Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ethiek
Al het werk werd uitgevoerd in het kader van de goedkeuring van het Britse ministerie van Binnenlandse Zaken Dieren (Scientific Procedures) Act 1986 en de London School of Hygiene & Tropical Medicine Dierenwelzijn en Ethiek Review Board uitgevoerd. KOMEN leidraad worden gevolgd in dit rapport.

1. In vivo Passage van Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Verwijderen van een gecryopreserveerde voorraad (genoemd stabilaat) van T. b. brucei stam GVR35-VSL-2 (verkrijgbaar bij Professor John Kelly aan de London School of Hygiene & Tropical Medicine door de MTA) 9 van vloeibare stikstof om de temperatuur tot kamertemperatuur. Verdun stabilaat tot 2 x 10 4 trypanosomen / ml in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing glucose (PBS-G) pH 8,0 (PBS + 1 L 15 g glucose) 10.
    Opmerking: T. b. brucei GVR35-VSL-2 is niet besmettelijk voor de mens en vereist SAPO in licentie faciliteiten om experimenten uit te voeren.
  2. inject een 20-25 g vrouwelijke CD1 muis met 0,2 ml verdunde trypanosomen via de intraperitoneale route (ip) met een 25 G naald. Dit is de "donor muis". Plaats de besmette muis in een specifiek pathogeenvrije (SPF) -cage en diervoeders ad libitum.
    Opmerking: CD1 muizen zijn een gekruiste stam en T. b. brucei GVR35 infecties zijn goed gekarakteriseerd in deze stam. Echter, dit protocol ook voor inteelt of genetisch gemodificeerde stammen, maar het is belangrijk op te merken dat vachtkleur invloed kan hebben op de gevoeligheid van beeldvormende 6,9.
  3. Monitor perifere parasitemie door bloedafname. Plaats de muis in een plastic restrainer en neemt 5 pl bloed uit de staart door venapunctie met 21 G naald of venesectie en meng 1/10 met 0,85% steriele ammoniumchloride om rode bloedcellen te lyseren en vergemakkelijken de telling.
  4. Tel de verwaterde Bloed in een Neubauer hemocytometer.
    1. Laad het verdunde bloed in beide kamers. Tel de gehele centrale grid van de ene kamer naar n trypanosomen geven. Concentratie van trypanosomen in bloed = n x 10 4 trypanosomen / ml, afgesteld naar verdunningsfactor en bereken het gemiddelde van de twee kamers.
      Opmerking: Na ongeveer 5-7 dagen na de infectie, moet perifere parasitemie voldoende stijgen infectie uit te voeren bij een concentratie van 2 x 10 4 trypanosomen / ml.
  5. Wanneer trypanosoom niveaus hoog genoeg om het aantal muizen vereist, verder naar stap 1,6. Een parasitemie niveau van 6 x 10 4 trypanosomen / ml in een donor muis volstaat infectie van 10 muizen.
    Opmerking: Voor statistisch significant groepsgrootte, n = 6 voor elke behandeling groep muizen nodig zijn 8. Voor andere modellen van infectie zou powerberekeningen moeten worden toegepast op geschikte groepsgrootte bepalen.
  6. Plaats muizen in een warmte box (bij 28-30 ° C gedurende ongeveer 5-10 minuten) om de staart aderen verwijden.Om terminal anesthesie, toedienen 20 mg / kg pentobarbital iv met een 25 G naald. Bevestig muis is verdoofd door zachtjes te drukken op de voetzolen te zorgen dat er geen terugtrekking reflex.
  7. Heparinize een 21 G naald door aliquoting 5 ml heparine in 5000 USP eenheden / ml in een Bijou buis en zuigen twee keer in en uit de naald bevestigd aan een 1 ml spuit.
  8. Neem de gehepariniseerde 21 G naald en 1 ml spuit en voer hartpunctie op de verdoofde passage muis door de naald centraal onder de ribbenkast (een strook bloed bundelen in de basis van de naald) en trek aan de zuigerstang om te voorkomen dat de kamer van het hart instorten. Verzamel minste 0,7 ml bloed.
  9. Verdun besmet bloed aan een inoculum van 2 x 10 4 trypanosomen / ml in PBS-G pH 8,0 als stap 1.1 hierboven te produceren.
    Opmerking: op dit punt, het resterende bloed kan worden gecryoconserveerd voor stabilaat produceren door mengen met 8% glycerol, 20% door warmte geïnactiveerd foetaal caAls serum (hi-FCS) en 72% besmet bloed. Langzaam invriezen bij -80 ° C met een langzame-freezing container een koelsnelheid van -1 ° C / min bereikt, alvorens naar vloeibare stikstof.

2. Infectie van Experimental Muizen

  1. Plaats CD1 vrouwelijke muizen (~ 21-25 g) in een verwarming doos om voorzichtig te warm om aderen te verwijden. Plaats de verwarmde muizen in een plastic beperking en injecteer 0,2 ml verdund inoculum intraveneus met een 25 G naald in de staartader, gelijk aan 4000 trypanosomen per muis. Plaats druk op de injectieplaats daarna aan het bloeden te stoppen.
    Opmerking: Intraperitoneale infectie geldig infectieroute en is gebruikt in eerdere studies 10, maar we hebben deze minder reproduceerbaar dan de intraveneuze weg gevonden.
  2. Willekeurig geïnfecteerde muizen en kooi groepen van 3 in SPF-geventileerde kooien. Als controle injecteren CD1 vrouwelijke muizen met wildtype niet-bioluminescente parasiet, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Bewaken van de besmetting via bloed Film Microscopy
    1. Spot 5 pl bloed uit venapunctie of venesectie op een glasplaatje en het uitvoeren van een bloeduitstrijkje (met behulp van een tweede glasplaatje duw de druppel bloed over de dia om een ​​dunne film te produceren). Laat dia's aan de lucht drogen.
    2. Bevestig het bloed uitstrijkjes met 100% methanol en vlek met Giemsa gedurende 10 minuten voor het spoelen met dH 2 O en laat aan de lucht drogen. Onder 100X doelstelling tel het aantal trypanosomen in 10 gebieden (FOV).
      Opmerking: Blood filmen wordt uitgevoerd samen met hele dier niet-invasieve beeldvorming zo vroeg een dag na infectie uitgevoerd. Bij het verwerken van een aantal dieren, is deze wijze van trypanosoom kwantificering voorkeur boven hemocytometer geteld als monsters bij kamertemperatuur kunnen worden bewaard en later geteld.

3. Bioluminescentie Imaging Infectie Track

Opmerking: Om de infectie te controleren, geheel Animal non-invasieve beeldvorming kan worden gebruikt.

  1. Bereid een voorraadoplossing van D-luciferine, de vuurvlieg luciferase substraat in Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) en 30 mg / ml. Filter steriliseren en bevriezen in aliquots bij -20 ° C.
    Opmerking: D-Luciferine is licht gevoelig, dus beschermen tegen licht door het wikkelen van monsters in folie. Niet herhaaldelijk vries-dooi luciferine als het activiteit 11 kan beïnvloeden.
  2. Warm een ​​hoeveelheid van D-luciferine tot kamertemperatuur. Verwijder elke muis van de kooi (inclusief controle muizen geïnfecteerd met nonbioluminescent wildtype stam parasiet) en injecteer 150 mg / kg van het opgewarmde D-luciferine (verdund in DPBS) intraperitoneaal met een 25 G naald. Plaats de muizen in een kamer isofluorane ongeveer 5 minuten anesthesie met 2% isofluorane / O2 mengsel induceren bij 2,5 l / min.
    Opmerking: Muizen worden immobiel als ze onder narcose. Voor de imager hier gebruikt, kunnen 3 muizen worden tegelijk verwerkt. Als muizen zijn anesthetized langer dan 30 minuten, kan oftalmische kunsttranen zalf worden toegepast om te voorkomen dat de ogen van de muizen uitdrogen.
  3. Voor de hier beschreven imager, opent de software en initialiseer de machine met de software instructies van de fabrikant. Acquire beelden zodra de camera en verwarmde plaat temperatuur hebben bereikt.
    Let op: Dit instrument is meestal niet uitgeschakeld, waardoor de machine op de achtergrond kalibraties 's nachts uit te voeren. Indien het moet herstarten, moet het een kalibratiecontrole eerste run.
  4. Plaats de verdoofde muizen in de imager (zie 3.5). Gebruik grote zwarte separatoren tussen de muizen te minimaliseren bloeden door middel van elke heldere lichtgevende signaal. Afbeelding muizen met behulp van een set van de blootstelling tijden; 1, 3, 10, 30, 60 en 180 seconden, met een gemiddelde binning, 1 f / stop en een open filter en gezichtsveld E (12,5 x 12,5 cm 2).
    Opmerking: De controle muizen geïnfecteerd met het wild type nonbioluminescent GVR35 parasieten te background bioluminescentie waarde. Vanuit een luciferine kinetiek experiment (Figuur 6) met dit model, hebben we ontdekt dat bioluminescentie signaal pieken op 10 minuten na toediening en imaging duurt ongeveer 5 minuten voor 3 muizen. Neem deze termijn te houden bij verlamming en beeldvorming van de muizen.
  5. Voor een grondige beeldvorming van de muizen te garanderen, draaien om een ​​ventrale, rug- en zijaanzicht verkrijgen. Behoud consistentie in de orde van oriëntatie voor de beeldvorming tussen opeenvolgende dieren.
  6. Na beeldvorming, laat muizen uit narcose te herstellen onder observatie alvorens terug te keren naar SPF-kooi.
  7. Doorgaan beeldvorming muizen om de 7 dagen tot 21 dagen na de infectie. Er moet een gestage toename van bioluminescentie signaal over het gehele dier.
  8. Bij D21, beeld en bloedfilm de muizen zoals hierboven beschreven, en dosis muizen met 40 mg / kg intraperitoneaal diminazene aceturate. Dit medicijn zal de perifere parasitemie te wissen, maar zal de bloed-brai niet overstekenn barrière kan dan beter visualisatie van de CNS infectie.
    Opmerking: Diminazene aceturate is een gevestigde geneesmiddel dat gebruikt wordt voor de behandeling van een vroeg stadium van dierlijke trypanosomiasis.
  9. Doorgaan beeldvorming en controle bij D28 en D35.

4. Bevestiging van CNS Infection

  1. Bij D35, beeld muizen zoals hierboven beschreven (stappen 3,1-3,4).
  2. Na de belichting, zodat muizen te herstellen van de anesthesie en exsanguinate muizen zoals beschreven in stap 1,6-1,8, bloedverzamelzak voor verdere analyse.
  3. Naar aanleiding van cardiale punctie, perfuseren muizen met 20 ml PBS (optioneel: voeg 3 mg / ml luciferine tot perfusie oplossing) via het hart om bloed te verwijderen uit de organen en luciferine label dat zou hebben gewist uit het hersengebied over de tijdsinterval opnieuw van stap 4,1.
  4. Verwijder voorzichtig de hersenen, met gebogen schaar, snijden van de basis rond de omtrek van de schedel en tillen uit het bovenste gedeelte van de schedel naar de hersenen toezachtjes worden opgeheven met gebogen pincet.
  5. Plaats de uitgesneden hersenen op een deel van zwarte kunststof pipet en 50 ui 15 mg / ml luciferine via orgaan voorafgaand aan beeldvorming om adequate luciferine werd toegevoegd aan de hersenen uitgesneden. Afbeelding met de instellingen als hierboven. Dit zal plaats van de infectie tonen aan de hersenhelften.
    Opmerking: Downstream kwantificering van parasitemie op het uitgesneden hersenen kan door qPCR worden uitgevoerd zoals eerder beschreven 8. Andere alternatieve downstream-toepassingen kunnen zijn histologie of immunohistochemie om parasieten te identificeren in het hersenweefsel na fixatie.

5. kwantificering van bioluminescentie Imaging

Opmerking: Bioluminescentie kan worden gekwantificeerd middels het gebied van belang (ROI) van de beeldverwerkingssoftware en gecorrigeerd voor achtergrond bioluminescentie.

  1. Met behulp van de ROI tool, maakt u een rechthoekige ROI voor het hele dier een kwantificeringnd te positioneren afbeelding met de muis over te puntje van de neus te dekken naar de basis van de staart van de muis. Gebruik dezelfde grootte doos voor elk dier en elk tijdstip. Als we de ROI van de hersenen, gebruiken een cirkelvormige ROI op dezelfde manier, de positionering via muis kopgebied in het beeld.
  2. Desgewenst afbeeldingen zo op hetzelfde spectrum weergegeven voor een visuele weergave van infectie.
    Opmerking: De software gebruikt hier genereert een kleur kaart voor elk beeld automatisch aangepast voor de minimale en maximale foton telt. Om visuele vergelijking tussen een reeks beelden mogelijk te maken, moet de kleur schaal worden ingesteld op dezelfde waarden voor alle beelden.
    1. Het gebruik van de afbeelding met de tab 'Afbeelding aanpassen' op het palet gereedschap de hoogste bioluminescentie en selecteer een logaritmische schaal en een passende kleur schaal minimum en maximum (empirisch te bepalen). Pas deze schaal om alle afbeeldingen gedurende het experiment.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Dit protocol laat zien hoe progressie van de ziekte na infectie van muizen met T. volgen b. brucei, een model voor humane Afrikaanse trypanosomiasis. Figuur 1 toont de tijdlijn van het experimentele protocol, waaruit het tijdschema voor de behandeling en beeldvorming stappen. Figuur 2 toont een typisch gezichtsveld in vaste Giemsa gekleurd bloed uitstrijkjes gebruikt om perifere parasitemie kwantificeren met trypanosomen en rode bloedcellen aanwezig. Ontwikkeling van de infectie bij dieren kan worden gevolgd door het meten van de bioluminescentie zoals in figuur 3, waarbij de geïnfecteerde dieren in de loop van een experiment met dezelfde dieren afgebeeld op elk tijdstip toont. In de loop van infectie verhoging van bioluminescentie kan worden waargenomen in alle dieren gedurende de eerste 21 dagen als het signaal verspreid en meer intense, hoge gebieden van BLI (weergegeven als rodevan de hitte schaal) in de milt omgeving. Bij D21 muizen worden behandeld met diminazene aceturate zoals beschreven in figuur 1, na de beeldvorming, en een daling van bioluminescentie kan worden waargenomen in D28 als perifere infectie verdwenen, met lage niveaus van signaal in het kopgebied van de muizen zijn. Bij D35 nog steeds het signaal blijft in het hoofd regio en is intenser geworden wat wijst op een mogelijke infectie hersenen. De hersenen uitgesneden bevestigen signaal in het hersenweefsel en kan vervolgens worden gekwantificeerd door qPCR.

Traditioneel worden bloeduitstrijken gebruikt om infecties progressie en de effecten van de behandeling te kwantificeren. Echter, deze alleen meten perifere parasitemie, en kan niet worden gebruikt om parasieten niveaus in de hersenen te evalueren. Figuur 4 combineert kwantificering van zowel de perifere parasitemie en bioluminescentie ziekte kinetiek tonen. Bij D7 is een hoge BLI signaal aanwezig van 10 8 figuur 3 . Dit toont de grotere gevoeligheid van de bioluminescentie aanpak ten opzichte van traditionele bloed film tellen.

Controleren of de bioluminescentie in het kopgebied echt is gelokaliseerd op hersenweefsel, aan het eind van het experiment de hersenen uitgesneden en bioluminescentie gemeten ex vivo (Figuur 5). Een verschil in infectie lasten tussen hersenen vaak gezien en signaal lijkt niet te lokaliseren op specifieke anatomische gebieden distributie van intense BLI signaal kan variëren tussen geïnfecteerde dieren. Bijvoorbeeld, BLI sterk signaal in de olfactorische knobbel in muizen 2 en 3 en in het cerebellum in muizen 3, terwijl de hersenen van muizen 1 toont algemene verdeling van BLI signaal hele hersenen. Aangezien de hersenen onmiddellijk na het ruimen van de muizen kunnen worden afgebeeld, verdere analyse kan worden uitgevoerd op het hersenweefsel als het weefsel niet bij de ex vivo beeldvormingsproces beschadigd uitgevoerd.

Figuur 1
Figuur 1:. Chronologie van Experiment waaronder Imaging, Sampling en behandeling Als gevolg van de niet-invasieve karakter van bioluminescentie beeldvorming, bewaking van de infectie kan mo optredenre meestal aangegeven in het diagram. De bemonstering en imaging elke 7 dagen mogelijk zijn om de voortschrijdende infectie. De behandeling bij D21 met diminazene aceturate verwijdert perifere parasitemie om een ​​betere visualisatie van het hoofd en de hersenen infectie mogelijk te maken. Diminazene aceturate is een vroeg stadium geneesmiddel en is niet in staat om de bloed-hersenbarrière in hoeveelheden voldoende om de late stadium infectie duidelijk voorbij. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figuur 2
Figuur 2:. Giemsa Stained Trypanosomen Op vaste bloed film, Giemsa gekleurd trypanosomen (paars met roze kernen, gesloten pijl) zijn gemakkelijk te detecteren tegen de rode bloedcellen (gekleurd blauw open pijl) en kan snel worden geteld om het aantal te verkrijgen trypanosomen / 10gezichtsvelden onder een 100x objectief. De schaal bar geeft 10 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 3
Figuur 3: Bioluminescentie beeldvorming van geïnfecteerde muizen drie representatieve dieren van een groep van 6 muizen geïnfecteerd met VSL-2 (M = muis) en een wildtype geïnfecteerde controle (geïnfecteerd met het wildtype nonbioluminescent parasiet lijn).. Luciferine werd toegediend aan de controlemuis vóór beeldvorming, waarbij de achtergrond meting geeft. Een warmte schaal van de kaart wordt getoond met rode aangeeft hoge niveaus van bioluminescentie, hetgeen neerkomt op een hoge aantallen parasieten, en blauw met vermelding van lage niveaus van bioluminescentie (D = dag). De controle-muis heeft geen bioluminescentie zoals verwacht met een no-luciferase tot expressie parasieten. afbeelding f rom Burrell-Saward et al. 8 met toestemming van Oxford University Press. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 4
Figuur 4:. Vergelijking van bioluminescentie en Bloed Film parasitemie Totaal bioluminescentie van elk geheel dier werd gekwantificeerd zoals beschreven in hoofdstuk 5 en perifere parasitemie gekwantificeerd door het tellen van parasieten in het bloed uitstrijkjes. Foutbalken geven de standaarddeviatie van het gemiddelde. Afbeelding van Burrell-Saward et al. 8 met toestemming van Oxford University Press. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

5 "src =" / files / ftp_upload / 54032 / 54032fig5.jpg "/>
Figuur 5:. Ex vivo beeldvorming van de hersenen uitgesneden geperfundeerd De hersenen van de muizen afgebeeld in figuur 3 werden verwijderd en afgebeeld zoals beschreven in 4.5. Bioluminescentie wordt gemeten op een schaal warmte als voor figuur 3. De controle brein van een muis geïnfecteerd met wildtype nonbioluminescent parasieten werd behandeld met luciferine en geen bioluminescentie waar te nemen. De schaal bar geeft 1 cm. Dit cijfer is gewijzigd ten opzichte van Burrell-Saward et al. 8 met toestemming van Oxford University Press. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

figuur 6
Figuur 6: Kinetiek van luciferine bioluminescentie in VSL-2 geïnfecteerde muizen.Drie VSL-2 geïnfecteerde CD1 muizen werden geïnjecteerd met 150 mg / kg ip van luciferine en onmiddellijk in de imager geplaatst. De muizen werden in beeld gebracht dan 60 min en hun bioluminescentie werd berekend om de optimale imaging venster na luciferine administratie te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

De ontwikkeling van een bioluminescente T. b. brucei GVR35 stam maakt de visualisatie van een trypanosoom besmetting van de vroege tot de late stadium. Vorige infectie modellen waren niet in staat om het late stadium op te sporen, als parasieten in de hersenen, in real-time uit het bloed film microscopie, en vereist het ruimen en het verwijderen van de hersenen van de geïnfecteerde muizen parasiet last 12 te bepalen. De bioluminescentie vermindert inter-muis variabiliteit één muis gedurende het geheel van de infectie en een snelle kwalitatieve beoordeling van infectie kan in elk stadium worden waargenomen kunnen worden gevolgd. De zeer gevoelige methode van bioluminescentie maakt lage infectie eerder worden geïdentificeerd dan bloed film microscopie, met slechts 100 trypanosomen detecteerbaar door middel van beeldvorming vergelijking met de 5 x 10 3 trypanosomen / ml detecteerbaar tot 9 microscopie. Bovendien, volgens dezelfde dieren gedurende het experiment eliminerens dat afzonderlijke diergroepen voor elk tijdstip, sterk verminderen van het gebruik van dieren.

De beeldvormende hier beschreven protocol kan worden aangepast aan de wetenschap behoefte aan te passen als het niet-invasieve karakter betekent dat bijkomende en vaker beeldvorming kan worden uitgevoerd (met geschikte dierethiek goedkeuring), maar voor de beoordeling van hersenen infectie D21 is het vroegste tijdstip punt. Op dit punt vroeg stadium medicijnen niet langer effectief bij het opruimen van de late parasieten. Het is ook noodzakelijk dat de muizen worden afgebeeld onder dezelfde omstandigheden op elk tijdstip. Bijvoorbeeld, moeten dezelfde belichtingstijden en dezelfde mening (ventrale of dorsale) worden gebruikt om nauwkeurige meting van het verloop van de infectie te waarborgen.

Indien in onderhavige beeldvorming geen signaal is (wanneer bekend is dat het model een infectie moet hebben), zijn er een aantal stappen kunnen worden gevolgd om de oorzaak van het probleem. Ten eerste kan de belichtingstijd worden verhoogdten hoogste 5 min die moet kunnen zeer lage bioluminescentie detecteren. Als het signaal nog steeds niet wordt gedetecteerd en bloedfilms positief voor parasieten, zou de volgende stap te bevestigen of de parasiet nog bioluminescentie. Dit kan worden uitgevoerd door toepassing van een commerciële in vitro assay luciferaseactiviteit en bioluminescentie worden gedetecteerd met een luminometer uitgevoerd. Als op dit punt de parasiet niet meer bioluminescent, zou de stabiliteit van de constructie in de parasiet moeten worden aangepakt.

De kleur van de muizen een verschil maakt de gevoeligheid van beeldvorming als het geëmitteerde bioluminescentie wordt gedempt met donkere huid en vacht 6,9. Keuze van de muis stam, zoals witte muizen of naakt muizen, kan daarom het verbeteren van de resultaten. Indien muis kleur wordt beperkt, bijvoorbeeld door gebruik van een transgene lijn, dan scheren of epileren muizen in een van belang kan gevoeligheid 6 sterk verbeteren.

deOndanks de verbeterde gevoeligheid en signaal dat bioluminescent model produceert de bioluminescentie niet direct correleren met de perifere parasitemie waargenomen bloedfilms (7-21 getoond in figuur 4). Literatuur gedocumenteerd dat het vroege stadium infectie van trypanosomiasis infecteert het hemolymphatic systeem 1, en ​​is niet alleen beperkt tot het bloedsysteem en dit, samen met de infectie van perifere organen, kan verklaren waarom als perifere parasitemie nauwelijks detecteerbaar in het bloed films, bioluminescentie is toegankelijk zoals met name blijkt uit de gegevens van dag 7 in figuur 3 en 4. Dit betekent echter dat bioluminescentie alleen kan worden gebruikt als een kwalitatieve meting van infectie is verder onderzoek nodig om absolute parasitaire infectie te bepalen.

Bioluminescentie heeft het vermogen worden gebruikt met andere besmettelijke pathogenen die moeilijk zijn moNitor, met diermodellen van de ziekte van Chagas, malaria en toxoplasmose reeds gevestigde 13-16. Het hoge signaal-ruisverhouding van bioluminescentie in combinatie met de mogelijkheid om real-time infecties volgen kan een gevoeliger, non-invasieve drug oordeel te geven, evenals een beter inzicht van CNS infectie kinetiek, waardoor het een waardevol instrument besmettelijke ziekte onderzoek.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Wij danken John Kelly en Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) voor het leveren van T. b. brucei GVR35-VSL-2 en Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) om advies over de in vivo beeldvorming. Dit werk werd ondersteund door de Bill en Melinda Gates Foundation Global Health Program (subsidie ​​nummer OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Brun, R., Blum, J., Chappuis, F., Burri, C. Human African trypanosomiasis. Lancet. 375, (9709), 148-159 (2010).
  2. Rodgers, J. Trypanosomiasis and the brain. Parasitology. 137, (14), 1995-2006 (2010).
  3. Barrett, M. P., Boykin, D. W., Brun, R., Tidwell, R. R. Human African trypanosomiasis: pharmacological re-engagement with a neglected disease. Br. J. Pharmacol. 152, (8), 1155-1171 (2007).
  4. Barrett, M. P., Vincent, I. M., Burchmore, R. J. S., Kazibwe, A. J. N., Matovu, E. Drug resistance in human African trypanosomiasis. Future Microbiol. 6, (9), 1037-1047 (2011).
  5. Jennings, F. W., Whitelaw, D. D., Urquhart, G. M. The relationship between duration of infection with Trypanosoma brucei in mice and the efficacy of chemotherapy. Parasitology. 75, (2), 143-153 (1977).
  6. Andreu, N., Zelmer, A., Wiles, S. Noninvasive biophotonic imaging for studies of infectious disease. FEMS Microbiol. Rev. 35, (2), 360-394 (2011).
  7. Sadikot, R. T., Blackwell, T. S. Bioluminescence imaging. Proc. Am. Thorac. Soc. 2, (6), 537-540 (2005).
  8. Burrell-Saward, H., Rodgers, J., Bradley, B., Croft, S. L., Ward, T. H. A sensitive and reproducible in vivo imaging mouse model for evaluation of drugs against late-stage human African trypanosomiasis. J. Antimicrob. Chemother. 70, (2), 510-517 (2015).
  9. McLatchie, A. P., et al. Highly sensitive in vivo imaging of Trypanosoma brucei expressing 'red-shifted' luciferase. PLoS Negl. Trop. Dis. 7, (11), e2571 (2013).
  10. Jennings, F. W., et al. Human African trypanosomiasis: potential therapeutic benefits of an alternative suramin and melarsoprol regimen. Parasitol. Int. 51, (4), 381-388 (2002).
  11. Wiles, S., Robertson, B. D., Frankel, G., Kerton, A. Bioluminescent monitoring of in vivo colonization and clearance dynamics by light-emitting bacteria. Methods Mol. Biol. 574, 137-153 (2009).
  12. Rodgers, J., Bradley, B., Kennedy, P. G. E. Combination chemotherapy with a substance P receptor antagonist (aprepitant) and melarsoprol in a mouse model of human African trypanosomiasis. Parasitol. Int. 56, (4), 321-324 (2007).
  13. Kamerkar, S., Davis, P. H. Toxoplasma on the brain: understanding host-pathogen interactions in chronic CNS infection. J. Parasitol. Res. 2012, 589295 (2012).
  14. Franke-Fayard, B., et al. Murine malaria parasite sequestration: CD36 is the major receptor, but cerebral pathology is unlinked to sequestration. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, (32), 11468-11473 (2005).
  15. Hitziger, N., Dellacasa, I., Albiger, B., Barragan, A. Dissemination of Toxoplasma gondii to immunoprivileged organs and role of Toll/interleukin-1 receptor signalling for host resistance assessed by in vivo bioluminescence imaging. Cell. Microbiol. 7, (6), 837-848 (2005).
  16. Lewis, M. D., et al. Bioluminescence imaging of chronic Trypanosoma cruzi infections reveals tissue-specific parasite dynamics and heart disease in the absence of locally persistent infection. Cell. Microbiol. 16, (9), 1285-1300 (2014).
Bioluminescentie Imaging te laat stadium Infectie van Afrikaanse trypanosomiasis Detect
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter