Dissecção e pay-per-montagem do Threespine Stickleback branquial Skeleton

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

Uma incrível quantidade de diversidade existe na cabeça do esqueleto entre os vertebrados, especialmente entre os peixes. Em muitos casos, essa diversidade facilita diferentes estratégias de alimentação ^1-4, e pode envolver grandes alterações tanto padronização craniofacial externo e interno. O esqueleto branquial está localizado internamente na garganta de um peixe e rodeia a maior parte da cavidade bucal. O esqueleto branquial é composta por 5 segmentos série homóloga, o anterior quatro dos quais suportam as guelras. Juntos, esses cinco segmentos funcionar como uma interface entre o peixe e sua comida ^5. Variação em uma infinidade de traços incluindo rakers Gill, dentes da faringe e ossos branquial contribuir para forrageamento eficiente em diferentes tipos de alimentos.

Sticklebacks tenham sido submetidos a uma radiação adaptativa após formas oceânicas ancestrais colonizaram lagos de água doce e riachos em todo o hemisfério norte. A mudança na dietade pequeno zooplâncton no oceano para presas maiores em água doce resultou em variação trófica dramática em várias características craniofaciais ^6. Enquanto muitos estudos têm-se centrado nas diferenças craniofaciais externas em sticklebacks ^{7 – 13,} importantes alterações craniofaciais evoluir repetidamente no esqueleto branquial interno. A capacidade de criar híbridos férteis entre as populações stickleback morfologicamente distintas proporciona uma excelente oportunidade para mapear a base genética das alterações evoluíram para o esqueleto branquial.

Um traço trófica de importância ecológica é a padronização dos rastros branquiais, ossos dérmicos periódicas que revestem as faces anterior e posterior dos ossos branquial e são usados ​​para filtrar presas. Os peixes que normalmente se alimentam de pequenos presas tendem a ter mais tempo e mais densamente Gill espaçadas rakers em comparação com os peixes que se alimentam de presas maiores ^14,15. Variação de rastros branquiais tem sido relatada tanto within e entre espécies ^14-19, e os aspectos de emalhar raker padronização contribuir para nichos tróficos e de fitness ^16. Décadas de pesquisa têm amplamente documentado número branquiais e variação de comprimento em sticklebacks threespine ^{17 – 21;} no entanto, esses estudos geralmente se concentram na primeira linha de rastros branquiais. Um trabalho recente tem mostrado modularidade no controle genético do número branquiais em todo o esqueleto branquial ^22,23 e em uma única linha no raker Gill espaçamento ²³ e comprimento de ²⁴ destacando a importância de estudar mais de remar um ou uma única raker Gill para entender o base genética do desenvolvimento da redução branquiais.

Uma segunda característica trófica de ambos importância ecológica e biomédica é a padronização dos dentes da faringe. Os dentes em peixes pode ser localizada tanto na mandíbula oral e no esqueleto branquial, conhecido como os dentes da faringe. dentes orais são usados ​​principalmente para prey capturar enquanto os dentes da faringe são utilizados para a mastigação e presa manipulação ^25-27. Ambos os conjuntos formam através de mecanismos de desenvolvimento compartilhados e são considerados developmentally homólogo ^28. Modularidade interessante ocorre pela qual algumas espécies, como o peixe-zebra, a falta dentes da faringe oral e dorsal ^29, enquanto outras espécies têm múltiplas ceratobranchials dentadas, pharyngobranchials, e às vezes dentada basihyal e hypobranchials ^30. Em sticklebacks, dentes da faringe são encontrados ventrally no quinto ceratobranquial e dorsal sobre a anterior e posterior pharyngobranchials ^31. Cinemática sobre alimentação stickleback mostrar a mandíbula oral é utilizado principalmente para a captura de presas e facilitar a alimentação de sucção ⁹ deixando a mastigação para a mandíbula da faringe. Em ciclídeos, inferior a morfologia da faringe mandíbula varia dramaticamente ^32,33 e foi mostrada para ser adaptável e correlacionada com nicho trófico ^34. multipopulações de água doce stickleback PLE têm evoluído aumentos dramáticos na faringe ventral número de dentes ^23,35,36. Um trabalho recente demonstrou que a base genética do desenvolvimento deste ganho dente evoluído é em grande parte distinta em duas populações derivadas independentemente de sticklebacks de água doce ^36. Ao contrário de dentes de mamíferos, peixes regenerar os dentes de forma contínua ao longo da vida adulta ^37. Ambas as populações de água doce dentadas elevados previamente descritos têm evoluído uma taxa acelerada substituição de dentes, fornecendo um sistema de vertebrado rara para estudar a base genética de regeneração ^36.

Uma terceira característica trófica que evoluiu repetidamente no sticklebacks de água doce é mais ossos epibranchial e ceratobranquial, os branquial homólogos arco segmentar da mandíbula superior e inferior, respectivamente ^38. Mais longos ossos branquial conferem um cavidade bucal maior e provavelmente são adaptáveis ​​para permitir presas maiores para ser consumed. Além disso, em outros peixes, ossos epibranchial são importantes para a depressão das placas de dentes dorsal da faringe ^25. Como rastros branquiais e dentes da faringe, os ossos branquiais são internas e, portanto, difícil de visualizar ou quantificar facilmente.

Aqui apresentamos um protocolo detalhado para dissecar e de montagem fixa o esqueleto branquial, permitindo fácil visualização e quantificação de uma variedade de importantes características craniofaciais. Embora este protocolo descreve uma dissecção stickleback, este mesmo método funciona com uma variedade de outros peixes.

Protocol

Todo o trabalho de peixe foi aprovado pelo Comitê Institucional de Animal Care and Use da Universidade da Califórnia-Berkeley (número de protocolo R330). A eutanásia foi realizada por meio de imersão em 0,025% tricaina-S tamponada com 0,1% de bicarbonato de sódio 39. Todos os passos são realizados à temperatura ambiente. 1. Preparação Nota: Execute as etapas 1,1-1,5 em tubos cônicos ou frascos de cintilação que pode selar firmemente e ser colocados na horizontal. Os peixes não prec…

Representative Results

Este protocolo resulta em um esqueleto montado branquial dissecados e plana (Figura 4), ​​onde uma variedade de importantes características tróficas podem ser quantificados. Do ponto de vista dorsal, todas as linhas de rastros branquiais, todas as placas da faringe dente, e quase todos os ossos branquiais podem ser facilmente visualizados e quantificados 22 – 24,35,36,38,42. Vermelho de Alizarina S reage também em uma ou roda…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10