The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.
The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.
Una quantità incredibile di diversità esiste nello scheletro testa tra i vertebrati, soprattutto tra i pesci. In molti casi questa diversità facilita differenti strategie di alimentazione 1 – 4, e può comportare importanti modifiche sia modello craniofacciale esterna e interna. Lo scheletro branchiale è situato internamente nella gola di un pesce e circonda la maggior parte della cavità buccale. Lo scheletro branchiale comprende 5 segmenti omologhi serialmente, anteriore quattro delle quali supportano branchie. Insieme, queste cinque segmenti funzionano da interfaccia tra i pesci e il loro cibo 5. Variazione in una moltitudine di tratti, tra cui branchiospine, denti faringei, e le ossa branchiali contribuire a foraggiare efficace su diversi tipi di cibo.
Spinarelli sono stati sottoposti a una radiazione adattativa dopo forme ancestrali oceaniche colonizzati laghi d'acqua dolce e torrenti in tutto l'emisfero settentrionale. Il cambiamento nella dietadal piccolo zooplancton nell'oceano di grande preda in acqua dolce ha provocato drammatica variazione trofico in diversi tratti cranio-facciali 6. Mentre molti studi si sono concentrati sulle differenze cranio esterni in spinarelli 7 – 13, importanti cambiamenti cranio-facciali evolvono più volte nello scheletro branchiale interna. La possibilità di creare ibridi fecondi tra le popolazioni spinarello morfologicamente distinte offre un'eccellente opportunità per mappare la base genetica delle modifiche si sono evoluti per lo scheletro branchiale.
Una caratteristica trofico di importanza ecologica è il patterning di branchiospine, ossa dermiche periodici che costeggiano le facce anteriore e posteriore delle ossa branchiali e sono utilizzati per filtrare prede. I pesci che in genere si nutrono di piccoli oggetti preda tendono ad avere più a lungo e più densamente spaziati Gill rakers rispetto ai pesci che si nutrono sulla preda più grande 14,15. Variazione branchiospine stato segnalato sia wntro e tra le specie 14-19, e gli aspetti di Gill raker patterning contribuiscono a nicchie trofiche e fitness 16. Decenni di ricerche hanno ampiamente documentato numero Gill raker e variazione di lunghezza in spinarelli threespine 17 – 21; Tuttavia, questi studi in genere si concentrano sulla prima fila di branchiospine. Studi recenti hanno dimostrato modularità nel controllo genetico del numero branchiali raker attraverso lo scheletro branchiale 22,23 e attraverso una singola riga in branchiali raker spaziatura 23 e lunghezza 24 mettendo in evidenza l'importanza di studiare più di remare uno o un singolo rastrello branchia per capire il sviluppo basi genetiche della riduzione Gill raker.
Un secondo tratto trofico sia di importanza ecologica e biomedica è il patterning di denti faringei. Denti in pesci possono essere posizionati sia nella mascella orale e nello scheletro branchiale, noto come i denti faringei. denti orali sono utilizzati principalmente per prey catturare mentre denti faringei sono utilizzati per la masticazione e la preda manipolazione 25 – 27. Entrambi i gruppi si formano tramite meccanismi di sviluppo condivisi e sono considerati evolutivamente omologa 28. Modularità Interessante si verifica per cui alcune specie, come zebrafish, mancanza orale e della faringe dorsale denti 29, mentre le altre specie hanno più ceratobranchials dentate, pharyngobranchials, e talvolta dentate basihyal e hypobranchials 30. In spinarelli, denti faringei si trovano ventrale al quinto ceratobranchial e dorsalmente sul anteriore e posteriore pharyngobranchials 31. Cinematica di alimentazione stickleback mostrano la mascella orale viene utilizzato principalmente per la cattura la preda e facilitare l'alimentazione di aspirazione 9 lasciando la masticazione alla mascella faringea. In ciclidi, inferiore faringeo mascella morfologia varia notevolmente 32,33 e ha dimostrato di essere adattivo e correlato con nicchia trofica 34. MultiPLE popolazioni stickleback d'acqua dolce si sono evoluti gli aumenti drammatici nella ventrale faringea numero di denti 23,35,36. Studi recenti hanno dimostrato che la base genetica evolutiva di questo guadagno dente evoluto è in gran parte distinta in due popolazioni derivate indipendentemente spinarelli d'acqua dolce 36. A differenza di denti di mammiferi, pesci rigenerare i denti continuamente per tutta la vita adulta 37. Entrambe queste popolazioni di acqua dolce dentate alti precedentemente descritti si sono evoluti un tasso di sostituzione dei denti accelerato, fornendo un sistema di vertebrati rara per studiare le basi genetiche della rigenerazione 36.
Una terza caratteristica trofica che si è evoluta più volte in spinarelli d'acqua dolce è più ossa epibranchial e ceratobranchial, le branchiali omologhi arco ribassato della mascella superiore e inferiore, rispettivamente 38. Più lunghe ossa branchiali conferiscono una grande cavità orale e probabilmente sono adattativi per consentire prede più grandi per essere Consumed. Inoltre, in altri pesci, ossa epibranchial sono importanti per la depressione delle lastre dei denti dorsale faringei 25. Come rastrelli branchiali e denti faringei, le ossa branchiali sono interni e, quindi, difficile da visualizzare o quantificare facilmente.
Qui vi presentiamo un protocollo dettagliato per sezionare e TV a montare lo scheletro branchiale, consentendo una facile visualizzazione e la quantificazione di una varietà di importanti caratteristiche cranio-facciali. Mentre questo protocollo descrive una dissezione stickleback, questo stesso metodo funziona su una varietà di altri pesci.
The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…
The authors have nothing to disclose.
This work was funded in part by NIH R01 #DE021475 to CTM and an NSF Graduate Research Fellowship to NAE. Thanks to Miles Johnson for assistance with imaging and Priscilla Erickson for critical reading of the manuscript.
Sodium Hydroxide (KOH) | EMD | PX1480-1 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | G7893-4L | |
10% Neutral Buffered Formalin (NBF) | Azer Scientific | NBF-4-G | |
Alizarin Red S | EMD | 116-12 | |
Microscope Cover Glasses 22x60mm | VWR | 16004-350 | |
100x10mm Glass Petri Dish | Kimble Chase | 23064-10010 | To dissect samples on |
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates |
Modeling Clay | Sargent Art | 22-4000 | 1lb cream |
Scintillation Vials (case of 500) | Wheaton | 66021-668 | Borosilicate Glass with Screw Cap |
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip) | FST | 11252-20 | Dumostars are an alternative |
Dissecting Scissors | FST | 15003-08 | Alternate sizes are available depending on size of sample |
Dissecting Microscope | Leica | S6E with KL300 LED | Many other models work nicely, having a flat base helps |
Microcentrifuge Tubes 1.7mL | Denville | C-2170 | |
Cardboard slide tray | Fisher | 12-587-10 |