Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этика
Вся работа проводилась в рамках утверждения внутренних дел Великобритании животных (научные процедуры) Закон 1986 года и Лондонской школы гигиены и тропической медицины защиты животных и Совета по рассмотрению этики. ARRIVE руководство следуют в настоящем докладе.

1. В Vivo Прохождение Биолюминесцентный Trypanosoma brucei brucei

  1. Удалить криоконсервированное запас (называемый stabilate) Т. б. brucei штамм GVR35-VSL-2 (можно получить у профессора Джона Келли на Лондонской школы гигиены и тропической медицины через MTA) 9 из жидкого азота и позволяют уравновешиваться до комнатной температуры. Развести stabilate до 2 х 10 4 трипаносом / мл в стерильном фосфатно - солевого буферного раствора глюкозы (PBS-G) , рН 8,0 (1 л PBS + 15 г глюкозы) 10.
    Примечание: T. б. brucei GVR35-VSL-2 не является заразным для человека и требует SAPO лицензированных объектов для проведения экспериментов.
  2. InjЭСТ 20-25 г женская CD1 мышь с 0,2 мл разбавленных трипаносом через внутрибрюшинно (IP) с иглой 25 G. Это "донор мыши". Поместите зараженную мышь в специфических патогенов (SPF) -cage и корма вволю.
    Примечание: мышей CD1 являются беспородных штамм и T. б. brucei GVR35 инфекции хорошо характеризуются в этом штамме. Тем не менее, этот протокол также применим к инбредных или генетически модифицированных штаммов, но важно отметить , что цвет меха может оказать влияние на чувствительность визуализации 6,9.
  3. Монитор периферической паразитемии путем забора крови. Поместите мышь в пластиковый фиксатор и возьмите 5 мкл крови из хвоста путем венепункции с 21 G иглой или кровопускание и смешивают с 1/10 0,85% хлорида аммония стерильными лизировать эритроциты и позволяют легче считать.
  4. Подсчитайте разведенной крови в Нойбауэра гемоцитометра.
    1. Загрузите разбавленную кровь в обеих палатах. Подсчитайте всю центральную гридентификатор одной камеры , чтобы дать п трипаносом. Концентрация трипаносом в крови = N × 10 4 трипаносом / мл, отрегулировать для любого коэффициента разбавления и вычислить среднее из двух палат.
      Примечание: Примерно через 5-7 дней после заражения, периферическая паразитемия должна подниматься достаточно , чтобы осуществить инфекцию в концентрации 2 × 10 4 трипаносом / мл.
  5. Когда трипаносом уровни достаточно для количества мышей требуется высокая, переходите к шагу 1.6. Уровень паразитемия 6 × 10 4 трипаносом / мл в одной мыши - донора достаточно для заражения 10 мышей.
    Примечание: Для получения статистически значимых размеров группы, п = 6 для каждой группы лечения мышей необходимы 8. Для других моделей инфекции, расчеты мощности должны были бы быть применены для определения соответствующих размеров групп.
  6. Место мышей в коробку тепла (при 28-30 ° С в течение примерно 5-10 мин), чтобы позволить хвостовые вены расширяются.Для индукции анестезии терминала, администрирование 20 мг / кг пентобарбитала внутривенно с иглой 25 G. Подтвердите мышь под наркозом, осторожно нажимая, чтобы обеспечить разбойников нет вывода рефлекс.
  7. Heparinize 21-G иглу на аликвоты по 5 мл гепарин в количестве 5000 USP ед / мл в трубку Bijou и сосать два раза в и из иглы, прикрепленной к 1 мл шприца.
  8. Возьмем гепаринизированной 21 G иглу и шприц емкостью 1 мл, и выполняют пункции сердца на анестезированных прохода мыши путем вставки иглы по центру под грудной клеткой (шарик крови скапливались в основании иглы) и осторожно потянуть назад на поршень чтобы не свернуть камеры сердца. Соберите как минимум 0,7 мл крови.
  9. Развести инфицированной крови для получения инокулята 2 х 10 4 трипаносом / мл в PBS-G рН 8,0 , как шаг 1.1 выше.
    Примечание: В этот момент, оставшаяся кровь может быть криосохранить производить stabilate путем смешивания с 8% глицерина, 20% инактивированной нагреванием фетальной чаЛФ в сыворотке крови (привет-FCS) и 72% инфицированной крови. Медленно замерзать при температуре -80 ° C с использованием медленного замораживание контейнера для достижения скорости охлаждения -1 ° С / мин, до передачи в жидкий азот.

2. Заражение подопытных мышей

  1. Поместите CD1 самок мышей (~ 21-25 г) в коробку нагрева мягко теплой, чтобы расширить вены. Поместите прогреваемых мышей в пластиковую сдержанностью и вводят 0,2 мл разбавленного прививочный внутривенно с 25 G иглой в хвостовую вену, что эквивалентно 4000 трипаносом на мышь. Установите давление в месте инъекции после этого, чтобы остановить кровотечение.
    Примечание: Внутрибрюшинный инфекция является допустимым путем заражения и использовалась в предыдущих исследованиях 10, но мы обнаружили , что это менее воспроизводимыми , чем при внутривенном введении.
  2. Перемешайте зараженных мышей и клетки в группах по 3 в SPF-вентилируемых клетках. В качестве контроля, вводят CD1 самок мышей дикого типа не-биолюминесцентном паразита, T. б. brucei GVR35 (п =3).
  3. Монитор инфекции через кровь Фильма микроскопией
    1. Пятно 5 мкл крови из венепункции или кровопускание на предметное стекло и выполнить мазок крови (с использованием второго предметного стекла осторожно толкать каплю крови через слайд, чтобы произвести тонкую пленку). Разрешить слайды высохнуть на воздухе.
    2. Закрепите мазок крови с 100% -ным метанолом и красителем Гимза в течение 10 мин перед полосканием с дН 2 O и дайте высохнуть на воздухе. В соответствии с целью 100X подсчитать количество трипаносом в 10 полях зрения (FOV).
      Примечание: Кровь киносъемки осуществляется параллельно неинвазивной визуализации целого животного, как уже через день после заражения. При обработке ряда животных, этот метод трипаносом количественному предпочтительнее подсчета гемоцитометра, как образцы можно хранить при комнатной температуре, и подсчитывали позже.

3. биолюминесценции визуализации для отслеживания инфекции

Примечание: Для того, чтобы контролировать инфекцию, весь АнимAl неинвазивной визуализации могут быть использованы.

  1. Готовят раствор D-люциферин, светлячка субстрата люциферазы, в Дульбекко фосфатно-солевом буферном (DPBS) в дозе 30 мг / мл. Фильтр стерилизовать и заморозить в аликвотах при -20 ° C.
    Примечание: D-Люциферин чувствителен к свету, поэтому защитить его от света, обернув аликвот в фольгу. Не раз при замораживании-оттаивании люциферин , как это может повлиять на активность 11.
  2. Подогреть аликвоты D-люциферин до комнатной температуры. Удалите каждую мышь из клетки (в том числе и у контрольных мышей, инфицированных штаммом nonbioluminescent паразита дикого типа) и вводят 150 мг / кг разогретой D-люциферин (разведенного в ДЗФР) внутрибрюшинно с иглой 25 G. Поместите мышей в изофлуораном камере в течение примерно 5 минут , чтобы вызвать анестезию 2% изофлуораном / O 2 смеси на уровне 2,5 л / мин.
    Примечание: Мыши становятся неподвижными, когда они находятся под анестезией. Для формирования изображений, используемых здесь, 3 мыши могут быть обработаны одновременно. Если мыши anesthetдартизованных в течение более 30 мин, глазная мазь искусственная слеза может быть применен, чтобы предотвратить глаза мышей от высыхания.
  3. Для формирования изображения, описанного здесь, откройте программное обеспечение и инициализировать машину с помощью программного обеспечения в соответствии с инструкциями изготовителя. Получение изображений один раз камера и нагревают пластины достигли температуры.
    Примечание: Этот прибор обычно не выключается, что позволяет машине выполнять фоновые калибровки в течение ночи. В том случае, если ему необходимо перезапустить, он должен выполнить проверку калибровки в первую очередь.
  4. Поместите наркозом мышей в томографа (см 3.5). Используйте большие черные разделители между мышами, чтобы свести к минимуму протечки любого яркого биолюминесцентного сигнала. Мыши изображений с помощью набора времени воздействия; 1, 3, 10, 30, 60 и 180 секунд со средней степенью биннинга, 1 F / остановки и открытого фильтра, и поле зрения Е (12,5 х 12,5 см 2).
    Примечание: Контрольные мыши, инфицированные диким типом nonbioluminescent GVR35 паразитов обеспечивают backgrЗначение биолюминесценции круглый вырез. Из эксперимента кинетики люциферин (рис 6) с этой моделью, мы обнаружили , что пики биолюминесценции сигнала на 10 минут после введения и обработки изображений занимает около 5 мин для 3 мышей. Возьмите эту временную шкалу во внимание при обезболивающее и визуализации мышей.
  5. Для того, чтобы обеспечить тщательное съемку мышей, вращать, чтобы получить вентральной, спинной и боковой вид. Поддержание последовательности в порядке ориентации для визуализации между последовательными животных.
  6. После обработки изображений, позволяют мышей восстановиться после анестезии под наблюдением перед возвращением в SPF-клетки.
  7. Продолжайте визуализации мышей через каждые 7 дней до 21-й день после заражения. Там должно быть постоянное увеличение сигнала биолюминесценции в течение всего животного.
  8. На D21, изображение и мазке крови у мышей, как описано выше, и дозы мышей с 40 мг / кг Диминазина aceturate внутрибрюшинно. Этот препарат очистит периферической паразитемии, но не будет пересекать крови-BRAIп барьера, и, следовательно, обеспечивает лучшую визуализацию инфекции ЦНС.
    Примечание: Диминазина aceturate является устоявшейся препарат, используемый для лечения на ранней стадии трипаносомоз животных.
  9. Продолжить визуализации и мониторинга на D28 и D35.

4. Подтверждая ЦНС инфекции

  1. На D35, изображения мышей, как описано выше (шаги 3.1-3.4).
  2. После обработки изображений, позволяют мышам, чтобы оправиться от анестезии и обескровить мышей, как описано в стадии 1,6-1,8, сбора крови для дальнейшего анализа.
  3. После пункции сердца, обрызгивать мышей с помощью 20 мл PBS (дополнительно: добавляют 3 мг / мл люциферин к перфузионной раствора) через сердце, чтобы очистить кровь от органов и вновь ввести люциферин метки, которые, возможно, удалены из области мозга, в течение интервала времени начиная с шага 4.1.
  4. Аккуратно удалите мозг, используя изогнутые ножницы, резки от основания по окружности черепа и отрывая верхнюю часть черепа, чтобы мозгчтобы быть аккуратно сняты с изогнутыми щипцами.
  5. Поместите вырезанную мозг на участке из черного пластика и пипеткой 50 мкл 15 мг / мл люциферин через орган до визуализации, чтобы обеспечить адекватное люциферин был добавлен к вырезанной мозга. Изображение с использованием параметров, как описано выше. Это продемонстрирует локализацию инфекции полушарий головного мозга.
    Примечание: Вниз по течению Количественное паразитемии на вырезанной головного мозга может быть осуществлено с помощью кПЦР , как описано ранее 8. Другие приложения альтернативные вниз по течению могут включать в себя гистологию или иммуногистохимии для выявления паразитов в ткани головного мозга после записи.

5. Количественный биолюминесценции изображений

Примечание: биолюминесценции может быть определена количественно с использованием области интереса (ROI) с программным обеспечением обработки изображений и корректируются на фоне биолюминесценции.

  1. С помощью инструмента ROI, создать прямоугольную ROI для целого животного а количественногой позиционировать курсор на изображение мыши, чтобы покрыть кончик носа до основания хвоста мыши. Используйте ту же коробку размера для каждого животного и каждый момент времени. При взгляде на ROI для головного мозга, используют круговую ROI таким же образом, позиционирование ее на области головы мыши на изображении.
  2. При желании можно настроить изображение, чтобы появиться на том же спектре для визуального представления инфекции.
    Примечание: Программное обеспечение, используемое здесь создает цветовую карту для каждого изображения автоматически настраивается для минимального и максимального фотоотсчетов. Чтобы включить визуальное сравнение между серией изображений, цветовая гамма должна быть установлена ​​в одних и тех же значений для всех изображений.
    1. Используя изображение с наивысшим биолюминесценции и на вкладке "Регулировка изображения" на палитре инструментов, выберите логарифмическую шкалу и соответствующую цветовую шкалу минимального и максимального значений (определяется эмпирически). Применить эту шкалу для всех изображений на протяжении всего эксперимента.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Этот протокол показывает , как следовать за прогрессирования заболевания после заражения мышей с T. б. brucei, модель для африканского трипаносомоза человека. На рисунке 1 показана временная шкала экспериментального протокола, демонстрируя график обработки и визуализации этапов. Рисунок 2 демонстрирует типичное поле зрения в фиксированном Гимза окрашенном мазке крови , используемой для количественной оценки периферической паразитемии, с трипаносомы и эритроциты присутствуют. Развитие инфекции у животных может следовать путем измерения биолюминесценции , как на рисунке 3, где показаны зараженных животных в течение эксперимента с использованием тех же животных , изображаемых в каждый момент времени. Через ходе инфекции увеличение биолюминесценции можно наблюдать во всех животных в течение первых 21 дней, как сигнал становится более распространен и интенсивно, с высокими областях ОУИ (представлен в виде краснойот масштаба карты тепла) в области селезенке. У D21 мышей обрабатывают диминазину aceturate , как описано на рисунке 1, пост-обработки изображений, а также снижение биолюминесценции может наблюдаться при D28 , как периферийная инфекция очищается, с низким уровнем сигнала присутствует в области головы мышей. На D35 сигнал по-прежнему остается в области головы и стал более интенсивным, что указывает на возможную инфекцию мозга. Мозг вырезают, чтобы подтвердить сигнал присутствует в ткани головного мозга, а затем может быть количественно кПЦР.

Традиционно, мазки крови используются для количественной оценки прогрессирования инфекции и эффективности лечения. Тем не менее, эти измерения только периферическое паразитемии, и не могут быть использованы для оценки паразитных уровни в головном мозге. Рисунок 4 сочетает в себе количественное как периферической паразитемии и биолюминесценции , чтобы продемонстрировать кинетику заболевания. На D7 высокий сигнал BLI присутствует 10 8 рисунке 3 . Это демонстрирует большую чувствительность биолюминесценции подхода по сравнению с традиционным подсчетом мазок крови.

Для того, чтобы убедиться, что биолюминесценции в области головы действительно локализовать мозговой ткани, в конце эксперимента мозг иссекали и bioluminesценция измеряли ех естественных условиях (рисунок 5). Разница в инфекции бремени между мозгом часто рассматривается и сигнал не появляется, локализуется в специфических анатомических областях, как распределение интенсивного сигнала BLI может варьироваться между инфицированными животными. Например, сильный сигнал БЛИ присутствует в обонятельную луковицу в мыши 2 и 3 и в мозжечке у мышей 3, в то время как мозг от мыши 1 показывает общее распределение сигнала BLI по всему мозгу. Поскольку мозг могут быть отображены сразу после того, как забой мышей, дальнейший анализ может быть осуществлен на ткани головного мозга , так как ткань не повреждается в естественных условиях процесса формирования изображения экс.

Рисунок 1
Рисунок 1:. Срок эксперимента , включая визуализации, отбор проб и лечение В связи с неинвазивным характером визуализации биолюминесценции, мониторинг инфекции может произойти моповторно чаще, чем указано в диаграмме. Отбор образцов и изображений каждые 7 дней позволяют идентифицировать прогрессирующей инфекции. Лечение на D21 с диминазину aceturate удаляет периферическое паразитемии, чтобы обеспечить лучшую визуализацию головного мозга и инфекции. Диминазина aceturate является ранним этапом наркотиков и не может пройти через гематоэнцефалический барьер в количествах , достаточных для очистки поздней стадии инфекции. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

фигура 2
Рис . 2: Гимзе Витраж трипаносом На фиксированном мазке крови, Гимза окрашенных трипаносомы (фиолетовый с розовыми ядрами, закрытая стрелка) легко обнаруживаются против красных кровяных клеток (окрашены голубым цветом, открытая стрелка) и может быть быстро пересчитать , чтобы получить число трипаносомы / 10поля зрения под цели 100X. Шкалы означает 10 мкм. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 3
Рисунок 3: Биолюминесценция Визуализация инфицированных мышей Три представительные животных группы из 6 мышей , инфицированных VSL-2 (M = мыши) и зараженного контроля дикого типа (зараженного дикого типа nonbioluminescent паразита линии).. Люциферин также вводили в контрольной мыши до начала обработки изображений, который обеспечивает измерение фона. Тепловая карта масштаба отображается с красным указывает на высокий уровень биолюминесценции, приравнивая большого числа паразитов, а синий указывает на низкий уровень биолюминесценции (D = день). Управление мышью не имеет биолюминесценции как и ожидалось, без каких-либо люциферазы экспрессирующих паразитов. изображение F ром Баррелл-Савар и др. 8 с разрешения Oxford University Press. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 4
Рис . 4: Сравнение биолюминесценции и крови Film паразитемия Total биолюминесценции каждого целого животного количественному , как описано в разделе 5 и периферической паразитемии количественно путем подсчета паразитов в мазках крови. Столбики ошибок обозначают стандартное отклонение от среднего значения. Изображение из Баррелл-Савар и др. 8 с разрешения Oxford University Press. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

5 "SRC =" / файлы / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
Рис . 5: Ex Vivo изображений отсеченных мозга перфузией мозг мышей отображенных на рисунке 3 были удалены и отображены , как описано в 4.5. Биолюминесценция измеряется на Теплокарта масштабе, как на рисунке 3. Контроль мозга от мыши, зараженного дикого типа nonbioluminescent паразитов также обрабатывали люциферин и не биолюминесценции не наблюдается. Шкалы обозначает 1 см. Эта цифра была изменена из Баррелл-Савар и др. 8 с разрешения Oxford University Press. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Рисунок 6
Рисунок 6: Кинетика люциферин биолюминесценции в VSL-2-инфицированных мышей.Три VSL-2-инфицированных мышей CD1 вводили 150 мг / кг внутрибрюшинно люциферина и немедленно помещены в томографа. Мыши были обследованы в течение 60 мин и их биолюминесценции рассчитывали определить оптимальное окно изображения после люциферин администрирования. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Развитие биолюминесцентного Т. б. brucei GVR35 штамм позволяет визуализацию трипаносом инфекции от начала до поздней стадии. Предыдущие модели инфекции не удалось обнаружить поздней стадии, когда паразиты находятся в головном мозге, в режиме реального времени из пленочной крови микроскопии, и требуется отбраковывать и удаление мозга из инфицированных мышей , чтобы определить , паразит нагрузку 12. Биолюминесценции уменьшает вариабельность между мыши, как одна мышь может быть отслежена на протяжении всей полноте инфекции и быстрой качественной оценки инфекции может наблюдаться на любом этапе. Высокочувствительным методом визуализации биолюминесценции позволяет инфекции низкого уровня , которые будут определены раньше , чем кровь пленки микроскопии, с всего лишь 100 трипаносом обнаруживаемых с помощью визуализации по сравнению с 5 х 10 3 трипаносом / мл обнаруживаемых с помощью микроскопии 9. Кроме того, после тех же животных на протяжении всего эксперимента исключитьS необходимость для отдельных групп животных для каждой временной точки, что значительно снижает потребление животных.

Протокол формирования изображения, описанный здесь может быть адаптирована в соответствии с научной необходимости, как неинвазивный характер означает, что дополнительные и более частое формирование изображений может осуществляться (с одобрением по этике соответствующих животных), но для оценки мозга инфекции D21 является самое раннее время пункт. С этого момента, ранние стадии препараты уже не эффективны при очистке поздних паразитов стадии. Важно также, что мыши, изображаются в тех же условиях в каждый момент времени. Например, те же времена экспозиции и тот же вид (вентральной или спинной) должны быть использованы для обеспечения точного измерения хода инфекции.

Если во время не получения изображения отсутствие сигнала присутствует (если известно, что модель должна иметь инфекцию), существует целый ряд шагов, которые можно следовать, чтобы определить источник проблемы. Во-первых, время экспозиции может быть увеличенодо максимум 5 мин, который должен быть в состоянии обнаружить очень слабый сигнал биолюминесценции. Если сигнал до сих пор не обнаружены и пленки крови являются положительными для паразита, следующий шаг должен был бы подтвердить, является ли паразит еще биолюминесценции. Это может быть осуществлено с использованием коммерчески витро анализа люциферазы активности в и биолюминесценции будет обнаружен с помощью фотометра. Если в данный момент паразит уже не биолюминесцентная, стабильность конструкции в паразита не нужно будет решать.

Цвет мышей имеет значение чувствительности визуализации , как излучаемый биолюминесценции ослабляется темного меха и кожи 6,9. Выбор линии мышей, такие как белые мыши или голых мышей, может, следовательно, улучшить результаты. Если цвет мыши ограничена, например , путем использования трансгенной линии, затем бритье или эпиляции мышей в интересующей области может значительно повысить чувствительность 6.

DeНесмотря улучшенная чувствительность и сигнал , что модель биолюминесцентная производит биолюминесценции не напрямую коррелирует с периферической паразитемии , наблюдаемой в мазках крови (дни 7-21 , показанные на рисунке 4). Литература документально подтверждено , что на ранней стадии инфекции трипаносомозе заражает систему hemolymphatic 1, и не только ограничивается кровеносной системы , и это, наряду с инфекцией периферических органов, объясняет , почему , когда периферийное паразитемия едва обнаружим в мазках крови, биолюминесценции виден как особенно видно из данных по 7 -й день на рисунке 3 и 4. Это, однако, не означает, что визуализация биолюминесценции может быть использован только как качественное измерение инфекции, и дальнейший анализ необходим для определения абсолютного бремени паразита.

Биолюминесценции изображений имеет возможность применения с другими возбудителей инфекционных заболеваний, которые трудно моnitor с грызунами моделях болезни Шагаса, малярии и токсоплазмоза уже установили 13-16. Высокое отношение сигнал-шум биолюминесценции в сочетании с его способностью отслеживать в режиме реального времени инфекции могут обеспечить более чувствительный, неинвазивный оценку наркотиков, а также получить более глубокое понимание кинетики инфекции ЦНС, что делает его ценным инструментом в инфекционное исследование болезни.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Мы благодарим Джона Келли и Мартин Тейлор (Лондонская школа гигиены и тропической медицины) для обеспечения T. б. brucei GVR35-VSL-2 и д - р Андреа Zelmer (LSHTM) за консультацией по визуализации в естественных условиях. Эта работа была поддержана Фондом глобальной программы здравоохранения Билла и Мелинды Гейтс (грант номер OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Биолюминесценции визуализации для обнаружения поздней стадии инфекции африканского трипаносомоза
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter