Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.
The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.
सबसे आम प्राथमिक intracranial घातक ब्रेन ट्यूमर ग्रेड III astrocytomas और ग्रेड चतुर्थ ग्लियोब्लास्टोमा मल्टीफार्मी (ग्लियोब्लास्टोमा या जीबीएम) कर रहे हैं। अमेरिका में 1-3 जीबीएम के लिए वर्तमान चिकित्सा के साथ 15 माह – ये ट्यूमर 12 के बीच मंझला एक साल के अस्तित्व के साथ गरीब prognoses प्रदान करते हैं। Multimodality उपचारों सर्जरी, विकिरण, और temozolomide (TMZ) और काइनेज-लक्षित एजेंट सहित कीमोथेरेपी शामिल हैं। काइनेज सिगनल अक्सर जीबीएम में dysregulated है epidermal वृद्धि कारक रिसेप्टर (EGFR), प्लेटलेट व्युत्पन्न वृद्धि कारक रिसेप्टर (PDGFR) में वृद्धि के संकेत, बढ़ Phosphatidyl-Inositol -3 kinase (PI3K) और प्रवर्धन के साथ ट्यूमर के सबसेट या सक्रिय म्यूटेशन सहित, ट्यूमर संवहनी endothelial वृद्धि कारक रिसेप्टर (VEGFR) के साथ ही अन्य काइनेज संचालित रास्ते 4-6 के माध्यम से एन्जियोजेनिक संकेतन का समर्थन। इन विट्रो में और vivo मॉडल अक्सर ये प्रतिनिधि परिवर्तन खो वर्तमान <sup> 7। इसके अतिरिक्त, आनुवंशिक प्रोफाइलिंग प्रत्याशित लाभ है कि तथ्य यह है कि आनुवंशिक और epigenetic परिवर्तन हमेशा प्रोटीन गतिविधि का स्तर है, जहां सबसे काइनेज को निशाना एजेंटों सीधे अधिनियम में परिवर्तन की भविष्यवाणी नहीं है, और जहां कार्रवाई की अन्य तंत्र के साथ चिकित्सा कार्य कर सकते हैं प्रतिबिंबित कर सकते हैं की पेशकश नहीं किया गया है परोक्ष रूप से।
पारंपरिक अमर सेल लाइन है कि विज्ञापन अनन्त passaged किया जा सकता भर के रखरखाव और reproducibility के अपने आसानी के कारण दवा के परीक्षण के लिए मानक किया गया है। हालांकि, इस मॉडल एक उच्च पोषक तत्व (और कृत्रिम) विकास वातावरण है कि तेजी से कोशिकाओं है कि मूल ट्यूमर से काफी भिन्न उगाने के लिए चुनता से ग्रस्त है। जैसे, वहाँ और अधिक यथार्थवादी मॉडल प्रणाली के रूप में रोगी में मौजूद है कि एक अधिक जटिल ट्यूमर जैविक प्रणाली को प्रतिबिंबित विकसित करने में काफी रुचि रही है। ट्यूमर xenografts एक प्राथमिक ट्यूमर चूहों में उगाया ( "xenoline," मरीज व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट या PDX) प्रावधानों से सीधे विकसितडी एक अधिक चिंतनशील मॉडल प्रणाली, विशेष रूप से कैंसर चिकित्सा विज्ञान की स्थापना में, के रूप में वे और अधिक मज़बूती से नैदानिक सफलता की भविष्यवाणी करने के लिए। 8 अधिक चिंतनशील जीव विज्ञान के बावजूद महसूस कर रहे हैं, इन मॉडलों महंगे हैं और स्थापित करने और बनाए रखने के लिए मुश्किल हो जाता है। इसके अलावा, वे उच्च throughput अध्ययन करने के लिए उत्तरदायी नहीं हैं। जरूरत को बेहतर जीवविज्ञान का मॉडल है कि अधिक सही प्राथमिक ट्यूमर में आणविक परिवर्तन को प्रतिबिंबित, और प्रोफ़ाइल के लिए और kinase गतिविधि के प्रत्यक्ष उपायों का उपयोग इन मॉडलों का परीक्षण, आनुवंशिक मार्करों सरोगेट नहीं विकसित करने के लिए, स्पष्ट है।
यह अच्छी तरह से मान्यता प्राप्त है कि दो-आयामी (2 डी) monolayer संस्कृतियों के विपरीत, 3 डी या बहुकोशिकीय परख मॉडल और अधिक physiologically प्रासंगिक समापन 9-11 प्रदान कर सकते हैं। आम 3D संस्कृति मैट्रिक्स लेपित microcarriers और सेल अंडाकार आकृति के गठन को शामिल दृष्टिकोण। ट्यूमर spheroids स्पिनर फ्लास्क, pHEMA प्लेट का उपयोग और ड्रॉप तकनीक फांसी सेलुलर एकत्रीकरण के माध्यम से उत्पन्न किया जा सकता है। टी के लिए सीमाओंhese दृष्टिकोण शामिल हैं: कुछ कोशिकाओं स्थिर spheroids, परिवर्तनशीलता विकास में और मिश्रित प्रकार की कोशिकाओं के साथ चुनौतियों के रूप में करने के लिए असमर्थता। वैकल्पिक रूप से, कई सिंथेटिक (हाइड्रोजेल, बहुलक) और पशु व्युत्पन्न Engelbreth-होल्म-झुंड (EHS) माउस सार्कोमा से मैट्रिक्स, गोजातीय कोलेजन) matrices 3 डी संस्कृति के लिए विकसित किया गया है अध्ययन 12-14। माउस EHS मैट्रिक्स बड़े पैमाने पर इस्तेमाल किया लेकिन इन विट्रो और इन विवो 15 में सेल के विकास और भेदभाव को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है।
आदेश में 3 डी ट्यूमर जीव विज्ञान को दोहराने के लिए, एक मानव biomatrix प्रणाली डॉ। राज सिंह एट अल 16 से विकसित किया गया था। प्राकृतिक, वृद्धि कारक मुक्त मानव biogel 3D संस्कृति scaffolds (मोती, डिस्क) है, जो अनेक प्रकार की कोशिकाओं के लंबे समय तक खेती का समर्थन करता है। 3 डी मानव biogel संस्कृति डिजाइन की एक श्रृंखला ट्यूमर के विकास, आसंजन, angiogenesis और आक्रमण गुण के अध्ययन के लिए स्थापित कर रहे हैं। फायदे और मानव biogel के गुणों को आम की तुलना मेंमाउस EHS जैल तालिका 1 और 2 टेबल में संक्षेप हैं।
स्रोत: | मानव Amnions (जमा ऊतक) पैथोजन मुक्त, आईआरबी मुक्त / अनुमोदित |
ईसीएम प्रकृति: | गैर विकृत Biogel (जीएलपी उत्पादन) |
कुंजी अवयव: | कर्नल-मैं (38%), laminin (22%), कर्नल IV (20%), कर्नल III (7%), Entactin और HSPG (<3%) |
GF-मुक्त: | Undetectable EGF, FGF, TGF, वीईजीएफ़, PDGF (गैर-एन्जियोजेनिक, गैर विषैले) |
तालिका 1: मानव Biogel के गुण के रूप में आम EHS जैल की तुलना में।
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-wiवें-next.within-पेज = "हमेशा">तालिका 2: मानव Biogel के लाभ के रूप में आम EHS जैल की तुलना में।
प्रोटोकॉल के भीतर महत्वपूर्ण कदम मुख्य रूप से पीढ़ी है, साथ ही दवा खुराक और रखरखाव microtumor से संबंधित हैं। क्योंकि microtumor मोती नाजुक और आसानी से फाड़ रहे हैं, अत्यधिक ध्यान दोनों एक परख और रखरखाव के विकास के च?…
The authors have nothing to disclose.
, ब्रेन ट्यूमर बीजाणु पुरस्कार (पीडी: GY गिलेस्पी, P20CA 151129-03) और एसबीआईआर अनुबंध (पीआई: आर सिंह, N43CO-2013-00026): एनआईएच R21 अनुदान (सी विले, CA185712-01 पीआई) द्वारा समर्थित है।
Collagenase-I | Sigma-Aldrich | CO130 | |
Trypsin EDTA (10X) | Invitrogen | 15400-054 | |
Neurobasal-A | Life Technologies | 10888-022 | |
N-2 Supplement | Life Technologies | 17502-048 | 1x final concentration |
B-27 Supplement w/o Vitamin A | Life Technologies | 12587-010 | 1x final concentration |
Recombinant Human FGF-basic | Life Technologies | PHG0266 | 10 ng/mL final concentration |
Recombinant Human EGF | Life Technologies | PGH0315 | 10 ng/mL final concentration |
L-Glutamine | Corning Cellgro Mediatech | 25-005-CI | 2 mM final concentration |
Fungizone | Omega Scientific | FG-70 | 2.5 ug/mL final concentration |
Penicillin Streptomycin | Omega Scientific | PS-20 | 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | 50 ng/mL final concentration |
MTT | Life Technologies | M6494 | prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well |
SDS | Fisher | BP166 | for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well |
HCl | Fisher | A144SI-212 | for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well |
Calcein AM | Life Technologies | C1430 | 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well |
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail | Pierce ThermoScientific | 78420 | 1:100 ratio in MPER |
Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce ThermoScientific | 87786 | 1:100 ratio in MPER |
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Pierce ThermoScientific | PI78501 | |
Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
DMSO | Fisher | BP231 | for dissolution of calcein AM & compounds |
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg | Lonza | 17-517Q | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture) |
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg | Corning Cellgro Mediatech | 20-030-CV | diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash) |
10% Neutral Buffered Formalin | Protocol | 032-060 | |
Trypan Blue | Pierce ThermoScientific | 15250-061 | |
High Density Hubiogel | Vivo Biosciences | HDHG-5 | |
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor | Pierce | 78420 | |
Halt's Protein Protease Inhibitor | Pierce | 87786 | |
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) | Thermo Scientific | 78501 | |
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip | PamGene | 86312 | |
PTK kinase buffer | PamGene | 36000 | 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit |
ATP | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
PY20- FITC-conjugated antibody | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
PTK Additive | PamGene | 32114 | |
PTK-MM1 tube (10X BSA) | PamGene | 36000 | catalog number for PTK reagent kit |
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip | PamGene | 87102 | |
STK kinase buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
FITC-conjugated Secondary Antibody | PamGene | 32203 | |
STK-MM1 tube (100X BSA) | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
STK Antibody Buffer | PamGene | 32205 | catalog number for STK reagent kit |
Equipment | |||
#11 Blades, sterile | Fisher | 3120030 | |
#3 scalpel handles, sterile | Fisher | 08-913-5 | |
100mm glass Petri dishes | Fisher | 08-748D | |
Semicurved forceps | Fisher | 12-460-318 | |
Trypsinizing flask | Fisher | 10-042-12B | |
Magnetic stirrer | Fisher | 14-490-200 | |
3/4" stir bar | Fisher | 14-512-125 | |
B-D cell strainer | Fisher | #352340 | |
B-D 50ml Centrifuge tube | Fisher | #352098 | |
PamStation 12 | PamGene | ||
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software | PamGene | ||
Evolve Kinase Assay Software | PamGene | ||
UpKin App software (upstream kinase prediction) | PamGene | ||
gentleMACS Dissociator | Miltenyi Biotec | 130-093-235 | |
Rotary Cell Culture System (RCCS) | Synthecon | RCCS-D | with 10 mL disposable HARV |