Summary

Generering av Microtumors Bruke 3D Menneskelig Biogel Kultur System og pasient-avledet glioblastom celler for Kinomic Profilering and Drug Response Testing

Published: June 09, 2016
doi:

Summary

Patient-derived xenografts of glioblastoma multiforme can be miniaturized into living microtumors using 3D human biogel culture system. This in vivo-like 3D tumor assay is suitable for drug response testing and molecular profiling, including kinomic analysis.

Abstract

The use of patient-derived xenografts for modeling cancers has provided important insight into cancer biology and drug responsiveness. However, they are time consuming, expensive, and labor intensive. To overcome these obstacles, many research groups have turned to spheroid cultures of cancer cells. While useful, tumor spheroids or aggregates do not replicate cell-matrix interactions as found in vivo. As such, three-dimensional (3D) culture approaches utilizing an extracellular matrix scaffold provide a more realistic model system for investigation. Starting from subcutaneous or intracranial xenografts, tumor tissue is dissociated into a single cell suspension akin to cancer stem cell neurospheres. These cells are then embedded into a human-derived extracellular matrix, 3D human biogel, to generate a large number of microtumors. Interestingly, microtumors can be cultured for about a month with high viability and can be used for drug response testing using standard cytotoxicity assays such as 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) and live cell imaging using Calcein-AM. Moreover, they can be analyzed via immunohistochemistry or harvested for molecular profiling, such as array-based high-throughput kinomic profiling, which is detailed here as well. 3D microtumors, thus, represent a versatile high-throughput model system that can more closely replicate in vivo tumor biology than traditional approaches.

Introduction

De vanligste primære intrakraniale ondartede hjernesvulster er klasse III astrocytomas og klasse IV glioblastoma multiforme (glioblastom eller GBM). Disse svulstene har dårlige prognoser med median ett-års overlevelse mellom 12 – 15 måneder med dagens terapi for GBM i USA 1-3. Multimodalitet behandlinger inkluderer kirurgi, stråling og kjemoterapi, inkludert temozolomid (TMZ) og kinase-målrettede midler. Kinase signalering blir ofte dysregulerte i GBM, blant annet undersett av tumorer med forsterkning eller aktiverende mutasjoner i epidermal vekstfaktor reseptor (EGFR), en økning i blodplateavledet vekstfaktor reseptor (PDGFR) signalering, økt Phosphatidyl-inositol-3-kinase (PI3K) og tumorbærende angiogen signalering gjennom vaskulær endotel vekstfaktor reseptor (VEGFR) så vel som andre kinase drevet veier 4-6. Current in vitro- og in vivo-modeller ofte miste disse representative forandringer <sup> 7. I tillegg har genetisk profilering ikke tilbudt forventede fordeler som kan gjenspeile det faktum at genetiske og epigenetiske endringene ikke alltid forutsi endringer på nivået av protein aktivitet, der de fleste kinase målsøkende midler handle direkte, og hvor behandling med andre virkningsmekanismer kan handle indirekte.

Den tradisjonelle udødeliggjort cellelinje som kan passeres ad infinitum har lenge vært standard for narkotika testing på grunn av deres enkle vedlikehold og reproduserbarhet. Imidlertid lider denne modellen fra et høyt næringsinnhold (og kunstig) vekst miljø som selekterer for hurtigvoksende celler som avviker sterkt fra den opprinnelige tumor. Som sådan, har det vært betydelig interesse for å utvikle mer realistiske modellsystemer som reflekterer en mer kompleks svulst biologisk system som er til stede i pasienten. Tumorxenotransplantater utviklet direkte fra en primær svulst vokst i mus ( "xenoline," pasient-avledet xenograft eller PDX) provide en mer reflekterende modellsystem, spesielt i innstillingen av kreftbehandling, som de følte seg til mer pålitelig måte å forutsi klinisk suksess. 8 Til tross for den mer reflekterende biologi, disse modellene er kostbare, og er vanskelig å etablere og vedlikeholde. Dessuten er de ikke mottagelig for high-throughput-studier. Behovet for å bedre utvikle biologiske modeller som mer nøyaktig gjenspeiler molekylære endringer i de primære svulster, og for å profilere og teste disse modellene bruker direkte tiltak av kinase aktivitet, ikke surrogat genetiske markører, er klart.

Det er velkjent at i motsetning til to-dimensjonale (2D) monolagskulturer, kan 3D- eller flercellede analysemodeller gi mer fysiologisk relevante endepunkter 9-11. Felles 3D kultur tilnærminger involvere matrix-belagt mikro og celle spheroid formasjon. Tumor kuler kan genereres via mobilnettet aggregering bruker spinner kolbe, PHEMA plate og henger slipp teknikker. Begrensninger for these tilnærminger inkluderer: manglende evne for noen celler til å danne stabile kuler, variasjon i vekst og utfordringer med blandede celletyper. Alternativt mange syntetiske (hydrogel, polymer) og dyr-avledet Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) matrise fra mus sarkomer, kollagen) matriser er utviklet for 3D kultur studerer 12-14. Mus EHS matrise blir brukt i stor utstrekning, men er kjent for å fremme cellevekst og differensiering in vitro og in vivo 15.

For å gjenskape 3D tumorbiologi, ble et menneske BioMatrix system utviklet av Dr. Raj Singh et al. 16. Den naturlige, vekstfaktor-frie menneske Biogel tillater 3D kultur stillaser (perler, plater), som støtter langsiktig dyrking av flere celletyper. En serie av 3D menneske Biogel kultur design er etablert for å studere tumorvekst, vedheft, angiogenese og invasjon egenskaper. Fordeler og egenskaper til human Biogel sammenlignet med vanligmus EHS geler er oppsummert i tabell 1 og tabell 2.

Kilde: Menneskelig Amnions (Felles vev)
Patogen-fri, IRB-fritak / godkjent
ECM naturen: Non-denaturert Biogel (GLP-produksjon)
Nøkkel
komponenter:
Col-I (38%), Laminin (22%), Col-IV (20%), Col-III (7%), Entactin og HSPG (<3%)
GF-free: Undetectable EGF, FGF, TGF, VEGF, PDGF (Non-angiogen, Giftfri)

Tabell 1: Egenskaper for menneskelig Biogel i forhold til vanlige HMS-Gel.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-side = "always"> menneskelig Biogel HMS gels Naturlig menneskelig matrise Rekonstituert mus matrise Kontrollert cellevekst og differensiering Kan fremme cellevekst og differensiering Fysiologisk genuttrykk Variabel genuttrykk 3D vev-lignende kulturmodell Plate-baserte kulturmodell

Tabell 2: Fordeler med Menneskelig Biogel i forhold til vanlige HMS-Gel.

Protocol

MERK: Alle xenograft terapi evalueringer ble gjort ved hjelp av en orthotopic tumormodell for glioblastom på en protokoll godkjent av Institutional Animal Care og bruk komité. 1. Isolering av pasient-avledet GBM xenograft Cells Utarbeidelse av reagenser Re-utgjøre kollagenase-I i sterilt vann til en konsentrasjon på 5 mg / ml og sterilfilter. Lagres i 1 ml alikvoter ved -20 ° C (endelig konsentrasjon er 50 ug / ml i 100 ml enzymoppløsning). <li…

Representative Results

Vi har vist at 3D Biogel kultur systemet støtter langsiktig vekst og funksjon av flere celletyper. I dette samarbeidsprosjektet, er pasient avledet GBM xenolines (PDX) brukes for å produsere hundrevis av microtumors. Dissosierte celler (3 x 10 5) eller neurosfærer (40 – 50) ble innleiret i Biogel perler (2 mm), og etter rask gele de dyrkes i en NB-media fylt tilpasset bioreaktor. Cellular levedyktighet (Calcein-AM), vekstprofil (MTT), og kinomic aktivitet rekke basert analy…

Discussion

Kritiske trinnene i protokollen overveiende knyttet til microtumor generasjon, så vel som medikamentdosering og vedlikehold. Fordi microtumor perler er skjøre og lett revet, er ekstrem forsiktighet nødvendig i både utviklingsstadier av en analyse og vedlikehold. Hvis det oppstår en feil under en av disse prosessene kan eksperimentell tolkning bli kompromittert, forårsaker utvidelse eller unødvendig repetisjon av forsøkene eller eksklusjon av data.

Modifikasjoner og feilsøking, spesi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Støttet av NIH R21 stipend (PI: C. Willey, CA185712-01), hjernesvulst SPORE award (PD: GY Gillespie, P20CA 151129-03) og SBIR kontrakt (PI: R. Singh, N43CO-2013-00026).

Materials

Collagenase-I  Sigma-Aldrich CO130
Trypsin EDTA (10X) Invitrogen 15400-054 
Neurobasal-A Life Technologies 10888-022
N-2 Supplement Life Technologies 17502-048 1x final concentration
B-27 Supplement w/o Vitamin A Life Technologies 12587-010 1x final concentration
Recombinant Human FGF-basic Life Technologies PHG0266 10 ng/mL final concentration
Recombinant Human EGF Life Technologies PGH0315 10 ng/mL final concentration
L-Glutamine Corning Cellgro Mediatech 25-005-CI 2 mM final concentration
Fungizone Omega Scientific FG-70 2.5 ug/mL final concentration
Penicillin Streptomycin Omega Scientific PS-20 100 U/mL Penicillin G, 100 ug/mL Streptomycin final concentration
Gentamicin Life Technologies 15750-060 50 ng/mL final concentration
MTT Life Technologies M6494 prepared to 5 mg/mL in PBS and sterile filtered, 1 mg/mL in well
SDS Fisher BP166 for MTT lysis buffer, prepared to 10% in 0.01M HCL, 5% in well
HCl Fisher A144SI-212 for MTT lysis buffer, prepared to 0.01M with SDS, 5 mM in well
Calcein AM Life Technologies C1430 1 mM in DMSO stock, 2 uM in PBS staining solution, 1 uM in well
Halt’s Protein Phosphatase Inhibitor cocktail  Pierce ThermoScientific 78420 1:100 ratio in MPER 
Halt's Protein Protease Inhibitor  Pierce ThermoScientific 87786 1:100 ratio in MPER
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Pierce ThermoScientific PI78501
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
DMSO Fisher BP231 for dissolution of calcein AM & compounds
Phosphate-Buffered Saline without Ca/Mg Lonza 17-517Q diluted to 1X with MiliQ ultrapure water and sterile filtered (for cell culture)
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline with Ca/Mg Corning Cellgro Mediatech 20-030-CV diluted to 1X with MiliQ ultrapure water (for pre-fixation wash)
10% Neutral Buffered Formalin Protocol 032-060
Trypan Blue Pierce ThermoScientific 15250-061
High Density Hubiogel Vivo Biosciences HDHG-5
Halt's Protein Phosphatase Inhibitor Pierce 78420
Halt's Protein Protease Inhibitor Pierce 87786
Mammalian Protein Extraction Reagent (MPER) Thermo Scientific 78501
Protein Tyrosine Kinase (PTK) Array Profiling chip PamGene 86312
PTK kinase buffer PamGene 36000 300 µl 10X PK buffer stock in 2.7 ml dH20, catalog number for PTK reagent kit
ATP PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PY20- FITC-conjugated antibody PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
PTK Additive PamGene 32114
PTK-MM1 tube (10X BSA) PamGene 36000 catalog number for PTK reagent kit
Serine/Threonine Kinase (STK) Array Profiling chip PamGene 87102
STK kinase buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Primary Antibody Mix (DMAB tube) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
FITC-conjugated Secondary Antibody PamGene 32203
STK-MM1 tube (100X BSA) PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
STK Antibody Buffer PamGene 32205 catalog number for STK reagent kit
Equipment
#11 Blades, sterile Fisher 3120030
#3 scalpel handles, sterile Fisher 08-913-5
100mm glass Petri dishes Fisher 08-748D
Semicurved forceps Fisher 12-460-318
Trypsinizing flask Fisher 10-042-12B
Magnetic stirrer Fisher 14-490-200
3/4" stir bar Fisher 14-512-125
B-D cell strainer  Fisher #352340
B-D 50ml Centrifuge tube Fisher #352098
PamStation 12 PamGene
BioNavigator 6.0 kinomic analysis software  PamGene
Evolve Kinase Assay Software PamGene
UpKin App software (upstream kinase prediction) PamGene
gentleMACS Dissociator Miltenyi Biotec 130-093-235
Rotary Cell Culture System (RCCS) Synthecon RCCS-D with 10 mL disposable HARV

References

  1. Ohgaki, H., Kleihues, P. Population-based studies on incidence, survival rates, and genetic alterations in astrocytic and oligodendroglial gliomas. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (6), 479-489 (2005).
  2. Wen, P. Y., Kesari, S. Malignant gliomas in adults. N Engl J Med. 359 (5), 492-507 (2008).
  3. Thumma, S. R., et al. Effect of pretreatment clinical factors on overall survival in glioblastoma multiforme: a Surveillance Epidemiology and End Results (SEER) population analysis. World J Surg Oncol. 10 (75), (2012).
  4. Furnari, F. B., Cloughesy, T. F., Cavenee, W. K., Mischel, P. S. Heterogeneity of epidermal growth factor receptor signalling networks in glioblastoma. Nat Rev Cancer. 15 (5), 302-310 (2015).
  5. Mischel, P. S., Cloughesy, T. F., Nelson, S. F. DNA-microarray analysis of brain cancer: molecular classification for therapy. Nat Rev Neurosci. 5 (10), 782-792 (2004).
  6. Verhaak, R. G., et al. Integrated genomic analysis identifies clinically relevant subtypes of glioblastoma characterized by abnormalities in PDGFRA, IDH1, EGFR, and NF1. Cancer Cell. 17 (1), 98-110 (2010).
  7. De Witt Hamer, P. C., et al. The genomic profile of human malignant glioma is altered early in primary cell culture and preserved in spheroids. Oncogene. 27 (14), 2091-2096 (2008).
  8. Shankavaram, U. T., et al. Molecular profiling indicates orthotopic xenograft of glioma cell lines simulate a subclass of human glioblastoma. J Cell Mol Med. 16 (3), 545-554 (2012).
  9. Abbott, A. Cell culture: biology’s new dimension. Nature. 424 (6951), 870-872 (2003).
  10. Rao, S. S., Lannutti, J. J., Viapiano, M. S., Sarkar, A., Winter, J. O. Toward 3D biomimetic models to understand the behavior of glioblastoma multiforme cells. Tissue Eng Part B Rev. 20 (4), 314-327 (2014).
  11. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (10), 839-845 (2007).
  12. Hollister, S. J. Porous scaffold design for tissue engineering. Nat Mater. 4 (7), 518-524 (2005).
  13. Rowley, J. A., Madlambayan, G., Mooney, D. J. Alginate hydrogels as synthetic extracellular matrix materials. Biomaterials. 20 (1), 45-53 (1999).
  14. Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture. Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).
  15. Yoshino, J. E., et al. Proliferation and differentiation of a transfected Schwann cell line is altered by an artificial basement membrane. Glia. 3 (5), 315-321 (1990).
  16. Siegal, G. P., Singh, R., Foundation, T. U. R. Biologically active native biomatrix composition. US patent. , (2010).
  17. Sarkaria, J. N., et al. Use of an orthotopic xenograft model for assessing the effect of epidermal growth factor receptor amplification on glioblastoma radiation response. Clin Cancer Res. 12 (7), 2264-2271 (2006).
  18. Strober, W. Trypan Blue Exclusion Test of Cell Viability. Curr Protoc Immunol. 111, 1-3 (2015).
  19. Anderson, J. C., et al. Kinomic exploration of temozolomide and radiation resistance in Glioblastoma multiforme xenolines. Radiother Oncol. 111 (3), 468-474 (2014).
  20. Anderson, J. C., et al. Kinomic profiling of electromagnetic navigational bronchoscopy specimens: a new approach for personalized medicine. PLoS One. 9 (12), 116388 (2014).
  21. Jarboe, J. S., et al. Kinomic profiling approach identifies Trk as a novel radiation modulator. Radiother Oncol. 103 (3), 380-387 (2012).
  22. Anderson, J. C., et al. High Throughput Kinomic Profiling of Human Clear Cell Renal Cell Carcinoma Identifies Kinase Activity Dependent Molecular Subtypes. PLoS One. 10 (9), 0139267 (2015).
  23. Anderson, J. C., et al. Kinomic Alterations in Atypical Meningioma. Medical Research Archives. 3, (2015).
  24. Hothi, P., et al. High-throughput chemical screens identify disulfiram as an inhibitor of human glioblastoma stem cells. Oncotarget. 3 (10), 1124-1136 (2012).
  25. Quartararo, C. E., Reznik, E., deCarvalho, A. C., Mikkelsen, T., Stockwell, B. R. High-Throughput Screening of Patient-Derived Cultures Reveals Potential for Precision Medicine in Glioblastoma. ACS Med Chem Lett. 6 (8), 948-952 (2015).
  26. Ma, L., et al. Towards personalized medicine with a three-dimensional micro-scale perfusion-based two-chamber tissue model system. Biomaterials. 33 (17), 4353-4361 (2012).
  27. Pedron, S., Becka, E., Harley, B. A. Regulation of glioma cell phenotype in 3D matrices by hyaluronic acid. Biomaterials. 34 (30), 7408-7417 (2013).
  28. Rape, A., Ananthanarayanan, B., Kumar, S. Engineering strategies to mimic the glioblastoma microenvironment. Adv Drug Deliv Rev. 79-90, 172-183 (2014).
  29. Willey, C. D., Gilbert, A. N., Anderson, J. C., Gillespie, G. Y. Patient-Derived Xenografts as a Model System for Radiation Research. Semin Radiat Oncol. 25 (4), 273-280 (2015).

Play Video

Cite This Article
Gilbert, A. N., Shevin, R. S., Anderson, J. C., Langford, C. P., Eustace, N., Gillespie, G. Y., Singh, R., Willey, C. D. Generation of Microtumors Using 3D Human Biogel Culture System and Patient-derived Glioblastoma Cells for Kinomic Profiling and Drug Response Testing. J. Vis. Exp. (112), e54026, doi:10.3791/54026 (2016).

View Video