Dissection ו-הרכבה שטוחה של שלד Threespine קוצן branchial

Summary

The branchial skeleton, including gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones, serves as the primary site of food processing in most fish. Here we describe a protocol to dissect and flat-mount this internal skeleton in threespine sticklebacks. This method is also applicable to a variety of other fish species.

Abstract

The posterior pharyngeal segments of the vertebrate head give rise to the branchial skeleton, the primary site of food processing in fish. The morphology of the fish branchial skeleton is matched to a species’ diet. Threespine stickleback fish (Gasterosteus aculeatus) have emerged as a model system to study the genetic and developmental basis of evolved differences in a variety of traits. Marine populations of sticklebacks have repeatedly colonized countless new freshwater lakes and creeks. Adaptation to the new diet in these freshwater environments likely underlies a series of craniofacial changes that have evolved repeatedly in independently derived freshwater populations. These include three major patterning changes to the branchial skeleton: reductions in the number and length of gill raker bones, increases in pharyngeal tooth number, and increased branchial bone lengths. Here we describe a detailed protocol to dissect and flat-mount the internal branchial skeleton in threespine stickleback fish. Dissection of the entire three-dimensional branchial skeleton and mounting it flat into a largely two-dimensional prep allows for the easy visualization and quantification of branchial skeleton morphology. This dissection method is inexpensive, fast, relatively easy, and applicable to a wide variety of fish species. In sticklebacks, this efficient method allows the quantification of skeletal morphology in genetic crosses to map genomic regions controlling craniofacial patterning.

Introduction

סכום מדהים של מגוון קיים בשלד הראש בין חוליות, במיוחד בקרב דגים. במקרים רבים המגוון הזה הופך לפשוט אסטרטגיות האכלה שונות ^{1 – 4,} והוא יכול לכלול שינויים משמעותיים הוא דפוסי craniofacial חיצוניים ופנימיים. שלד branchial ממוקם באופן פנימי בגרון של דג והמקיף ביותר של חלל buccal. שלד branchial מורכב 5 מקטעים הומולוגיים סדר, הקדמיים וארבעת מהם לתמוך הזימים. יחד חמישה קטעים אלה כממשק בין דגים ופירות שלהם ^5. וריאצית שפע של תכונות כולל rakers זימים, שיני בלוע, ועצמות branchial לתרום ליקוט יעיל על סוגים שונים של מזון.

הקוצנים עברו קרינה אדפטיבית לאחר צורות אושיאניק האבות יישבו אגמי מים מתוקים ונחלים ברחבי חצי הכדור הצפוני. המעבר בתזונהמ זואופלנקטון קטן באוקיינוס ​​כדי טרף גדול במים מתוקים הביא וריאציה trophic דרמטית תכונות כמה craniofacial ^6. בעוד מחקרים רבים התמקדו על הבדלי craniofacial חיצוניים הקוצנים ^{7 – 13,} שינויי craniofacial חשובים להתפתח שוב ושוב בשלד branchial הפנימי. היכולת ליצור כלאיים פורים בין אוכלוסיות קוצן ברורות מורפולוגית מספקת הזדמנות מצוינת כדי למפות את הבסיס הגנטי של שינויים התפתחו עד שלד branchial.

תכונה אחת trophic של משמעות אקולוגית היא הדפוסים של rakers זימים, עצמות עורי תקופתיות המרפדות את פניהם הקדמיים וגם אחוריים של עצמות branchial ומשמשים לסנן פריטים טרפים. דגים כי בדרך כלל ניזונים טרף קטנים נוטים להיות יותר ויותר בצפיפות הזימים במרווחים rakers לעומת דגים הניזונים טרף גדול יותר ^14,15. וריאציה rakers הזימים דווחה הן within ובין מיני ^14-19, והיבטים של דפוסי מגרפות זימים לתרום נישות trophic וכושר ^16. עשרות שנים של מחקר תיעדו בהרחבה מספר זיז הזים וריאציה בהרחבה הקוצנים threespine ^{17 – 21;} עם זאת, מחקרים אלה מתמקדים בדרך כלל בשורה הראשונה של rakers זימים. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח מודולריות בבקרה הגנטית של מספר מגרפות זימים פני שלד branchial ^22,23 ועל פני שורה אחת מגרפות זימים ריווח ²³ ואורך ²⁴ המדגיש את החשיבות של לימוד יותר משורה אחת או מגרפות זימים אחת להבין את בסיס גנטי ההתפתחותי של הפחתת מגרפות זימים.

אחת מתכונותיהן trophic שניות של שניהם המשמעות האקולוגית ביו הן הדפוסים של שיניים בלועות. שיני דגים יכולות להיות ממוקמות בשני הלסת האוראלית בשלד branchial, המכונות שיני בלוע. שיני Oral משמשות בעיקר עמ 'rey ללכוד בשיניים בלוע משמשים מניפולציה לעיסה וטרף ^{25 – 27.} שתי הסדרות יוצרים באמצעות מנגנונים התפתחותיים משותף ונחשבים מבחינה התפתחותית הומולוגיים ^28. מודולריות מעניין מתרחש תוך שלחלק מינים, כגון דג זברה, שיני בלוע פה ועל גב חוסר ²⁹ בעוד מינים אחרים ceratobranchials מספר שיניים, pharyngobranchials, ולפעמים שיני basihyal ו hypobranchials ^30. בשנת הקוצנים, שיניים בלוע נמצאים ventrally על ceratobranchial ו dorsally החמישי על הקדמי וגם האחורי pharyngobranchials ^31. קינמטיקה על האכלת קוצן להראות הלסת האוראלית משמשת בעיקר עבור לכידת טרף והקלת האכלת יניקת ⁹ עוזב לעיסה ללסת הבלוע. בשנת ציקלידים, מורפולוגיה הלסת בלוע התחתון משתנה באופן דרמטי ^32,33 ו הוכח להיות אדפטיבית בקורלציה עם נישה trophic ^34. רַבאוכלוסיות קוצן מים מתוקים ple התפתחו מגדילה דרמטית במספר שן בלוע גחון ^23,35,36. מחקר שנערך לאחרונה הוכיח כי הבסיס הגנטי ההתפתחותי של רווח השן התפתח זה הנו ייחודי, בעיקר בשתי אוכלוסיות נגזרות עצמאי של הקוצנים מים מתוקים ^36. בניגוד שיניים יונקים, דגים להתחדש שיניהם ברציפות לאורך החיים הבוגרים ^37. שתי אוכלוסיות מים מתוקות שיניים גבוהות שתוארו לעיל אלה התפתחו בקצב החלפת שן מואץ, ובכך יוצרים מערכת החולייתנים נדירה לחקר הבסיס הגנטי של התחדשות ^36.

אחת מתכונותיהן trophic שלישי התפתח שוב ושוב הקוצנים מים מתוקים ארוכה עצמות epibranchial ו ceratobranchial, את homologs קשת המגזרי branchial של הלסת העליונה והתחתונה, בהתאמה ^38. עצמות branchial ארוכות להעניק חלל buccal גדול וסבירות הם אדפטיבית על שאפשרו פריטי טרף גדולים להיות גonsumed. יתר על כן, בדגים אחרים, עצמות epibranchial חשובות לדיכאון של צלחות שן בלוע הגבה ^25. כמו זיז זים ושיני בלוע, עצמות branchial הן פנימיות ולכן, קשה לדמיין או לכמת בקלות.

כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לנתח שטוח הר שלד branchial, המאפשרים הדמיה קלה וכימות של מגוון תכונות craniofacial חשובים. בעוד פרוטוקול זה מתאר לנתיחת קוצן, באותה שיטה זו פועלת על מגוון רחב של דגים אחרים.

Protocol

כל העבודה דגים אושרה על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השתמש מאוניברסיטת קליפורניה-ברקלי (מספר פרוטוקול R330). המתת חסד בוצעה באמצעות טבילה 0.025% Tricaine-S שנאגרו עם 0.1% נתרן ביקרבונט 39. כל השלבים מבוצעים בטמפרטורת החדר. 1. הכנה <p style=";text-align:r…

Representative Results

תוצאות פרוטוקול זה שלד branchial רכוב גזור ושטוח (איור 4) שבו מגוון של תכונות תזונתיות חשובות ניתן לכמת. מתוך תפיסת גב, כל השורות של rakers זימים, כל צלחות השן בלועה, וכמעט כל עצמות branchial ניתן מדמיינים בקלות לכמת 22 – 24,35,36,38,42. Alizarin ?…

Discussion

The branchial skeleton is a complex set of bones in the throat of a fish that manipulates, filters, and masticates food items on their way to the esophagus. Many interesting trophic traits including the patterning of gill rakers, pharyngeal teeth, and branchial bones vary across and within species. The majority of these traits are difficult to near impossible to accurately measure with the branchial skeleton in situ (e.g., gill raker length, branchial bone length). This flat-mounting protocol places all…

Materials

Sodium Hydroxide (KOH)	EMD	PX1480-1
Glycerol	Sigma-Alderich	G7893-4L
10% Neutral Buffered Formalin (NBF)	Azer Scientific	NBF-4-G
Alizarin Red S	EMD	116-12
Microscope Cover Glasses 22x60mm	VWR	16004-350
100x10mm Glass Petri Dish	Kimble Chase	23064-10010	To dissect samples on
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Ellsworth Adhesives	184 SIL ELAST KIT 0.5KG	Can be poured into glass or plastic petri dishes to make dissecting plates
Modeling Clay	Sargent Art	22-4000	1lb cream
Scintillation Vials (case of 500)	Wheaton	66021-668	Borosilicate Glass with Screw Cap
Forceps-Dumont #5 Inox (Biologie tip)	FST	11252-20	Dumostars are an alternative
Dissecting Scissors	FST	15003-08	Alternate sizes are available depending on size of sample
Dissecting Microscope	Leica	S6E with KL300 LED	Many other models work nicely, having a flat base helps
Microcentrifuge Tubes 1.7mL	Denville	C-2170
Cardboard slide tray	Fisher	12-587-10