Dissection und Flach Montage des Dreistachliger Stichling Branchiogene Skeleton

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

Eine unglaubliche Menge an Vielfalt existiert im Kopf Skelett unter den Wirbeltieren, vor allem unter den Fischen. In vielen Fällen erleichtert diese Vielfalt verschiedene Fütterungsstrategien ^{1. – 4.} und größere Änderungen an externen und internen craniofacial Strukturierung beinhalten können. Die Kiemen Skelett wird intern in der Kehle eines Fisches angeordnet und umgibt den größten Teil der Mundhöhle. Die Kiemen Skelett besteht aus 5 seriell homologe Segmente, die vordere, von denen vier die Kiemen unterstützen. Zusammen wirken diese fünf Segmente als Schnittstelle zwischen Fisch und ihre Nahrung ^5. Variation in einer Vielzahl von Merkmalen, einschließlich Kiemenreusen, Schlundzähne und Kiemen Knochen tragen zur effizienten Nahrungssuche auf verschiedenen Arten von Lebensmitteln.

Stichlinge haben eine adaptive Radiation nach Vorfahren ozeanischen Formen kolonisiert Süßwasserseen und Bäche in der gesamten nördlichen Hemisphäre erlebt. Die Verschiebung in der Ernährungvon kleinen Zooplankton im Ozean in Süßwasser auf größere Beute hat ⁶ in dramatischen trophic Variation in mehreren craniofacial Züge geführt. Während viele Studien über externe craniofacial Unterschiede in Stichlinge konzentriert haben ^7-13, entwickeln wichtige craniofacial Änderungen wiederholt im internen Kiemen Skelett. Die Fähigkeit, zu schaffen fruchtbaren Hybriden zwischen morphologisch unterschiedlichen stickleback Populationen bietet eine hervorragende Gelegenheit, die genetische Grundlage entwickelte sich Änderungen an der Kiemen Skelett abzubilden.

Ein trophic Merkmal ökologischer Bedeutung ist die Strukturierung von Kiemenreusen, regelmäßige Hautknochen, die die vorderen und hinteren Flächen der Kiemen Knochen Linie und werden verwendet, um Beutetiere zu filtern. Fische , die normalerweise ernähren sich von kleinen Beutetieren sind in der Regel mehr zu haben und dichter Abstand Kiemenreusen im Vergleich zu Fischen , die ^14,15 auf größere Beutetiere ernähren. Variation in Kiemenreusen wurde berichtet, beide within und zwischen den Arten ^14-19 und Aspekte der Kiemenreuse Muster tragen zu trophischen Nischen und Fitness – ^16. Jahrzehnte der Forschung haben ausführlich Kiemenreuse Nummer und Längenänderung in threespine Stichlinge ¹⁷ dokumentiert ^{– 21;} Allerdings konzentrieren sich diese Studien typischerweise in der ersten Reihe von Kiemenreusen. Neuere Arbeiten über die Kiemen Skelett ^22,23 und über eine einzelne Zeile in Kiemenreuse ²³ Abstand Modularität in der genetischen Kontrolle Kiemenreuse Nummer angezeigt und Länge ²⁴ Hervorhebung der Bedeutung mehr zu studieren , als Zeile ein oder eine einzelne Kiemenreuse zu verstehen , die Entwicklungs genetische Basis der Kiemenreuse Reduktion.

Eine zweite trophische Merkmal sowohl ökologische und biomedizinische Bedeutung ist die Strukturierung von Schlundzähne. Zähne in Fischen kann sowohl in der Mundkiefer und im Kiemen Skelett, bekannt als Schlundzähne befinden. Oral Zähne sind in erster Linie für p verwendetrey erfassen , während Schlundzähne für Kauens und Beute Manipulation ²⁵ verwendet werden ^{– 27.} Beide Sätze bilden über gemeinsame Entwicklungsmechanismen und sind entwicklungs homolog ²⁸ betrachtet. Interessante Modularität tritt wobei einige Arten, wie Zebrabärbling, mangelnde Mund und Rückenschlundzähne ²⁹ , während andere Spezies , die mehrere Zahn ceratobranchials haben, pharyngobranchials und manchmal basihyal verzahnten und hypobranchials ^30. In Stichlinge sind Schlundzähne ventral am fünften ceratobranchial und dorsal auf den vorderen und hinteren pharyngobranchials ³¹ gefunden. Kinematics auf stickleback Fütterung zeigen die orale Kiefer ist in erster Linie für den Beutefang eingesetzt und erleichtert Saug Zuführung ⁹ Kauens zur Pharyngealia verlassen. In Cichliden, niedrigere Pharyngealia Morphologie variiert ^32,33 dramatisch und wurde mit trophischen Nischen ³⁴ adaptive und korreliert zu sein gezeigt. Multiweise Süßwasser stickleback Populationen dramatischen Anstieg der ventralen Schlundzähnezahl ^23,35,36 entwickelt. Neuere Arbeiten haben gezeigt , dass die Entwicklung der genetischen Grundlage dieser entwickelte Zahn Verstärkung in zwei unabhängig voneinander abgeleitet Populationen von Süßwasser Stichlinge ³⁶ weitgehend verschieden ist. Im Gegensatz zu Säugerzähne, regenerieren Fisch ihre Zähne kontinuierlich während des Erwachsenenlebens ^37. Beide zuvor beschriebenen hohen Zahnsüßwasserpopulationen haben eine beschleunigte Zahnersatzrate entwickelt, ein seltenes wirbel System bietet die genetische Basis der Regeneration zu untersuchen ^36.

Eine dritte trophische Eigenschaft , die immer wieder in Süßwasser Stichlinge entwickelt hat , ist länger epibranchial und ceratobranchial Knochen, die Kiemenbogen segmentale Homologe des Ober- und Unterkiefer bzw. ^38. Längere Kiemen Knochen verleihen einen größeren Mundhöhle und sind wahrscheinlich adaptive für so dass größere Beute c zu seinonsumed. Darüber hinaus in andere Fische sind epibranchial Knochen wichtig für die Vertiefung der Rückenschlundzahnplatten ^25. Wie Kiemenreusen und Schlundzähne sind die Kiemen Knochen interne und somit schwer zu leicht zu visualisieren oder zu quantifizieren.

Hier präsentieren wir ein ausführliches Protokoll zu sezieren und Flach montieren Kiemen Skelett, was eine einfache Visualisierung und Quantifizierung einer Vielzahl von wichtigen craniofacial Züge. Während dieses Protokoll eine stickleback dissection beschrieben, arbeitet dieses gleiche Verfahren auf einer Vielzahl von anderen Fischen.

Protocol

Alle Fische Arbeit wurde von der Institutional Animal Care und Use Committee der University of California-Berkeley (Protokollnummer R330) zugelassen. Euthanasie wurde mit dem Eintauchen in 0,025% Tricaine-S mit 0,1% Natriumbicarbonat 39 gepuffert durchgeführt. Alle Schritte werden bei Raumtemperatur durchgeführt. 1. Vorbereitung Hinweis: Führen Sie die Schritte 1,1-1,5 in konische Röhrchen oder Szintillationsgefäße, die dicht verschließen kann und horizontal verlegt werden. durch vorsicht…

Representative Results

Dieses Protokoll führt zu einer seziert und flach montiert Kiemenskelett (Abbildung 4) , wo eine Vielzahl von wichtigen trophischen Merkmale quantifiziert werden können. Aus einer Rückenansicht werden alle Zeilen von Kiemenreusen, alle Zahnschlundplatten und fast alle Kiemen Knochen leicht sichtbar gemacht und quantifiziert 22 werden kann – 24,35,36,38,42. Alizarin Red S fluoresziert auch auf einem Rhodamin oder einem ähnlichen …

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10