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Immunology and Infection

Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase

doi: 10.3791/54032 Published: May 18, 2016

Protocol

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Ética
Todo o trabalho foi realizado sob a aprovação do Reino Unido Escritório Animais (Scientific Procedures) Act 1986 e da London School of Hygiene & Tropical Medicine Animal Welfare and Ethics Review Board. CHEGADA orientação são seguidos neste relatório.

1. In Vivo Passagem de Bioluminescent Trypanosoma brucei brucei

  1. Remover um estoque criopreservado (stabilate denominado) de T. b. brucei estirpe GVR35-VSL-2 (disponível a partir de Professor John Kelly na London School of Hygiene & Tropical Medicine através MTA) 9 de azoto líquido e deixar equilibrar à temperatura ambiente. Diluir stabilate a 2 x 10 4 tripanossomas / ml em solução salina tamponada com fosfato de glicose (PBS-G) estéril de pH 8,0 (1 L PBS + glucose 15 g) 10.
    Nota: T. b. brucei GVR35-VSL-2 é não infecciosa para os seres humanos e requer SAPO licenciado instalações para a realização de experimentos.
  2. inject de 20-25 g feminina rato CD1 com 0,2 ml diluído tripanossomas por via intraperitoneal (ip) com uma agulha 25 G. Este é o "rato doador". Coloque o rato infectado em um Specific Pathogen Free (SPF) -cage e alimentação ad libitum.
    Nota: ratinhos CD1 são uma estirpe não consanguíneos e T. b. infecções brucei GVR35 estão bem caracterizados nesta estirpe. No entanto, este protocolo é igualmente aplicável às estirpes puras ou geneticamente modificados, mas é importante notar que a cor da pele pode ter impacto sobre a sensibilidade da imagem 6,9.
  3. Monitorar parasitemia periférica por amostragem de sangue. Colocar o rato dentro de um limitador de plástico e levar de 5 ul de sangue a partir da cauda por punção venosa com 21 L de agulha ou flebotomia e misturar 1/10 com cloreto de amónio estéril de 0,85%, para lisar as células vermelhas do sangue e permitir a contagem mais fácil.
  4. Contar o sangue diluído em um Neubauer hemocitômetro.
    1. Carregar o sangue diluído em ambas as câmaras. Contagem de toda a central de grID de uma câmara para dar N tripanossomas. Concentração de tripanossomas sanguíneos em = N x 10 4 / ml tripanossomas, ajustar para qualquer factor de diluição e calcular a média das duas câmaras.
      Nota: Após cerca de 5-7 dias após a infecção, parasitemia periférica deve subir suficientemente para levar a cabo uma infecção com uma concentração de 2 x 10 4 tripanossomas / ml.
  5. Quando os níveis de tripanossomas são altos o suficiente para o número de ratos necessários, vá para a etapa 1.6. Um nível de parasitémia de 6 x 10 4 tripanossomas / ml em um rato dador é suficiente para a infecção de 10 ratinhos.
    Nota: Para tamanhos estatisticamente significativas de grupo, n = 6 para cada grupo de tratamento de ratinhos são necessários 8. Para outros modelos de infecção, cálculos de alimentação teria de ser aplicado para determinar tamanhos de grupo apropriados.
  6. Coloque ratos em uma caixa de calor (a 28-30 ° C durante cerca de 5-10 minutos) para permitir que as veias da cauda para dilatar.Para induzir a anestesia terminal, administrar 20 mg / kg iv pentobarbital com uma agulha 25 G. Confirmar rato é anestesiado, pressionando suavemente as patas para garantir que não haja reflexo de retirada.
  7. Heparinizar uma agulha G 21, por alíquotas de 5 ml de heparina em 5.000 USP unidades / ml para um tubo de bijou e chupando duas vezes dentro e para fora da agulha ligada a uma seringa de 1 ml.
  8. Leve o heparinizado 21 G agulha e seringa de 1 ml, e realizar punção cardíaca no rato passagem anestesiado pela inserção da agulha centralmente por baixo da caixa torácica (uma gota de sangue vai reunir na base da agulha) e puxe o êmbolo de modo a não entrar em colapso da câmara do coração. Recolha um mínimo de 0,7 ml de sangue.
  9. Dilui-se o sangue infectado para produzir um inoculo de 2 x 10 4 tripanossomas / ml em PBS-G a pH 8,0 como passo 1.1 acima.
    Nota: Neste ponto, o sangue restante pode ser criopreservadas para produzir stabilate por mistura com 8% de glicerol, 20% de Ca fetal inactivado pelo calorsoro lf (oi-FCS) e sangue infectado de 72%. Lentamente congelar a -80 ° C por meio de um processo lento de congelação-congelação recipiente para atingir uma taxa de arrefecimento de 1 ° C / min, antes de transferir para azoto líquido.

2. infecção de camundongos Experimental

  1. Coloque CD1 camundongos fêmeas (~ 21-25 g) em uma caixa de aquecimento para gentilmente quente para dilatar veias. Colocar os ratinhos aquecidos em um sistema de retenção de plástico e injecção de 0,2 ml de inoculo diluiu-se por via intravenosa com uma agulha G 25 na veia da cauda, ​​o equivalente a 4.000 tripanossomas por ratinho. Coloque a pressão no local da injecção depois de deter a hemorragia.
    Nota: infecção intraperitoneal é um percurso válido de infecção e tem sido utilizado em estudos anteriores 10, mas verificou-se esta menos reprodutível do que a via intravenosa.
  2. Randomize camundongos infectados e gaiola em grupos de 3 em gaiolas SPF-ventilados. Como controle, injetar camundongos fêmeas CD1 com tipo selvagem parasita não bioluminescente, T. b. brucei GVR35 (n =3).
  3. Monitorar a infecção através do sangue Film Microscopia
    1. Spot 5 ul de sangue de punção venosa ou venesection sobre uma lâmina de vidro e efectuar um esfregaço de sangue (utilizando uma segunda lâmina de vidro empurrar suavemente a gota de sangue através da corrediça para produzir uma película fina). Deixar as lâminas secar ao ar.
    2. Fixar o esfregaço de sangue com 100% de metanol e mancha com Giemsa durante 10 min antes de enxaguar com dH2O e deixar secar ao ar. No âmbito do objectivo 100X contar o número de tripanossomas em 10 campos de visão (FOV).
      Nota: as filmagens de sangue é realizada juntamente com toda animais imagem não invasivos mais cedo um dia após a infecção. Quando o processamento de um número de animais, este método de quantificação tripanossoma é preferível a contagem em hemocitómetro que as amostras podem ser armazenadas à temperatura ambiente e contadas mais tarde.

3. A bioluminescência Imaging para Rastrear Infection

Nota: Para controlar a infecção, anim todaal imagem não invasiva pode ser usado.

  1. Prepara-se uma solução stock de D-luciferina, o substrato da luciferase do pirilampo, em Dulbecco Salina Tamponada com Fosfato (DPBS) a 30 mg / ml. Filtro de esterilizar e congelar em alíquotas a -20 ° C.
    Nota: D-luciferina é sensível à luz, portanto, proteger da luz por envolvimento em folha de alíquotas. Não repetidamente congelamento-descongelamento luciferina, pois ele pode afetar a atividade 11.
  2. Aquecer-se uma alíquota de D-luciferina à temperatura ambiente. Remover cada ratinho a partir da gaiola (incluindo ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem estirpe nonbioluminescent parasita) e injectar 150 mg / kg de D-luciferina aquecido (diluídas em DPBS) por via intraperitoneal com uma agulha 25 G. Colocar os ratos dentro de uma câmara de isofluorano durante aproximadamente 5 min para induzir a anestesia com 2% de isoflurano / O2 mistura em 2,5 L / min.
    Nota: Os ratos tornam-se imóvel quando eles estão sob anestesia. Para o gerador de imagens usado aqui, 3 ratinhos pode ser processado de cada vez. Se os ratos são anesthetzado por mais de 30 min, pomada oftálmica lágrima artificial pode ser aplicada para evitar os olhos dos ratos de secar.
  3. Para o gerador de imagens descrito aqui, abra o software e inicializar a máquina usando o software de acordo com as instruções do fabricante. Adquirir imagens depois da câmera e placa aquecida ter atingido a temperatura.
    Nota: Este instrumento não é normalmente desligado, permitindo que a máquina para realizar calibrações de fundo durante a noite. No caso em que ele precisa para reiniciar, ele deve executar uma verificação de calibração em primeiro lugar.
  4. Coloque os ratos anestesiados para o gerador de imagens (ver 3.5). Use grandes separadores negros entre os ratos para minimizar a sangrar através de qualquer sinal bioluminescente brilhante. camundongos de imagem usando um conjunto de tempos de exposição; 1, 3, 10, 30, 60 e 180 segundos, com binning médio, 1 f / stop e um filtro aberto, eo campo de visão E (12,5 x 12,5 cm2).
    Nota: Os ratinhos de controlo infectadas com o tipo selvagem parasitas GVR35 nonbioluminescent fornecer um backgrvalor bioluminescência ound. A partir de uma experiência cinética de luciferina (Figura 6) com este modelo, verificou-se que os picos do sinal de bioluminescência em 10 minutos após a administração e de imagem demora aproximadamente 5 minutos para 3 ratinhos. Tome este prazo em consideração quando anestesiar e de imagem dos camundongos.
  5. Para garantir a imagem completa dos ratos, gire para obter um ventral, dorsal e lateral. Manter a consistência da ordem de orientação para a imagem latente entre animais sequenciais.
  6. Depois de imagem, permitem que os ratos se recuperar da anestesia sob observação antes de retornar a SPF-gaiola.
  7. Continue imagiologia ratos a cada 7 dias até o dia 21 pós-infecção. Deveria haver um aumento constante no sinal de bioluminescência ao longo de todo o animal.
  8. No D21, imagem e filme de sangue dos ratos, como descrito acima, e dose de ratos com 40 mg / kg diminazeno aceturate intraperitoneal. Esta droga irá limpar a parasitemia periférica, mas não vai atravessar a barreira sangue-braibarreira n, e, portanto, permite uma melhor visualização da infecção do SNC.
    Nota: Diminazena aceturate é uma droga bem estabelecida usados ​​para tratar em estágio inicial tripanossomíase animal.
  9. Continue imagem e monitoramento em D28 e D35.

4. Confirmando CNS Infection

  1. No D35, os ratinhos da imagem, como especificado acima (passos 3,1-3,4).
  2. Após a imagiologia, permitir que os ratinhos recuperar da anestesia e ratinhos desangrar como detalhado no passo 1,6-1,8, recolha de sangue para posterior análise.
  3. Após a punção cardíaca, perfundir ratos com 20 ml de PBS (opcional: adicionar 3 mg / ml de luciferina a solução de perfusão) através do coração para limpar o sangue dos órgãos e para reintroduzir etiqueta luciferina que pode ter afastada da região do cérebro ao longo do intervalo de tempo a partir do passo 4.1.
  4. Suavemente remover o cérebro, usando tesoura curva, cortando a partir da base à volta da circunferência do crânio, e levantando a parte superior do crânio, para permitir que o cérebropara ser suavemente retirado com pinças curvas.
  5. Colocar o cérebro excisada para uma secção de plástico preto e pipeta 50 ul de 15 mg / ml de luciferina sobre o órgão antes da imagem, para garantir luciferina adequada foi adicionado à cerebral excisado. Imagem usando as configurações acima. Isto irá demonstrar a localização da infecção para os hemisférios cerebrais.
    Nota: A jusante quantificação da parasitemia no cérebro excisado pode ser levada a cabo por qPCR como anteriormente descrito 8. Outras aplicações a jusante alternativos podem incluir histologia ou imuno-histoquímica para identificar parasitas no tecido cerebral após a fixação.

5. A quantificação de bioluminescência de imagem

Nota: A bioluminescência pode ser quantificada utilizando-se a região de interesse (ROI) com o software de imagem e corrigido para o fundo bioluminescência.

  1. Usando a ferramenta de ROI, criar um ROI rectangular para toda animais quantificação umand posicioná-lo sobre a imagem do mouse para cobrir ponta do nariz à base da cauda do rato. Usar a mesma caixa de tamanho para cada animal e cada ponto de tempo. Ao olhar para o ROI para o cérebro, use um ROI circular da mesma forma, posicionando-o sobre a região da cabeça do rato na imagem.
  2. Se desejar, ajuste as imagens apareçam no mesmo espectro para uma representação visual da infecção.
    Nota: O software utilizado aqui gera um mapa de cores para cada imagem ajustada automaticamente para a contagem mínima e máxima de fótons. Para permitir a comparação visual entre uma série de imagens, a escala de cores deve ser ajustado para os mesmos valores para todas as imagens.
    1. Usando a imagem com a maior bioluminescência e na guia 'Ajuste de imagem "na paleta de ferramentas, selecione uma escala logarítmica e um mínimo de escala de cores adequado e máximo (a ser determinado empiricamente). Aplicar esta escala a todas as imagens durante todo o experimento.

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Representative Results

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Este protocolo demonstra como seguir a progressão da doença após a infecção de camundongos com T. b. brucei, um modelo para a tripanossomíase humana Africano. A Figura 1 mostra a linha do tempo do protocolo experimental, demonstrando o calendário de tratamento e de imagem etapas. A Figura 2 mostra um típico campo de visão em um esfregaço de sangue Giemsa-manchadas fixa usada para quantificar parasitemia periférica, com tripanossomas e células vermelhas do sangue presente. Desenvolvimento da infecção em animais pode ser seguido por medição da bioluminescência como na Figura 3, que mostra os animais infectados ao longo de uma experiência com os mesmos animais fotografada em cada ponto de tempo. Com o curso da infecção por um aumento na bioluminescência pode ser observado em todos os animais ao longo dos primeiros 21 dias, como o sinal se torna mais difundida e intensa, com elevados regiões do BLI (representada como vermelhoa partir da escala do mapa de calor) na área do baço. Em camundongos D21 são tratados com diminazeno aceturate conforme detalhado na Figura 1, pós-imagem e uma queda na bioluminescência pode ser observado em D28 como a infecção periférica é limpa, com baixos níveis de sinal de estar presente na região da cabeça dos ratos. No D35 o sinal ainda permanece na região da cabeça e tornou-se mais intensa indicando uma possível infecção cerebral. O cérebro é excisado para confirmar sinal está presente dentro do tecido cerebral e pode, então, ser quantificada por qPCR.

Tradicionalmente, os esfregaços de sangue são utilizados para quantificar a progressão da infecção e efeitos do tratamento. No entanto, estes apenas medem a parasitemia periférica, e não pode ser usado para avaliar os níveis de parasitas no cérebro. A Figura 4 combina a quantificação de ambas a parasitemia periférica e bioluminescência para demonstrar a cinética da doença. No D7 um sinal de alta BLI está presente de 10 8 Figura 3 . Isto demonstra a maior sensibilidade da abordagem bioluminescência a duplicação filme de sangue tradicional.

Para verificar que a bioluminescência na região da cabeça é verdadeiramente localizando ao tecido cerebral, no final da experiência, os cérebros são removidos e bioluminescência medido ex vivo (Figura 5). A diferença de peso entre a infecção cérebro é muitas vezes visto e sinal não aparece para localizar a regiões anatómicas específicas como a distribuição do sinal BLI intensa pode variar entre animais infectados. Por exemplo, o sinal de BLI forte está presente no bulbo olfativo no rato 2 e 3 e no cerebelo em ratos 3, enquanto o cérebro de rato 1 mostra a distribuição geral do sinal de BLI em todo o cérebro. Como o cérebro podem ser visualizados de imediato logo após o sacrifício dos ratinhos, uma análise mais aprofundada pode ser realizado sobre o tecido cerebral que o tecido não está danificado no processo de imagiologia ex vivo.

figura 1
Figura 1:. Cronologia da experiência, incluindo a Imaging, Amostragem e Tratamento Devido à natureza não-invasivo de imagem de bioluminescência, a monitorização da infecção pode ocorrer more frequentemente do que descrito no diagrama. A amostragem e de imagem a cada 7 dias permitir a identificação da infecção progride. O tratamento em D21 com aceturate diminazeno remove parasitemia periférica para permitir melhor visualização da infecção cabeça e do cérebro. Aceturate diminazeno é uma droga fase inicial e não é capaz de atravessar a barreira hemato-encefálica em quantidades adequadas para limpar a infecção fase tardia. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2:. Tripanossomas Giemsa manchado Trypanosomes Em um filme de sangue fixo, Giemsa manchados (roxo com núcleos rosa, fechou seta) são facilmente detectáveis ​​contra as células vermelhas do sangue (tingido de azul, seta aberta) e podem ser rapidamente contado para obter o número de tripanossomas / 10campos de visão sob um objetivo 100X. A barra de escala indica 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: Imagem de bioluminescência ratinhos infectados três animais representativos de um grupo de 6 ratinhos infectados com VSL-2 (M = rato) e um controlo infectado tipo selvagem (infectados com o tipo selvagem linha parasita nonbioluminescent).. Luciferina foi também administrado ao rato de controle antes da imagem, o que proporciona a medição de fundo. A escala do mapa de calor é mostrado com indicação vermelha altos níveis de bioluminescência, o que equivale a um elevado número de parasitas, e azul que indica baixos níveis de bioluminescência (D = dia). O ratinho de controlo não tem de bioluminescência como esperado sem parasitas que expressam luciferase. imagem f rom Burrell-Saward et al. 8 com permissão de Oxford University Press. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4:. Comparação de Bioluminescência e Sangue Film Parasitemia bioluminescência total de cada animal inteiro foi quantificada como descrito na seção 5 e parasitemia periférica quantificada pela contagem de parasitas em esfregaços de sangue. As barras de erro representam o desvio padrão da média. Imagem de Burrell-Saward et al. 8 com permissão de Oxford University Press. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 5: Ex. De Visualização In Vivo de excisado Cérebro Os cérebros perfundidos de ratos fotografada na Figura 3 foram removidos e visualizada como se descreveu em 4.5. A bioluminescência é medida numa escala mapa de calor que para a Figura 3. O controlo de cérebro de um rato infectado com o tipo selvagem parasitas nonbioluminescent também foi tratada com luciferina e não bioluminescência pode ser observada. A barra de escala indica a 1 cm. Este valor foi modificado a partir Burrell-Saward et al. 8 com permissão de Oxford University Press. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6
Figura 6: Cinética de Luciferin Bioluminescência em camundongos VSL-2-infectados.Três ratinhos CD1 VSL-2-infectadas foram injectados com 150 mg / kg ip de luciferina e colocado imediatamente no interior do gerador de imagens. Os ratos foram fotografadas durante 60 min e sua bioluminescência foi calculado para determinar a janela de imagem óptima depois da luciferina administração. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O desenvolvimento de um T. bioluminescente b. brucei GVR35 estirpe permite a visualização de uma infecção por tripanossoma do início ao final de estágio. Modelos de infecção anteriores não foram capazes de detectar a fase tardia, quando os parasitas estão no cérebro, em tempo real, a partir de microscopia de esfregaço de sangue, e exigia o abate e remoção dos cérebros dos ratos infectados para determinar a carga parasitária 12. A bioluminescência reduz a variabilidade inter-rato como um único rato pode ser rastreada ao longo da totalidade da infecção e uma avaliação qualitativa rápida da infecção pode ser observado em qualquer fase. O método altamente sensível de imagem de bioluminescência permite infecção de baixo nível para ser identificados mais cedo do que a microscopia de película de sangue, com apenas 100 tripanossomas detectáveis ​​através de imagens em comparação com os 5 x 10 3 tripanossomas / ml detectáveis ​​por meio de microscopia 9. Além disso, seguindo os mesmos animais ao longo da experiência eliminaré a necessidade de grupos de animais separados para cada ponto de tempo, reduzindo grandemente o uso de animais.

O protocolo de imagem descrito aqui pode ser adaptado para atender a necessidade científica como a natureza não-invasivo significa que imagens adicionais e mais frequentes podem ser realizadas (com a aprovação ética animal adequado), mas para a avaliação da D21 infecção cerebral é a primeira vez ponto. Neste ponto, os medicamentos em fase inicial não são mais eficazes em limpar os parasitas fase tardia. Também é imperativo que os ratinhos são gravadas sob as mesmas condições em cada ponto de tempo. Por exemplo, os mesmos tempos de exposição e mesmo ponto de vista (ventral ou dorsal) deve ser utilizado para garantir uma medição precisa do curso da infecção.

Se durante a imagem está presente nenhum sinal (quando é conhecido que o modelo deve ter uma infecção), há uma série de passos que podem ser seguidas para determinar a origem do problema. Em primeiro lugar, o tempo de exposição pode ser aumentadoaté um máximo de 5 minutos, que deve ser capaz de detectar o sinal muito baixo bioluminescência. Se o sinal ainda não é detectado e filmes de sangue são positivas para parasita, o próximo passo seria para confirmar se o parasita ainda é bioluminescente. Isto pode ser realizado usando um ensaio de actividade in vitro comercial luciferase e bioluminescência seria detectado usando um luminómetro. Se neste momento o parasita não bioluminescente é, a estabilidade da construção em que o parasita que precisam de ser tratadas.

A cor dos ratos faz a diferença para a sensibilidade de imagem como a bioluminescência emitida é atenuada pela pele escura e 6,9 pele. Escolha da estirpe de ratinhos, tais como ratos brancos ou ratos nus, pode, portanto, melhorar os resultados. Se a cor do rato é restringida, por exemplo, por utilização de uma linha transgénica, em seguida, raspar ou depilating os ratinhos numa região de interesse pode melhorar significativamente a sensibilidade 6.

deApesar da sensibilidade melhorada e sinalizar que o modelo produz bioluminescente, a bioluminescência não se correlaciona diretamente com a parasitemia periférica observada em esfregaços de sangue (dias 7-21 mostrados na Figura 4). A literatura tem documentado que a infecção fase precoce da tripanossomíase infecta o sistema hemolinfático 1, e não é apenas a possibilidade do sistema sanguíneo e isto, juntamente com a infecção de órgãos periféricos, pode explicar porque quando a parasitemia periférica é quase indetectável nos filmes sanguíneos, bioluminescência é visível como é particularmente evidente a partir dos dados para o dia 7 na Figura 3 e 4. Isto, no entanto, significa que a imagem de bioluminescência só pode ser usado como uma medida qualitativa da infecção, e análise adicional é necessária para determinar a carga parasitária absoluto.

imagem de bioluminescência tem a capacidade de ser usado com outros agentes patogénicos infecciosos que são difíceis de MOnitor, com modelos de roedores da doença de Chagas, malária e toxoplasmose já estabelecida 13-16. A elevada relação de sinal-para-ruído de bioluminescência juntamente com a sua capacidade para controlar infecções em tempo real pode fornecer uma avaliação de drogas mais sensível, não-invasiva, bem como obter uma melhor compreensão da cinética da infecção do SNC, tornando-o uma ferramenta valiosa na pesquisa de doenças infecciosas.

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Acknowledgments

Agradecemos a John Kelly e Martin Taylor (London School of Hygiene & Tropical Medicine) para a prestação de T. b. brucei GVR35-VSL-2 e Dr. Andrea Zelmer (LSHTM) para o conselho em imagem in vivo. Este trabalho foi financiado pela Fundação Programa de Saúde Global Bill e Melinda Gates (número de concessão OPPGH5337).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS Sigma, UK P4417 tablets pH 7.4
Glucose Sigma, UK G8270 99.5% (molecular) grade
Ammonium chloride Sigma, UK A9434 99.5% (molecular) grade
Heparin (lithium salt) Sigma, UK H0878
Hi-FCS Gibco, Life Technologies, UK 10500-064 500 ml
DPBS Sigma, UK D4031 Sterile filtered
Mr. Frosty Nalgene, UK
Giemsa Sigma, UK G5637
D-Luciferin Perkin Elmer, UK
Sigma, UK 115144-35-9
Diminazene aceturate Sigma, UK D7770 Analytical grade
IVIS Lumina II Perkin Elmer, UK other bioimagers available e.g. from Bruker, Kodak
Living Image v. 4.2 Perkin Elmer, UK proprietary software for Perkin Elmer IVIS instruments; other instruments may have their own
1 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10142104
20 ml Syringe Fisher Scientific, UK 10743785
25 G Needles Greiner Bio-one N2516
21 G Needles Greiner Bio-one N2138
Twin-frosted microscope slide VWR, UK 631-0117
1.5 ml Microcentrifuge tube StarLab, UK I1415-1000
7 ml Bijou tube StarLab, UK E1412-0710
Mouse restrainer Sigma, UK Z756903 our restrainer was made in-house, this is a similar model

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References

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Bioluminescência de imagem para detectar a infecção fase tardia Africano Tripanossomíase
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Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).More

Burrell-Saward, H., Ward, T. H. Bioluminescence Imaging to Detect Late Stage Infection of African Trypanosomiasis. J. Vis. Exp. (111), e54032, doi:10.3791/54032 (2016).

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