3 ml) - ein Zellpellet ~ 10 enthält Nach der Zentrifugation erhalten. Re-suspendierte das Pellet in 10 ml Serum-freien NBM (siehe Abbildung 2 O). Bestimmen Sie die lebenden Zellen durch Ausschluss-Assay (siehe Schritt 3.2.2).
3. Microtumor-Generation
- Vorbereitung der Reagenzien
- Bereiten Sie komplette NBM wie in 1.1.4 und bereiten neutralisierten High Density menschlichen Biogel (HuBiogel) (HDHG bei 3 mg / ml) pro internes Protokoll. Ähnliche Biogel Matrizen können ebenfalls verwendet werden.
- Microtumor Produktion und Kultur
- Erhalten Sie frisch gewonnenen PDX-Zellen als Einzelzellsuspension in Voll-NBM, auf Eis.
- Mischen Sie die Zelle suspension mit einem gleichen Volumen von Trypan - Blau - Lösung (0,4% in PBS) und zu analysieren Hämozytometer unter Verwendung von 18 Zellzahl und Lebensfähigkeit durch Trypanblau-Ausschluss bestimmt werden . Entfernen notwendige Volumen 50.000 Zellen zu erzeugen / microtumor wo Volumen = (50.000 Zellen / Tumor * # Tumoren) / (Lebendzellzahl / 1 ml) und in einen frischen konischen Röhrchen.
- Konzentrat-Zellen durch Zentrifugation bei 150 xg für 8 min bei Raumtemperatur. Überstand verwerfen und Zellpellet mit eiskaltem HDHG Lösung in einem abschließenden Verhältnis von 1 Teil Zellen in FBS und 4 Teilen HDHG.
- Verwenden Sie eine elektronische Mehrkanalpipette 10 & mgr; l pro Pin zell HDHG Mischung auf einen 96-poligen Stahlplatte verzichtet werden (mit hydrophoben Beschichtung) microtumors (2 mm Perlen mit je 50.000 Zellen) zu erzeugen.
- Legen Sie 3D - Tumor Perlen innerhalb Gewebekultur - Inkubator (37 ° C, 5% CO 2, befeuchtete) für 15 min um die Perlen zu gelieren.
- Nach dem Gelieren, übertragen Sie die microtumors (10 μl) zu einer benutzerdefinierten Suspensionskulturkammer (50 ml) oder große Volumen Kulturschale (10 cm) mit vollständigen NBM mit Hilfe des elektronischen Mehrkanalpipette und benutzerdefinierte Pin-Gerät;.
- Nach 1 - 2 Tage in Kultur Inkubator Gewebe übertragen microtumors auf 96-Well-Kulturplatten 50 ul NBM / Vertiefung mit einem Weithals Pipette enthält Abgabe und verschiedene Assay und Analyseprotokolle durchführen.
- Medikamentöse Behandlung und Pflege von microtumors
- Wählen Sie Endkonzentrationen für Drogentests.
HINWEIS: Wenn die Wirksamkeit von Medikamenten in 2D Kultur, wählen Sie 2x die IC 50 als die mittlere Dosiskonzentration bekannt ist , und wählen Sie 3-fach Reihenverdünnungen oben und unten für insgesamt 5 Dosen. Wenn beispielsweise die IC 50 9 & mgr; M für das Medikament in 2D Kultur ist, wählen Sie 2 uM, 6 uM, 18 uM, 54 uM und 162 uM als Endkonzentration für Drogentests. - Bereiten Sie 2x Medikamentendosierung Lösung in Voll-NBM von Dimethyl sulfoxide (DMSO) Lager. Verdünnte Dosierung Lösung in 1% DMSO Medium, das eine 5-Dosis, 3-fach serielle Verdünnung herzustellen.
- Je 50 ul Dosierungslösung zur microtumor auch 50 & mgr; l in Assay-Platten, die eine endgültige DMSO-Konzentration von 0,5% zu erreichen. Wiederholen für jede Wiederholung (beispielsweise 4) bei jeder Arzneimitteldosis in 3.3.1 bestimmt.
- Aufrechterhaltung Kulturen in 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Gewebekultur - Inkubator mit 1 - 14 Tagen. Feed-Kulturen zweimal wöchentlich von Medien und Medikamentenlösung wie oben erfrischend.
- Wählen Sie Endkonzentrationen für Drogentests.
4. Morphologische und phänotypische Analyse von Microtumors
- Bestimmen Sie die Zellmorphologie in microtumors unter Verwendung von Standard Lebendzellfärbung.
- Bereiten Sie 1 mM Lager von Calcein-AM in DMSO. Aliquotieren und bei -20 ° C.
- In gewünschten Intervallen Kultur (1, 7 und 14 Tage), fügen Calcein-AM-Lösung in PBS hergestellt (ohne Ca / Mg) auf 96-Well-Platte für 1 & mgr; M Endkonzentration.
- bebrüten20 min in einem 37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator und Bild mit einem Fluoreszenzmikroskop bei 2X, 4X und 10X (Anregung: 450-490 nm Bandpass, Emission: 515 nm Langpass dichroitische 500 nm) .
- Microtumor Wachstum / Proliferation Assay
- Löse MTT Pulver in PBS (ohne Ca / Mg) 12 mM Lager vorzubereiten. Sterilfilter, aliquoten, und bei -20 ° C.
- Bei gewünschten Kultur Intervallen (1, 7 und 14 Tage), fügen Sie 20 ul MTT-Lösung auf 96-Well-Platte pro 100 & mgr; l Kulturvolumen. Inkubieren 2 Std in Gewebekultur-Inkubator.
- Bereiten Sie frische Lyselösung von 10% SDS in 0,01 M HCl und fügen Sie die gleiche Menge an Kulturvolumen zu den Platten. versiegelten Platten Inkubieren über Nacht in 37 ° C Inkubator.
- Lesen Sie die Absorption bei 570 nm eine Mehrplattenleser.
- Microtumor Vorbereitung für Kinomic Analyse
- Bereiten Lysepuffer durch Vorkühlen auf 4 ° C und dann Zugabe einer 1: 100-Verhältnis von jedem 100x Protein Phosphataseinhibitor (PPI) und 100x Protein Protease-Inhibitor (PI). Gut mischen und auf Eis halten.
- Transfer 2 microtumors jedem von drei 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen. Überstand entfernen und werden 40 & mgr; l Lyse-Puffer, der PPI und PI in jedes Röhrchen und lysieren, für 30 min bei 4 ° C.
- Pipette Proben kräftig Tumor Perlen zu brechen. Zentrifuge bei 16.000 xg für 10 min bei 4 ° C und Proben bei -80 ° C bis kinomic Analyse.
5. Kinomic Profilieren von Microtumors
- Protein - Tyrosinkinase (PTK) Profilierungs
- Thaw Reagenzien (10x Protein Kinase (PK) Puffer und 2% Rinderserumalbumin (BSA)) bis 4 ° C Last PK - Puffer (300 ul 10x PK Puffer Lager in 2,7 ml dH 2 O) in die Spritze in die Position # 2 auf der Profilierung Plattform.
- Öffnen Sie die Kinase-Assay-Software-Programm und laden Sie die PTK-Protokoll-Datei und klicken Sie auf "START", mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb Softwsind Programm nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% Rinderserumalbumin (BSA) pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen.
- Verdünnen 6 uM 100 mM ATP Lager mit 54 & mgr; l dH 2 O 10 mM Adenosintriphosphat (ATP) zu machen. Wenn die Software die 3. beginnt und letzten Waschschritt (auf dem Bildschirm sichtbar) bringen 15 ug Lysat bis 28 & mgr; l mit dH 2 O gebracht, mischen und zu Array hinzufügen.
- Bereiten Sie PTK Master-Mix (MM) (für bis zu 12 Proben). Hinzufügen 32,6 & mgr; l dH 2 O zu rekonstituieren Dithiothreitol (DTT) und füge 6 ul DTT und 60 ul 10x - PK - Lösung zu PTK-MM1 Rohr (bereits 60 & mgr; l 10x BSA enthält).
- Warten Sie, bis "Load" Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software erscheint dann fügen Sie 126 ul von PTK-MM1, 60 ul PTK Additiv und 60 & mgr; l 10 mM ATP zu MM2 (enthält aliquotiert zuvor 4,5 ul PY20 FITC-Antikörper) und mischen.In 16 ul dieser PTK Master-Mix zu jedem Probenlysat Röhrchen und Pipette Mischung 5 mal.
- Stellen Sie sicher, Deckglas sauber ist und fügen Sie dann 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD-Taste.
- Serin / Threonin - Kinase (STK) Profilierung:
- Auftau-Reagenzien (10x PK-Puffer, 10x STK-Puffer und 2% BSA) auf 4 ° C. Last PK - Puffer (300 & mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 1, 1:10 und STK - Puffer (300 & mgr; l in 2,7 ml dH 2 0) in die Spritze Position # 2.
- Öffnen Sie die Kinase-Assay-Computer-Software-Programm und laden Sie die STK-Protokoll-Datei und drücken Sie START, mit Anmerkungen versehen Proben innerhalb des Programms nach dem Scannen Chips. Platz Chips auf Profilierungsplattform und Last 25 ul 2% BSA pro Array und dann LOAD drücken Sie die softwaregesteuerte Protokoll Blockierungsschritt zu beginnen.
- Verdünnen 6 uM 100 mM ATP mit 54 & mgr; l dH 2 O. Während Finale (3.) Waschschritt Mix2 ug Lysat und bringen bis 32,6 & mgr; l mit dH 2 O, mischen und zu Array hinzufügen.
- Make STK Master - Mix: In 70 ul 10x PK STK-MM1 Rohr (enthält 7 ul 100x BSA), und fügen Sie dann 42 & mgr; l dH 2 O zu STK-MM1 Rohr.
- Warten Sie, bis "Load" Eingabeaufforderung in der Kinase-Assay-Software dann: In 18 ul 10 mM ATP zu STK-MM1 und fügen 9 ul MM1 zu jedem Probenlysat. Gut mischen.
- Stellen Sie sicher, Deckglas ist sauber und fügen Sie 35 ul Lysat / Master-Mix pro Array, in der Nähe Karussell Deckel und drücken Sie LOAD.
- Während Final (3.) Waschschritt Hinzufügen 1,05 ul STK-FITC sekundären Antikörper zu DMAB Rohr (enthält 3,03 ul STK primärer Antikörper - Mix), fügen 39,6 ul AB - Puffer zu DMAB, fügen 356,0 ul dH 2 O zu DMAB, 30 & mgr; l DMAB zu jedem Array hinzuzufügen, und drücken Sie LOAD .
- Analyse von Kinomic Daten 19,20
- Offene-Analyse-Software und laden Sie die Bildanalyse App. Select Bildordner barcodierte und zeitgestempelt ganze Reihe Bilder für PTK oder STK Daten, wählen Sie Artikelnummer angepasst Array-Layout-Datei (86312 für PTK und 87102 für STK) enthält, und die Last vorher Array Anmerkungsdatei erzeugt.
- Stellen Sie sicher, korrekte Rasterung aller Bilder und laufen Belichtungszeit App Skalierung. Statistisch gesehen vergleichen Exposition / Steigung log2 transformierten Werte und 19-21 mit Vorwäsche Kinetikkurven validieren.
- Führen Sie Upstream - Kinase - Vorhersage - Software veränderte kinomic Profile zwischen den Bedingungen für die Upstream - Kinasen 22,23 abzufragen.
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Representative Results
Wir haben gezeigt, dass 3D-Biogel Kultursystem langfristige Wachstum und die Funktion von mehreren Zelltypen unterstützt. In diesem Verbundprojekt, Patienten stammenden GBM xenolines (PDX) werden zur Herstellung von Hunderten von microtumors verwendet. Dissociated Zellen (3 x 10 5) oder Neurosphären (40 - 50) wurden in Biogel Perlen (2 mm) eingebettet und nach dem schnellen Gelieren sie kultiviert werden in einem NB-Medium gefüllt benutzerdefinierte Bioreaktor. Die Lebensfähigkeit der Zellen (Calcein-AM), Wachstumsprofil (MTT) und kinomic Aktivität Array-basierte Analyse bestimmt. PDX microtumors gehalten mehrzelligen Organisation und hohe Rentabilität (> 80%) für> 3 Wochen. Wir glauben , dass dies in vivo -ähnlichen Biologie bis zur Wartung von 3D - Zell-Matrix - Architektur beruht (nicht möglich mit 2D- oder Sphäroid Kultur). Es wird auch beobachtet , dass 3D - Tumoren sind schwer mit fragilen gallertartig Proteingerüst zu produzieren, möglicherweise wegen des Mangels an Kollagen I 14. Ein Arbeitsprogramm für microtumor Produktion unter Verwendung von PDX - Zellen und 3D Biogel - System ist in Figur 1 zusammengefaßt und die Dissoziation Verfahren ist in Abbildung 2 dargestellt.
Durch Live Cell Imaging über Calcein-AM, stellten wir fest, das Zellwachstum und die Lebensfähigkeit sowie Auswirkungen der Medikamente auf den GBM-Zellen aus dem JX10 PDX Tumor abgeleitet, wie durch eine Abnahme der Fluoreszenz angegeben ist, den Zelltod zu signalisieren. Das Tumorwachstum wurde am Tag 0, 7 und 14 für die Anzeige microtumors kontinuierliches Wachstum gemessen , wie in 3A gezeigt. Diese microtumor, JX10, ist bekannt, TMZ resistent. Bei Einwirkung von 1 - 10 uM TMZ wurde minimal Wachstumsunterdrückung beobachtet (3B). Jedoch JX12 Testen PDX Tumor, die TMZ als sensitiv bekannt ist, nachgewiesen Empfindlichkeit durch MTT - Assay nach 14 Tagen, die von Calcein-AM - Bildgebung (Figur 4) bestätigt wurde.
er.within-page = "1"> Um mögliche Mechanismen der Arzneimittelresistenz zu untersuchen, maßen wir Kinase-Signalweg in der TMZ-beständigen microtumors (JX10). Kinomic Profile für 144 Tyrosin und 144 Serin / Threonin-Phosphopeptid Ziele wurden für DMSO aufgenommen und 10 uM TMZ behandelt microtumors. Kinomic Phosphorylierung Intensität für alle Peptidziele pro Zyklus und pro mehrere Belichtungszeiten aufgenommen wurde (Daten nicht gezeigt). Eine repräsentative Heatmap Anzeigen Peptide , die deutlich Intensitäten mit 10 uM TMZ Behandlung verändert hatte (p <0,05, ungepaarten t-Test) ist in 5A dargestellt. Kinomic Profile , die in TMZ verändert wurden behandelt JX10 microtumors wurden unter Verwendung des Upstream - kinase Vorhersage - Software analysiert , die SYK, LCK identifiziert und CTK Kinasen wie in TMZ erhöht behandelten Proben relativ zu DMSO (5B). Serin / Threonin - Kinase stromaufwärts Kinoms Analyse wurde ebenfalls durchgeführt (5C).
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Abb . 1: Arbeitsschema für Microtumor Produktion GBM-PDX - Tumoren werden aus dem murinen Wirt distanzierte, und einzelne Zellen werden in Biogel Matrix eingebettet microtumors zu bilden. Die Analysen werden dann auf den microtumors durchgeführt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2:. Die Dissoziation von PDX Tumorzellen Tumore werden von dem Host - Mäuse entfernt und vor gehackten mit Enzymlösung (AG) zu mischen. Die Dissoziation wird nach 40 min (H) gezeigt. Tumorzelle Dissociator gezeigt (I). Trituration in Medien und Filtration (JN) mit einem Ende resu gezeigtlt 0,3 ml Pellet (O) , enthaltend 29,5 x 10 & sup6 ; lebensfähige Zellen (P) , dass die Form Sphäroide in NBM in 24 Stunden (Q). Maßstabsbalken ist 20 & mgr; m. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Das Wachstum von Microtumors JX10 microtumor Wachstums gemessen durch die optische Dichte (OD) von MTT und repräsentative Bilder über 14 Tage sowohl basal (A), und als Reaktion auf 1-10 uM TMZ Behandlung (B).. Die Bilder werden mit 4-facher Vergrößerung (Maßstab = 500 & mgr; m) gezeigt. Die Standardabweichung angegeben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen. 
Abbildung 4:. Das Wachstum von Microtumors JX12 microtumor durch OD von MTT und repräsentative Bilder über 14 Tage gemessen Wachstum, sowohl basal (Tag 1), und als Reaktion auf 0, 1 oder 10 & mgr; M TMZ Behandlung (Maßstab = 500 & mgr; m). Die Standardabweichung angegeben. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 5: Kinomic Profile von TMZ behandelten Microtumors Heatmap engagement integrierten Werte (log 2 umgewandelt Pisten (x 100) von 10, 20, 50, 100 und 200 ms mittlere Signal minus Hintergrund Belichtungswerte) für deutlich angezeigt TMZ-verändert. veränderten Peptide (p <0,05). Rot zeigt erhöht und Blau zeigt an DMSO bedeuten pro Peptid relativ verringert. TMZ veränderte Profile wurden mit dem Upstream-Kinase-Vorhersage-Software und veränderte Kinasen verglichen. Normierte Kinase Statistik (NKS) Score> 1,0 und Spezifität Score> 1.3 (rot) gelten als sehr verändert. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
Kritische Schritte innerhalb des Protokolls betreffen überwiegend Generation zu microtumor sowie Medikamentendosierung und Wartung. Da die microtumor Perlen zerbrechlich sind und leicht zerrissen, ist äußerste Sorgfalt in den beiden Entwicklungsstadien eines Tests und Wartung erforderlich. Wenn ein Fehler während einer dieser Prozesse auftritt, kann experimentell Interpretation beeinträchtigt werden, was zu Nebenstelle oder eine unnötige Wiederholung der Experimente oder sogar Ausschluss von Daten.
Technische Änderungen und Fehlerbehebung, insbesondere des microtumor Entwicklungsprozess umfasste die Planung und Herstellung eines benutzerdefinierten hydrophoben Werkzeug für die Verwendung der microtumor Perlen machen. Dieses Tool ermöglicht eine schnellere und präzisere Produktion von microtumors. Darüber hinaus half kleine Änderungen an der Wartung der microtumors um den Prozess zu beschleunigen, von Mediumwechsel und die Zellen zu dosieren. Einige dieser Modifikationen enthalten, wurden aber nicht beschränkt auf, eine Mehrkanal-Verwendungelektronische Pipette Medium aus den 96-Well-Platten und Vormischen frischen Droge Dosierlösungen und Anordnen der 2x-Lösungen in einer entsprechenden 2 ml 96-Well-Platte zu entfernen und zu ersetzen.
Wesentliche Optimierungen für Kulturbedingungen in 3D-Modellierung umfasst geeignete Dosierungen für Arzneimittelverbindungen zu bestimmen, da es eine schlechte Beziehung zwischen 2D-Modellierung und 3D-Modellierung ist. Daher Reihenverdünnungen eine Dosis Titrationskurve zu etablieren zum Bewegen eines 2D-Modellsystem, um das 3D-Modell microtumor oft notwendig ist.
Potenzielle Probleme mit microtumor Generation von xenoline Tumorzellen aus einer Maus sind bakterielle oder Pilzbefall, inkonsistente Verfügbarkeit von primären xenolines, als einzigartige Wachstumseigenschaften bei Mäusen geerntet zu berücksichtigen Unterschiede in der Erntezeit und die Varianz in Zellausbeuten von separaten dissociations produzieren kann. Bei jeder Zelllinie, die Anzahl der Zellen empfangen werden, und in ähnlicher Weise, wie viele microtumors hergestellt werden will variieren. Als solche gibt es eine Notwendigkeit, Prioritäten zu setzen, welche Tests erforderlich sind und welche sind "optional" sollte die microtumor Ausbeute unzureichend sein. Mögliche Einschränkungen bei der kinomic Profilierung von microtumors umfassen die Schwierigkeit für inerte proteinhaltiges Material Belastung bei der Korrektur, wie die Proben in einer Weise geladen werden, für BCA bestimmt Proteinspiegel zu korrigieren, die nicht zwischen Biogel basierten Proteinen (ECM-Proteine) und die von der unterscheiden kann Zell kinase-Komponente, die gemessen wird, bestimmt werden. Messung des Brutto microtumor Masse über Calcein-AM oder ein Housekeeping-Protein als Korrekturfaktor verwendet, kann dies zu mildern, obwohl Probleme mit Housekeeping-Proteinspiegel in Tumoren kann dies verwechseln verändert wird. Für kurze Zeitverlauf Experimente signalisiert, unter der Annahme gleicher Größe (Kinase-Lebendzellzahl enthält) und paired behandelten und unbehandelten Proben ist dies weniger ein Problem.
Mit dieser Forschung ist es das Ziel, eine kosten e bereitzustellen,ffective und krankheits repräsentativen präklinischen Modell für eine genaue medikamentöse Therapie Tests im Vergleich zu orthotoper Patienten stamm Xenotransplantate, die Prüfung der aktuellen Goldstandardmodell für die GBM. In den letzten Jahren haben mehrere Gruppen versucht , die in vivo - Umgebung GBM für Drogentestzwecke zu modellieren. Einige Gruppen haben einfach versucht , GBM Tumorzellen in nicht-differenzierenden Bedingungen zu wachsen GBM Stammzellen zu erhalten oder zumindest Gehirntumor initiieren Zellen (BTIC) 24,25. Diese tumorsphere oder Neurosphere Kulturen können für Drogentests verwendet werden und sind wahrscheinlich überlegen traditionellen Modellen. Da sie jedoch nach wie vor den Tumor-Stroma-Wechselwirkungen fehlen, die in unserem microtumor Modell erhalten wird, wird der tumorsphere Ansatz noch begrenzt. Andere Gruppen haben versucht , Konstruktionsprinzipien anwenden GBM Modelle 26-28 zu verbessern. Diese Ansätze haben Strömungskammern enthalten, variable ECM-Proteine und Tumorzellen / normale Zellgemischen. Während viel versprechend, fast alle diese Reports verewigt haben Zelllinien mit den Vorbehalten bereits erwähnt verwendet. Als solche sind wir der Meinung, dass die PDX-basierten Modell microtumor hier beschriebenen klinisch relevant ist.
In Zukunft könnte das microtumor Modell entweder als echten Tumor Avatar oder einem "proband" -System verwendet werden. Mit dem proband System entwickelte das PDX von einem bestimmten Patienten nicht direkt dem Arzt informieren über das jeweilige spezifische Therapie des Patienten, wie mit dem Tumor Avatar-System. Stattdessen wird ein Patienten-Tumor "abgestimmt" , um einen bereits bestehenden, gut charakterisierten (beide molekular und phänotypisch) PDX 29. Tatsächlich könnte dieses Modell als "go-to" Avatar dienen oder befinden sich in einer proband Bibliothek als Vergleichsprofil. Mit traditionellen Avatare, einem Patienten die wachsenden Tumorzellen in Mäusen parallel zu der Behandlung des Patienten ist nicht nur zeitaufwendig, da es mehrere Monate für den primären Durchgang nehmen kann, sondern auch kostspielig, da die Prüfung mehrere dTeppich Therapien bei Mäusen erzeugen einen überwältigenden Preisschild. Um dies zu bekämpfen, kann die primäre Patiententumor direkt in die Biogel Matrix implantiert werden. Mit den microtumors könnte Ergebnisse schnell erzeugt werden und zu geringeren Kosten.
Als proband Modell konnten die microtumor Kinoms Datenprofile und Arzneimittelreaktion hinzugefügt werden , in eine proband "Bibliothek" , zusammen mit Profilen und Daten aus früheren 3D in vitro - Modellen, bestehende PDXs, Tierstudien, die andere Patienten usw. Theoretisch könnte der Patient Tumorzellen dann 'schaftlich' (genomisch, kinomically, transcriptomically, etc.) abgestimmt zu einem ähnlichen bestehenden microtumor Profil genaue Behandlung für das bestmögliche Ergebnis zu bestimmen.
Zusammenfassung: Hier erkennen wir, dass diese microtumor Modelle verwendet werden können, sowohl phänotypische Wachstum zu messen und kann sowohl an der basalen-Kinase-Aktivität Ebene und in Reaktion auf die medikamentöse Behandlung abgefragt werden, die nützlich sein können,als translationale Werkzeug für die weitere präklinische Forschung. Die Entwicklung genau und molekular gültige prüfbar Modelle für menschliche Tumoren ist zwingend notwendig für eine effektive Medikamentenentwicklung.
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Acknowledgments
Unterstützt von NIH R21 Zuschuss (PI: C. Willey, CA185712-01), Brain Tumor SPORE Auszeichnung (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) und SBIR Vertrag (PI: R. Singh, N43CO-2.013-00.026).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
| Trypsin EDTA (10x) | Invitrogen | 15400-054 | |
| Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
| N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
| B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
| Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/ml final concentration |
| Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/ml final concentration |
| L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
| Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 µg/ml final concentration |
| Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/ml Penicillin G, 100 µg/ml Streptomycin final concentration |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/ml final concentration |
| MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/ml in PBS and sterile filtered, 1 mg/ml in well |
| SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01 M HCl, 5% in well |
| HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01 M with SDS, 5 mM in well |
| Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 µM in PBS staining solution, 1 µM in well |
| Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
| Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1x with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
| Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
| High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
| Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
| Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
| Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
| Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
| PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10x PK buffer stock in 2.7 ml dH2O, catalog number for PTK reagent kit |
| ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| PTK Additive | PamGene | 32114 | |
| PTK-MM1 tube (10x BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
| Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
| STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
| STK-MM1 tube (100x BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
| Equipment | |||
| #11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
| #3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
| 100 mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
| Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
| Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
| Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
| 3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
| B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
| B-D 50 ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
| PamStation 12 | PamGene | ||
| BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
| Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
| UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
| gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
| Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 ml disposable HARV |
References
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