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Immunology and Infection

Bioluminescence इमेजिंग अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस की देर चरण संक्रमण का पता लगाने के लिए

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

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आचार विचार
सब काम (वैज्ञानिक प्रक्रिया) अधिनियम 1986 और स्वच्छता एवं ट्रॉपिकल मेडिसिन पशु कल्याण और आचार समीक्षा बोर्ड लंदन स्कूल ऑफ ब्रिटेन के गृह मंत्रालय पशु के अनुमोदन के तहत बाहर किया गया था। आने दिशानिर्देश इस रिपोर्ट में पीछा कर रहे हैं।

1. Bioluminescent Trypanosoma ब्रुसे ब्रुसे के vivo पारित होने में

  1. टी के एक cryopreserved शेयर (करार दिया stabilate) निकालें ख। ब्रुसे तनाव तरल नाइट्रोजन से 9 (लंदन एमटीए के माध्यम से स्वच्छता एवं ट्रॉपिकल मेडिसिन के स्कूल में प्रोफेसर जॉन केली से उपलब्ध है) GVR35-VSL -2 और कमरे के तापमान को संतुलित करने के लिए अनुमति देते हैं। बाँझ फॉस्फेट बफर ग्लूकोज खारा (पीबीएस जी) पीएच 8.0 (1 एल पीबीएस + 15 ग्राम ग्लूकोज) 10 में 2 एक्स 10 4 Trypanosomes / एमएल stabilate पतला।
    नोट: टी ख। ब्रुसे GVR35-VSL -2 मनुष्य के लिए गैर-संक्रामक है और SAPO लाइसेंस प्रयोगों से बाहर ले जाने के लिए सुविधाओं की आवश्यकता है।
  2. Inject एक 25 जी सुई के साथ intraperitoneal मार्ग (आईपी) के माध्यम से Trypanosomes पतला 0.2 मिलीलीटर के साथ एक 20-25 ग्राम महिला CD1 माउस। यह "दाता माउस" है। संक्रमित माउस एक विशिष्ट रोगज़नक़ मुक्त (एसपीएफ) -cage और चारा जी भरकर में रखें।
    नोट: CD1 चूहों एक outbred तनाव और टी हैं ख। ब्रुसे GVR35 संक्रमण के इस तनाव में अच्छी तरह से विशेषता है। हालांकि, इस प्रोटोकॉल भी जन्मजात या आनुवंशिक रूप से संशोधित उपभेदों के लिए लागू है, लेकिन यह ध्यान रखें कि फर रंग इमेजिंग 6.9 की संवेदनशीलता पर प्रभाव हो सकता है महत्वपूर्ण है।
  3. रक्त नमूने द्वारा परिधीय पेरासाइटिमिया मॉनिटर। माउस एक प्लास्टिक restrainer में रखें और 21 जी सुई या venesection साथ शिरावेध द्वारा पूंछ से रक्त के 5 μl ले और 0.85% बाँझ अमोनियम क्लोराइड के साथ 1/10 मिश्रण लाल रक्त कोशिकाओं lyse और आसान गिनती की अनुमति है।
  4. एक Neubauer hemocytometer में पतला खून गणना।
    1. दोनों कक्षों में पतला खून लोड। पूरे केंद्रीय जीआर गणनाएक कक्ष की आईडी n Trypanosomes देने के लिए। रक्त = n 10 x 4 Trypanosomes / एमएल में Trypanosomes की एकाग्रता, किसी भी कमजोर पड़ने कारक के लिए समायोजित करने और दो ​​कक्षों का औसत की गणना।
      नोट: के बाद लगभग 5-7 दिनों के बाद संक्रमण, परिधीय पेरासाइटिमिया पर्याप्त 2 एक्स 10 4 Trypanosomes / एमएल की एकाग्रता में एक संक्रमण बाहर ले जाने के लिए वृद्धि करनी चाहिए।
  5. trypanosome स्तर की आवश्यकता चूहों की संख्या के लिए पर्याप्त उच्च, कदम दर 1.6 पर ले जाने के लिए कर रहे हैं। एक दाता माउस में 6 एक्स 10 4 Trypanosomes / एमएल के एक पेरासाइटिमिया स्तर 10 चूहों के संक्रमण के लिए पर्याप्त है।
    नोट: सांख्यिकीय महत्वपूर्ण समूह आकार के लिए, एन = 6 चूहों में से प्रत्येक के इलाज के समूह के लिए 8 की जरूरत है। संक्रमण के अन्य मॉडलों के लिए, बिजली गणना उचित समूह आकार का निर्धारण करने के लिए लागू करने की आवश्यकता होगी।
  6. एक गर्मी बॉक्स में जगह चूहों (लगभग 5-10 मिनट के लिए 28-30 डिग्री सेल्सियस) पूंछ नसों को चौड़ा करने के लिए अनुमति देने के लिए।टर्मिनल संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए, 20 मिलीग्राम / एक 25 जी सुई के साथ किलो pentobarbital चतुर्थ प्रशासन। पुष्टि माउस धीरे पैरों के पंजों दबाने सुनिश्चित करने के लिए कोई वापसी पलटा है द्वारा anesthetized है।
  7. एक टूम ट्यूब में 5000 खासियत इकाइयों / मिलीलीटर 5 मिलीलीटर हेपरिन aliquoting और में और सुई एक 1 मिलीलीटर सिरिंज से जुड़ी से बाहर दो बार चूसने से एक 21 जी सुई Heparinize।
  8. heparinized 21 जी सुई और 1 मिलीलीटर सिरिंज ले लो और पसलियों के नीचे केन्द्र सुई डालने से anesthetized बीतने के माउस पर कार्डियक पंचर प्रदर्शन (खून की एक मनका सुई के आधार में पूल होगा) और धीरे सवार पर वापस खींच इतनी के रूप में दिल के चैंबर पतन के लिए नहीं। खून की 0.7 मिलीलीटर की एक न्यूनतम ले लीजिए।
  9. संक्रमित रक्त पतला 2 एक्स 10 4 Trypanosomes / ऊपर 1.1 कदम के रूप में पीबीएस-जी पीएच 8.0 मिलीलीटर की एक inoculum उत्पादन करने के लिए।
    नोट: इस बिंदु पर, शेष रक्त 8% ग्लिसरॉल, 20% गर्मी निष्क्रिय भ्रूण सीए के साथ मिश्रण से stabilate उत्पादन करने के लिए किया जा सकता cryopreservedवामो सीरम (हाय-एफसीएस) और 72% संक्रमित रक्त। धीरे-धीरे एक धीमी गति से फ्रीज ठंड कंटेनर का उपयोग करने का -1 एक ठंडा दर डिग्री सेल्सियस / मिनट प्राप्त करने के लिए, तरल नाइट्रोजन के लिए स्थानांतरित करने से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर।

2. प्रायोगिक चूहों के संक्रमण

  1. CD1 मादा चूहों (~ 21-25 छ) एक हीटिंग बॉक्स में रखें धीरे गर्म नसों को चौड़ा करने के लिए। गरम चूहों एक प्लास्टिक संयम में रखें और 0.2 मिलीग्राम पूंछ नस में एक 25 जी सुई, माउस प्रति 4,000 Trypanosomes के बराबर के साथ नसों इंजेक्षन पतला inoculum। खून बह रहा है स्टेम करने के लिए बाद में इंजेक्शन स्थल पर दबाव रखें।
    नोट: इंट्रापेरिटोनियल संक्रमण संक्रमण का एक मान्य मार्ग है और पिछले अध्ययनों 10 में इस्तेमाल किया गया है, लेकिन हम नसों मार्ग की तुलना में इस कम प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पाया है।
  2. एसपीएफ-निकाल पिंजरों में 3 के समूह में संक्रमित चूहों और पिंजरे अनियमित करें। एक नियंत्रण के रूप में, जंगली प्रकार के गैर-bioluminescent परजीवी, टी के साथ CD1 मादा चूहों इंजेक्षन ख। ब्रुसे GVR35 (एन =3)।
  3. रक्त फिल्म माइक्रोस्कोपी के माध्यम से संक्रमण मॉनिटर
    1. एक गिलास स्लाइड पर शिरावेध या venesection से स्पॉट 5 μl खून और खून का धब्बा (एक दूसरे गिलास स्लाइड का प्रयोग धीरे स्लाइड भर में खून की बूंद धक्का एक पतली फिल्म का निर्माण करने के लिए) प्रदर्शन करते हैं। शुष्क हवा के लिए स्लाइड की अनुमति दें।
    2. DH 2 हे के साथ rinsing से पहले 10 मिनट के लिए 100% मेथनॉल और Giemsa साथ दाग के साथ रक्त स्मीयर फिक्स और शुष्क हवा की अनुमति देते हैं। 100X उद्देश्य के तहत (FOV) दृश्य के 10 क्षेत्रों में Trypanosomes की संख्या गिनती।
      नोट: रक्त फिल्माने के रूप में जल्दी एक दिन बाद संक्रमण के रूप में पूरे पशु noninvasive इमेजिंग के साथ किया जाता है। जानवरों के एक नंबर संसाधित करते समय, trypanosome quantitation की इस पद्धति hemocytometer गिनती अधिक पसंद के रूप में नमूने कमरे के तापमान पर संग्रहित किया जा सकता है और बाद में गिना जाता है।

3. bioluminescence इमेजिंग संक्रमण ट्रैक करने के लिए

नोट: संक्रमण की निगरानी करने के लिए, पूरे animअल गैर इनवेसिव इमेजिंग का इस्तेमाल किया जा सकता है।

  1. 30 मिलीग्राम / एमएल डी luciferin, जुगनू luciferase सब्सट्रेट, Dulbecco फास्फेट खारा बफर (DPBS) में से एक शेयर समाधान तैयार है। फ़िल्टर बाँझ और -20 डिग्री सेल्सियस पर aliquots में फ्रीज।
    नोट: डी luciferin प्रकाश के प्रति संवेदनशील है, इसलिए पन्नी में लपेटकर द्वारा aliquots प्रकाश से बचाने के लिए। बार बार फ्रीज पिघलना न luciferin के रूप में यह गतिविधि 11 प्रभावित कर सकते हैं।
  2. कमरे के तापमान को डी luciferin के एक विभाज्य गर्म। पिंजरे (nonbioluminescent जंगली प्रकार परजीवी तनाव से संक्रमित चूहों पर नियंत्रण सहित) से प्रत्येक माउस निकालें और 150 मिलीग्राम / गरम डी luciferin (DPBS में पतला) का किलो इंजेक्षन intraperitoneally एक 25 जी सुई के साथ। 2.5 एल / मिनट में 2% isofluorane / हे 2 मिश्रण के साथ संज्ञाहरण प्रेरित करने के लिए लगभग 5 मिनट के लिए एक isofluorane कक्ष में चूहों रखें।
    नोट: चूहे स्थिर हो जाते हैं जब वे संज्ञाहरण के तहत कर रहे हैं। यहां इस्तेमाल इमेजर के लिए, 3 चूहों को एक समय पर कार्रवाई की जा सकती है। चूहों anesthet कर रहे हैंअब से 30 मिनट के लिए ized, नेत्र कृत्रिम आंसू मरहम बाहर सुखाने से चूहों की आंखों को रोकने के लिए लागू किया जा सकता है।
  3. इमेजर यहाँ वर्णित के लिए, सॉफ्टवेयर को खोलने और निर्माता के निर्देशों के अनुसार सॉफ्टवेयर का उपयोग कर मशीन को प्रारंभ। छवियों का मोल एक बार कैमरा और गर्म थाली तापमान पहुंच गया है।
    नोट: इस साधन आम तौर पर बंद नहीं, रात भर पृष्ठभूमि calibrations प्रदर्शन करने के लिए मशीन को सक्षम। घटना है कि इसे पुनः आरंभ करने की जरूरत है, यह एक अंशांकन की जाँच पहले चलाना चाहिए।
  4. (3.5 देखें) इमेजर में anesthetized चूहों रखें। किसी भी उज्ज्वल bioluminescent संकेत के माध्यम से खून कम करने के लिए चूहों के बीच बड़े काले विभाजकों का प्रयोग करें। छवि जोखिम बार का एक सेट का उपयोग कर चूहों; 1, 3, 10, 30, 60 और 180 सेकेंड, मध्यम binning, 1 एफ / बंद करो और एक खुले फिल्टर, और क्षेत्र दृश्य ई के साथ (12.5 x 12.5 सेमी 2)।
    नोट: नियंत्रण जंगली प्रकार nonbioluminescent GVR35 परजीवी से संक्रमित चूहों एक backgr प्रदानound bioluminescence मूल्य। एक luciferin कैनेटीक्स प्रयोग (चित्रा 6) इस मॉडल के साथ से, हम है कि 10 मिनट पर bioluminescence संकेत चोटियों प्रशासन पोस्ट और इमेजिंग लगभग 3 चूहों के लिए 5 मिनट लगते हैं पाया है। जब anesthetizing और चूहों इमेजिंग ध्यान में इस timescale ले लो।
  5. चूहों की पूरी तरह से इमेजिंग सुनिश्चित करने के लिए एक उदर, पृष्ठीय और पार्श्व दृश्य प्राप्त करने के लिए बारी बारी से। अनुक्रमिक पशुओं के बीच इमेजिंग के लिए उन्मुखीकरण के क्रम में निरंतरता बनाए रखने के।
  6. इमेजिंग के बाद, चूहों एसपीएफ पिंजरे में लौटने से पहले निगरानी में संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति देते हैं।
  7. इमेजिंग चूहों हर 7 दिनों दिन 21 के बाद संक्रमण तक जारी है। वहाँ पूरे जानवर पर bioluminescence संकेत में लगातार वृद्धि होना चाहिए।
  8. D21, छवि और रक्त फिल्म चूहों के रूप में ऊपर 40 मिलीग्राम के साथ / किलो diminazene aceturate intraperitoneally वर्णित है, और चूहों खुराक पर। यह दवा परिधीय पेरासाइटिमिया साफ हो जाएगा लेकिन खून-brai पार नहीं करेगाn बाधा है, और इसलिए सीएनएस संक्रमण के बेहतर दृश्य सक्षम बनाता है।
    नोट: Diminazene aceturate एक अच्छी तरह से स्थापित प्रारंभिक अवस्था पशु trypanosomiasis इलाज के लिए इस्तेमाल दवा है।
  9. D28 और D35 पर इमेजिंग और निगरानी के लिए आगे बढ़ें।

4. सीएनएस संक्रमण की पुष्टि

  1. D35 पर, छवि चूहों के रूप में ऊपर विस्तृत (कदम 3.1-3.4)।
  2. इमेजिंग के बाद, के रूप में कदम 1.6-1.8 में विस्तृत, आगे के विश्लेषण के लिए रक्त एकत्रित चूहों संज्ञाहरण और रक्तहीन चूहों से उबरने के लिए अनुमति देते हैं।
  3. कार्डियक पंचर के बाद, 20 मिलीलीटर पीबीएस के साथ चूहों छिड़कना (वैकल्पिक: 3 मिलीग्राम / छिड़काव समाधान करने के लिए luciferin के मिलीलीटर जोड़ने) अंगों से खून साफ ​​करने के लिए और luciferin लेबल उस समय अंतराल पर मस्तिष्क क्षेत्र से मंजूरी दे दी है हो सकता है reintroduce करने के लिए दिल के माध्यम से 4.1 कदम से।
  4. धीरे, घुमावदार कैंची का उपयोग खोपड़ी की परिधि के आसपास आधार से काटने, और खोपड़ी के ऊपरी भाग से उठाने, मस्तिष्क की अनुमति देने के द्वारा मस्तिष्क, हटानेधीरे घुमावदार संदंश के साथ बाहर उठाया जा सके।
  5. काले रंग की प्लास्टिक और पिपेट इमेजिंग के लिए पहले अंग पर 15 मिलीग्राम / एमएल luciferin के 50 μl के एक वर्ग पर excised मस्तिष्क की जगह है, यह सुनिश्चित करने के लिए पर्याप्त luciferin excised मस्तिष्क को जोड़ा गया है। छवि के रूप में ऊपर सेटिंग्स का उपयोग कर। यह मस्तिष्क गोलार्द्धों के लिए संक्रमण का स्थानीयकरण का प्रदर्शन करेंगे।
    नोट: के रूप में पहले 8 वर्णित excised मस्तिष्क पर पेरासाइटिमिया के डाउनस्ट्रीम मात्रा का ठहराव qPCR द्वारा किया जा सकता है। अन्य विकल्प बहाव के अनुप्रयोगों के मस्तिष्क ऊतक निर्धारण निम्नलिखित में परजीवी की पहचान करने के लिए ऊतक विज्ञान या immunohistochemistry शामिल हो सकता है।

5. bioluminescence इमेजिंग के quantitation

नोट: Bioluminescence इमेजिंग सॉफ्टवेयर के साथ ब्याज (आरओआई) के क्षेत्र का उपयोग मात्रा जा सकता है और पृष्ठभूमि bioluminescence के लिए सही।

  1. रॉय उपकरण का उपयोग, पूरे जानवर quantitation एक के लिए एक आयताकार रॉय बनानेएन डी माउस छवि पर यह स्थिति माउस की पूंछ के आधार पर नाक की नोक को कवर करने के लिए। हर जानवर और हर समय बिंदु के लिए एक ही आकार बॉक्स का उपयोग करें। जब मस्तिष्क के लिए रॉय को देख, एक ही रास्ते में एक परिपत्र रॉय उपयोग करते हैं, यह स्थिति छवि में माउस सिर क्षेत्र पर।
  2. अगर वांछित, संक्रमण के एक दृश्य प्रतिनिधित्व के लिए एक ही स्पेक्ट्रम पर प्रकट करने के लिए छवियों को समायोजित।
    नोट: यहां इस्तेमाल किया सॉफ्टवेयर स्वचालित रूप से न्यूनतम और अधिकतम फोटोन की गिनती के लिए समायोजित प्रत्येक छवि के लिए एक रंग नक्शे उत्पन्न करता है। छवियों की एक श्रृंखला के बीच दृश्य तुलना सक्षम करने के लिए, रंग पैमाने सभी छवियों के लिए एक ही मूल्यों के लिए सेट किया जाना चाहिए।
    1. उच्चतम bioluminescence और 'छवि को समायोजित' उपकरण पट्टी पर टैब के साथ छवि का उपयोग करना, एक लघुगणकीय पैमाने और एक उचित रंग पैमाने न्यूनतम और अधिकतम (अनुभव से निर्धारित किया जाना है) का चयन करें। प्रयोग के दौरान सभी छवियों के लिए इस पैमाने को लागू करें।

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Representative Results

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इस प्रोटोकॉल दर्शाता है कि कैसे रोग प्रगति T के साथ चूहों के संक्रमण के बाद का पालन करने के लिए ख। ब्रुसे, मानव अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस के लिए एक मॉडल। चित्रा 1 प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल का समय पता चलता है, उपचार और इमेजिंग कदम के लिए समय सारिणी का प्रदर्शन है। चित्रा 2 दृश्य का एक विशिष्ट क्षेत्र को दर्शाता है एक निश्चित Giemsa से सना हुआ रक्त परिधीय पेरासाइटिमिया quantitate करने के लिए इस्तेमाल धब्बा में, trypanosomes और लाल रक्त कोशिकाओं वर्तमान के साथ। पशुओं में संक्रमण के विकास चित्रा 3, जो हर समय बिंदु पर imaged एक ही जानवरों के साथ एक प्रयोग के दौरान अधिक संक्रमित पशुओं से पता चलता है के रूप में bioluminescence को मापने के द्वारा पीछा किया जा सकता। संक्रमण bioluminescence में वृद्धि BLI के उच्च क्षेत्रों के साथ, पहले 21 दिनों में सभी जानवरों में मनाया जा सकता है के रूप में संकेत अधिक फैलाया और तीव्र हो जाता है के पाठ्यक्रम के माध्यम से (लाल के रूप में प्रतिनिधित्वगर्मी के नक्शे पैमाने से) तिल्ली क्षेत्र में। के रूप में चित्रा 1, पोस्ट-इमेजिंग में विस्तृत D21 चूहों diminazene aceturate के साथ व्यवहार कर रहे हैं, और bioluminescence में एक बूंद, D28 पर मनाया जा सकता संकेत के निम्न स्तर चूहों के सिर क्षेत्र में मौजूद होने के साथ के रूप में परिधीय संक्रमण को मंजूरी दे दी है पर। D35 पर संकेत अभी भी सिर क्षेत्र में रहता है और एक संभव मस्तिष्क संक्रमण का संकेत है और अधिक तीव्र हो गया है। मस्तिष्क की पुष्टि करने के संकेत मस्तिष्क ऊतक के भीतर मौजूद है और उसके बाद qPCR द्वारा quantitated किया जा सकता excised है।

परंपरागत रूप से, रक्त स्मीयर संक्रमण प्रगति और उपचार के प्रभाव quantitate करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। हालांकि, इनमें से केवल परिधीय पेरासाइटिमिया मापने के लिए, और मस्तिष्क में परजीवी स्तर का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल नहीं किया जा सकता। चित्रा 4 दोनों परिधीय पेरासाइटिमिया और रोग कैनेटीक्स प्रदर्शित करने के लिए bioluminescence के quantitation को जोड़ती है। D7 पर एक उच्च BLI संकेत 10 8 से मौजूद है चित्रा 3 में देखा D35 के लिए जारी । इस पारंपरिक रक्त फिल्म गिनती खत्म bioluminescence दृष्टिकोण का अधिक से अधिक संवेदनशीलता को दर्शाता है।

सत्यापित करें कि सिर क्षेत्र में bioluminescence वास्तव में मस्तिष्क के ऊतकों को स्थानीयकृत है, प्रयोग दिमाग excised हैं और biolumines के अंत मेंcence पूर्व vivo (चित्रा 5) को मापा। दिमाग के बीच संक्रमण बोझ में एक अंतर अक्सर देखा जाता है और संकेत तीव्र BLI संकेत के वितरण संक्रमित पशुओं के बीच भिन्न हो सकते हैं के रूप में विशिष्ट संरचनात्मक क्षेत्रों के लिए स्थानीय बनाना प्रकट नहीं होता है। उदाहरण के लिए, मजबूत BLI संकेत जबकि माउस 1 से मस्तिष्क सब दिमाग पर BLI संकेत के सामान्य वितरण से पता चलता है, माउस 2 और 3 में और माउस 3 में सेरिबैलम में घ्राण बल्ब में मौजूद है। दिमाग चूहों मुर्गियों को मारने के बाद तुरंत imaged किया जा सकता है, आगे के विश्लेषण के मस्तिष्क के ऊतकों के रूप में ऊतक पूर्व vivo इमेजिंग प्रक्रिया में क्षतिग्रस्त नहीं है पर बाहर किया जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1:। इमेजिंग, नमूने और उपचार सहित प्रयोग के समय bioluminescence इमेजिंग की गैर-आक्रामक प्रकृति के कारण, संक्रमण की निगरानी मो हो सकता हैअक्सर आरेख में विस्तृत से कर रहे हैं। नमूना और इमेजिंग हर 7 दिनों से चल रहा संक्रमण की पहचान सकें। diminazene aceturate साथ D21 में इलाज के सिर और मस्तिष्क में संक्रमण के बेहतर दृश्य अनुमति देने के लिए परिधीय पेरासाइटिमिया हटा। Diminazene aceturate एक प्रारंभिक चरण दवा है और मात्रा देर चरण संक्रमण को खत्म करने के लिए पर्याप्त में रक्त मस्तिष्क बाधा पारित करने में सक्षम नहीं है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। Giemsa सना हुआ Trypanosomes एक निश्चित रक्त फिल्म पर, Giemsa दाग Trypanosomes आसानी से लाल रक्त कोशिकाओं के खिलाफ detectable (दाग नीले, खुला तीर) कर रहे हैं और जल्दी की संख्या प्राप्त करने के लिए गिना जा सकता है (गुलाबी नाभिक के साथ बैंगनी, तीर बंद) trypanosomes / 10एक 100X उद्देश्य के तहत देखने के खेतों। पैमाने बार 10 माइक्रोन को दर्शाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3: संक्रमित चूहों की bioluminescence इमेजिंग 6 VSL -2 (एम = माउस) और एक जंगली प्रकार संक्रमित नियंत्रण (जंगली प्रकार nonbioluminescent परजीवी से संक्रमित लाइन) से संक्रमित चूहों के एक समूह के तीन प्रतिनिधि जानवरों।। Luciferin भी नियंत्रण माउस इमेजिंग के लिए पहले, जो पृष्ठभूमि माप प्रदान करने दिलाई। एक गर्मी नक्शे के पैमाने लाल, bioluminescence के उच्च स्तर का संकेत परजीवी की उच्च संख्या को equating, और नीले bioluminescence के निम्न स्तर (डी = दिन) का संकेत के साथ दिखाया गया है। नियंत्रण माउस कोई bioluminescence कोई luciferase व्यक्त परजीवी के साथ उम्मीद के रूप में है। छवि च ROM Burrell-Saward एट अल। 8 ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। Bioluminescence और रक्त फिल्म पेरासाइटिमिया की तुलना प्रत्येक पूरे जानवरों की कुल bioluminescence धारा 5 और परिधीय पेरासाइटिमिया रक्त स्मीयर में परजीवी की गणना के द्वारा quantitated में वर्णित के रूप quantitated किया गया था। त्रुटि सलाखों मतलब से मानक विचलन निरूपित। Burrell-Saward एट अल। 8 ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति से से छवि। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 5:। Excised मस्तिष्क के पूर्व vivo इमेजिंग चूहों चित्रा 3 में imaged की perfused दिमाग हटा दिया है और imaged थे 4.5 में वर्णित है। Bioluminescence एक गर्मी नक्शा पैमाने चित्रा 3. जंगली प्रकार nonbioluminescent परजीवी से संक्रमित एक माउस से नियंत्रण मस्तिष्क के लिए के रूप में मापा जाता है, यह भी luciferin के साथ इलाज किया गया था और कोई bioluminescence मनाया जा सकता है। पैमाने बार 1 सेमी अर्थ। यह आंकड़ा ऑक्सफोर्ड यूनिवर्सिटी प्रेस की अनुमति से Burrell-Saward एट अल। 8 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 6
चित्रा 6: VSL-2-संक्रमित चूहों में Luciferin bioluminescence की काइनेटिक्स।तीन VSL-2-संक्रमित CD1 चूहों luciferin के 150 मिलीग्राम / किग्रा आईपी के साथ इंजेक्शन और इमेजर भीतर तुरंत रखा गया। चूहों 60 मिनट से अधिक imaged थे और उनके bioluminescence प्रशासन luciferin के बाद इष्टतम इमेजिंग खिड़की निर्धारित करने के लिए गणना की गई। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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एक bioluminescent टी का विकास ख। ब्रुसे GVR35 तनाव देर चरण के लिए जल्दी से एक trypanosome संक्रमण के दृश्य के लिए अनुमति देता है। पिछला संक्रमण मॉडल, देर से मंच का पता लगाने में असमर्थ थे, जब परजीवी मस्तिष्क में हैं, रक्त फिल्म माइक्रोस्कोपी से वास्तविक समय में, और परजीवी बोझ 12 निर्धारित करने के लिए संक्रमित चूहों से मुर्गियों को मारने और दिमाग को हटाने की आवश्यकता है। bioluminescence अंतर-माउस परिवर्तनशीलता कम कर देता है के रूप में एक माउस संक्रमण की सम्पूर्णता है और संक्रमण की एक त्वरित गुणात्मक मूल्यांकन किसी भी स्तर पर मनाया जा सकता है के दौरान पता लगाया जा सकता है। Bioluminescence इमेजिंग के अत्यधिक संवेदनशील विधि सक्षम बनाता है निम्न स्तर के संक्रमण इमेजिंग के माध्यम से पहचाने जाने के रूप में कुछ के रूप में 100 Trypanosomes 5 एक्स 10 3 Trypanosomes / एमएल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से 9 detectable की तुलना के साथ, रक्त फिल्म माइक्रोस्कोपी पहले की तुलना में पहचाना जा सके। इसके अलावा, प्रयोग के दौरान एक ही जानवरों को समाप्त निम्नलिखितहर समय बिंदु के लिए अलग से पशु समूहों, बहुत पशु उपयोग को कम करने के लिए जरूरत है।

इमेजिंग यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल वैज्ञानिक जरूरत के अनुरूप करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता के रूप में गैर-आक्रामक प्रकृति का मतलब है कि अतिरिक्त और अधिक लगातार इमेजिंग (उचित पशु आचार अनुमोदन के साथ) के बाहर किया जा सकता है, लेकिन मस्तिष्क में संक्रमण D21 के आकलन के लिए जल्द से जल्द समय है बिंदु। इस बिंदु पर, प्रारंभिक चरण दवाओं अब कोई देर से मंच परजीवी समाशोधन में प्रभावी रहे हैं। यह भी जरूरी है कि चूहों हर समय बिंदु पर एक ही परिस्थितियों में imaged रहे हैं। उदाहरण के लिए, एक ही जोखिम बार और (उदर या पृष्ठीय) एक ही दृश्य संक्रमण के पाठ्यक्रम का सही माप सुनिश्चित करने के लिए इस्तेमाल किया जाना चाहिए।

(जब यह ज्ञात है कि मॉडल एक संक्रमण होना चाहिए) यदि दौरान कोई संकेत इमेजिंग मौजूद है, वहाँ कदम है कि इस समस्या के स्रोत का निर्धारण करने के लिए पीछा किया जा सकता है की एक संख्या हैं। सबसे पहले, जोखिम समय बढ़ाया जा सकता है5 मिनट की एक अधिकतम जो बहुत कम bioluminescence संकेत का पता लगाने के लिए सक्षम होना चाहिए। संकेत अभी भी पता नहीं है तो और रक्त फिल्मों परजीवी के लिए सकारात्मक रहे हैं, अगले कदम के लिए कि क्या परजीवी अभी भी bioluminescent है की पुष्टि करने के लिए किया जाएगा। यह एक वाणिज्यिक इन विट्रो luciferase गतिविधि परख का उपयोग और bioluminescence एक luminometer का उपयोग कर पता लगाया जाएगा द्वारा किया जा सकता है। इस बिंदु पर परजीवी नहीं रह bioluminescent है, परजीवी में निर्माण की स्थिरता को संबोधित करने की आवश्यकता होगी।

के रूप में उत्सर्जित bioluminescence अंधेरे फर और त्वचा 6.9 से तनु है चूहों के रंग इमेजिंग की संवेदनशीलता को एक फर्क पड़ता है। जैसे सफेद चूहों या नग्न चूहों के रूप में माउस तनाव के अलावा, इसलिए परिणामों में सुधार कर सकते हैं। माउस रंग विवश है, तो एक ट्रांसजेनिक लाइन के उपयोग के द्वारा उदाहरण के लिए, तो शेविंग या ब्याज की एक क्षेत्र में चूहों depilating बहुत संवेदनशीलता 6 सुधार कर सकते हैं।

डेबावजूद सुधार संवेदनशीलता और संकेत है कि bioluminescent मॉडल का उत्पादन, bioluminescence सीधे परिधीय पेरासाइटिमिया रक्त फिल्मों में मनाया करने के लिए सहसंबंधी नहीं करता है (दिनों 7-21 4 चित्र में दिखाया गया है)। साहित्य, दस्तावेज है कि trypanosomiasis के प्रारंभिक चरण संक्रमण hemolymphatic प्रणाली 1 संक्रमित करता है, और पूरी तरह से रक्त प्रणाली के लिए ही सीमित नहीं है और यह परिधीय अंगों के संक्रमण के साथ-साथ, जब परिधीय पेरासाइटिमिया रक्त फिल्मों में मुश्किल से detectable है क्यों समझा जा सकता है के रूप में चित्रा 3 और 4 में 7 दिन के लिए डेटा से विशेष रूप से स्पष्ट है bioluminescence दिख रहा है। यह, हालांकि, इसका मतलब यह है कि bioluminescence इमेजिंग केवल संक्रमण के एक गुणात्मक माप के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है, और आगे के विश्लेषण के पूर्ण परजीवी बोझ निर्धारित करने के लिए आवश्यक है।

Bioluminescence इमेजिंग अन्य संक्रामक रोगज़नक़ों कि मो करने के लिए मुश्किल हो जाता है के साथ इस्तेमाल किया जा रहा करने की क्षमता हैnitor, Chagas रोग, मलेरिया और टोक्सोप्लाज़मोसिज़ के कृंतक मॉडल के साथ पहले से ही 13-16 की स्थापना की। उच्च संकेत करने वाली शोर bioluminescence के अनुपात से वास्तविक समय में संक्रमण ट्रैक करने के लिए एक और अधिक संवेदनशील, गैर इनवेसिव दवा मूल्यांकन प्रदान कर सकते हैं, साथ ही सीएनएस संक्रमण कैनेटीक्स का एक बेहतर समझ पाने की क्षमता के साथ युग्मित, यह एक महत्वपूर्ण उपकरण में बना संक्रामक रोग अनुसंधान।

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Acknowledgments

हम टी उपलब्ध कराने के लिए जॉन केली और मार्टिन टेलर (स्वच्छता एवं ट्रॉपिकल मेडिसिन के लंदन स्कूल) धन्यवाद ख। ब्रुसे GVR35-VSL -2 और vivo इमेजिंग पर सलाह के लिए डॉ एंड्रिया Zelmer (LSHTM)। इस काम के बिल और मेलिंडा गेट्स फाउंडेशन विश्व स्वास्थ्य कार्यक्रम (अनुदान संख्या OPPGH5337) द्वारा समर्थित किया गया।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

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References

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Bioluminescence इमेजिंग अफ्रीकी ट्रिपैनोसोमियासिस की देर चरण संक्रमण का पता लगाने के लिए
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Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

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