Introduction
والإنتاجية العالية التقنية وحيدة الخلية فحص وضعت مؤخرا تسمح أنزيمات جديدة ليتم فرزهم من مكتبة الوراثية على نطاق واسع على أساس الأنشطة الوظيفية 1. على مستوى خلية واحدة، ويعمل البروتينات التي تنظم النسخ لتحريك التعبير الجيني مراسل بواسطة الاستشعار عن بعد الجزيئات الصغيرة التي تنتج نتيجة لنشاط إنزيم الهدف. تشارك نهج واحد في وقت مبكر من العزلة من الاوبرون الفينول مهينة من رالستونيا eutropha E2 باستخدام التعبير الجيني الناجم عن الركيزة فحص (SIGEX) الأسلوب، الذي الركيزة أن تتجسد في التعبير عن بروتين مراسل 2. وقد استخدم نهار الزائفة الكريهة لتحديد البنزالدهايد نازعة 3، وLysG من الوتدية glutamicum استخدمت لفحص عالية الإنتاجية من سلالة جديدة إنتاج L-يسين من المكتبات متحولة متنوعة (4).
سابقا، وهو screeni انزيم الوراثيةواقترح نظام نانوغرام (GESS) كمنبر الفحص المطبقة عموما 5. يستخدم هذا النظام dimethylphenol منظم-الاعتراف الفينول، دي إم بي آر، من P. الكريهة. دي إم بي آر (E135K)، ومتحولة من دي إم بي آر، ويمكن أيضا أن تستخدم في GESS (PNP-GESS) للكشف عن -nitrophenol ص (PNP). في وجود الانزيمات هدف إنتاج مركبات الفينول، GESS في E. خلايا القولونية تنبعث إشارة مضان، مما يتيح للعزلة السريع من الخلايا واحدة باستخدام فارز مضان تنشيط الخلايا (FACS). ولكن التعبير عن انزيم metagenomic يبدو أضعف من أن الإنزيمات المؤتلف التقليدية؛ وبالتالي، تم تصميم GESS للكشف عن المركبات الفينولية مع أقصى قدر من الحساسية من خلال التحقيق في مزيج من الموقع الريباسي ملزم (RBS) وتسلسل فاصل جنبا إلى جنب مع أفضل حالة التشغيل 5.
واحدة من المزايا الأساسية للGESS غير أن هذا الأسلوب واحد يسمح نظريا فحص اوفإيه من 200 أنواع مختلفة من الانزيمات في قاعدة البيانات بريندا (الجدول 1، HTTP: // www.brenda-enzymes.info، 2013،7) ببساطة عن طريق استخدام ركائز مختلفة. فقد تبين أن السيلولوز، والليباز، وباراثيون الميثيل هيدرولاز (ميلا في الساعة) ويمكن الكشف عن استخدام PNP-GESS مع ركائز المناسبة من ص الزبدات -nitrophenyl، ص -nitrophenyl-cellotrioside، وباراثيون الميثيل، على التوالي 5. في الآونة الأخيرة، وقد ثبت أن الفوسفاتيز القلوية (ا ف ب)، التي تعد واحدة من الانزيمات الجديدة التي تم تحديدها باستخدام PNP-GESS، هو أول AP بالحرارة وجدت في metagenomes البحرية تكييفها بارد-6.
هنا، يتم تقديم تفاصيل عملية الفرز مع PNP-GESS الكشف عن أنشطة ثلاثة أنواع مختلفة من الليباز enzymes-، السيلولوز، والفوسفاتيز القلوية-وتحديد الانزيمات مرشح جديدة من مكتبة metagenomic 5،6 بسرعة. وتشمل عمليات تجهيزها metagenome مع PNP-GESS وتعمل على فلوريداآه الخلوي فارز. في حين أن الزيارات التي تم الحصول عليها سوف تحتاج إلى أن يكون متتابعا لمزيد من التحديد ويشمل هذا البروتوكول الإجراء وصولا إلى خطوات التأكيد نشاط انزيم باستخدام التدفق الخلوي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. إعداد مكتبة Metagenomic مع PNP-GESS
- بناء مكتبة metagenomic في E. القولونية مع ناقل فوزميد باستخدام طقم إنتاج مكتبة فوزميد وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة 5.
- قسامة 100 ميكرولتر من مكتبة لتخزين في -70 درجة مئوية، وهو مصدر للخلايا مكتبة metagenomic.
ملاحظة: الكثافة الضوئية لعينة تقاس بطول موجي 600 نانومتر (OD 600) من هذا المخزون مكتبة ما يقرب من 100. - ذوبان الجليد 100 ميكرولتر من رصيد المكتبة metagenomic على الجليد وتطعيم في قارورة 500 مل تحتوي على 50 مل لوريا، Bertani (LB) و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول تليها 37 درجة مئوية الحضانة لمدة 2 ساعة.
- حصاد الخلايا في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل بواسطة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- resuspend الكرية بسرعة في 50 مل من الماء الجليد الباردة المقطر (DW) وأجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة في 4 درجات مئوية مرة أخرى.
- الدقةuspend بيليه في 50 ميكرولتر DW-الجليد الباردة مع 10٪ (ت / ت) الجلسرين. استخدام 50 ميكرولتر من هذه قسامة خلية ل electroporation.
- وضع خليط من خلايا electrocompetent 50 ميكرولتر وpGESS (E135K) 5 الحمض النووي (100ng) في كفيت Electroporation للالمثلج وelectroporate (1.8 كيلو فولت / سم، 25 μF) الخليط.
- بسرعة إضافة 1 مل سوبر مرق الأمثل مع مقيضة القمع (SOC) المتوسطة و resuspend الخلايا برفق.
- نقل الخلايا إلى أنبوب 14 مل جولة القاع باستخدام ماصة واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
- نشر 500 ميكرولتر من الخلايا تعافى على LB 20 × 20 سم لوحة مربعة تحتوي على 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول و 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين. احتضان لوحة عند 30 درجة مئوية لمدة 12 ساعة.
- تتخلص من المستعمرات باستخدام مكشطة الخلية وجمع الخلايا في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل باستخدام وسائط التخزين المحمولة الجليد الباردة.
- أجهزة الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. Resuspend وبيليه في 10 مل وسائط التخزين المحمولة المثلجمن أجل التوصل إلى OD 600 من 100.
- قسامة 20 ميكرولتر من الخلايا لتخزين في -70 درجة مئوية.
2. إزالة ايجابيات كاذبة من مكتبة Metagenomic
- ذوبان الجليد في الأوراق المالية خلايا مكتبة metagenomic (من الخطوة 1.13) التي تحتوي على metagenomic فوزميد الحمض النووي وpGESS (E135K) على الجليد.
- تطعيم 10 ميكرولتر من الخلايا في 2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 14 مل أنبوب جولة القاع. احتضان عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 4 ساعة.
- وفي الوقت نفسه، بدوره على الجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية وفتح البرنامج FACS الافتراضية. استخدام الإعدادات التالية: فوهة قطرها الحافة، 70 ميكرون. منطقة مبعثر إلى الأمام (FSC-A) حساسية، 300 التضخيم الخامس لوغاريتمي. منطقة مبعثر الجانب (SSC-A) حساسية، 350 التضخيم الخامس لوغاريتمي. منطقة ثيوسيانات فلوريسئين (FITC-A) حساسية، 450 التضخيم الخامس لوغاريتمي. معلمة عتبة، FSC-A قيمة 5.
ملاحظة: يتم إعطاء الإعدادات النموذجيةللجهاز نظام مراقبة الأصول الميدانية المذكورة في الجدول المواد. ضبط الإعدادات لأجهزة نظام مراقبة الأصول الميدانية الأخرى. - تمييع الخلايا مكتبة metagenomic من الخطوة 2.2 عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من العينة لأنبوب أسفل مستديرة 5 مل تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني.
- ضع عينة مكتبة المخفف على ميناء التحميل الصك FACS وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية.
- ضبط معدل الحدث 1000 - 1500 أحداث / ثانية عن طريق النقر والسيطرة على أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
- إنشاء سجل تحجيم FSC-A مقابل سجل تحجيم SSC-A مؤامرة مبعثر على ورقة عمل عالمية عن طريق النقر على زر مؤامرة نقطة في شريط الأدوات. ضبط بوابة مبعثر R1 لتشمل الأحداث القميص (السكان البكتيرية) باستخدام زر مضلع بوابة في شريط الأدوات.
- رسم بياني مع عدد خلايا مقابل سجل تحجيم FITC-A في ورقة العمل عن طريق النقر على زر الرسم البياني. ثم، وضبط الجهد FITC من Cytomeعلامة التبويب إعدادات ثالثا في إطار مراقبة المفتش بحيث ذروة التوزيع على شكل جرس أقل من 10 2 من FITC-A.
- إنشاء سجل تحجيم FSC-A مباراة. سجل FITC-A مؤامرة من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل العالمية. تعيين بوابة R2 فرز على مؤامرة باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات بحيث يقع البوابة بين + 5٪ و -5٪ الخلايا من مركز التوزيع (مجموع الخلايا 10٪ حول ذروة بيل- رئيس مؤسسة منحنى على شكل).
- وضع أنبوب جمع تحتوي على 1.2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول عند مخرج الصك FACS وفرز 10 6 خلايا إرضاء كل من R1 و R2 البوابات.
- إزالة أنبوب جمع، وكأب، وبلطف دوامة.
3. Metagenomic أنزيم فحص
- احتضان الخلايا مرتبة (من الخطوة 2.11) عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى OD 600 تصل إلى 0.5.
- إضافة 1 ميكرولتر نسخة الحل تحريض لتضخيم الخلايا في عدد النسخ فوزميد. احتضان الخلايا ل3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
- لإعداد الخلايا للفرز وإضافة 0.5 مل من الخلايا المستزرعة والركيزة المناسبة (ص -nitrophenyl خلات، ص -nitrophenyl-β-D-cellobioside، أو الفوسفات فينيل) في أنبوب 14 مل جولة القاع بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
- لعينة السيطرة، إضافة 0.5 مل من الخلايا المستزرعة من الخطوة 3.2 إلى 14 مل أنبوب جولة القاع. إضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني، حيث بلغ حجم الركيزة في الخطوة 3.3.
- احتضان العينتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعة.
- وفي الوقت نفسه، وإعداد الجهاز FACS مع نفس تكوينات كما الخطوة 2.3.
- إضافة 5 ميكرولتر من الخلايا (للفرز) والخلايا السيطرة لمدة 5 مل أنابيب جولة القاع التي تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني، على التوالي.
- وضع أنبوب يحتوي على خلايا السيطرة على ركان ميناء التحميل من نظام مراقبة الأصول الميدانية وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية عن طريق التحكم أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
- تحجيم إنشاء سجل FSC-A مقابل سجل تحجيم SSC-A مؤامرة مبعثر من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل العالمية للبرمجيات وضبط بوابة مبعثر R1 لتشمل الأحداث القميص (السكان البكتيرية) باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات.
- تحجيم إنشاء سجل FSC-A مقابل سجل تحجيم FITC-A مؤامرة مبعثر من خلال النقر على زر مؤامرة نقطة في ورقة العمل ووضع بوابة R2 فرز على مؤامرة باستخدام زر مضلع بوابة على شريط الأدوات بحيث أقل من 0.1٪ من تم الكشف عن خلايا السلبية داخل بوابة R2.
- استبدال أنبوب عينة التحكم مع أنبوب عينة الفرز، وضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية عن طريق التحكم في أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
- وضع أنبوب جمع تحتوي على 0.5مل LB عند مخرج الصك FACS وفرز 10 4 خلايا إرضاء كل من بوابات R1 و R2.
ملاحظة: معيار الفرز يمكن أن تتراوح من أعلى بنسبة 0.1٪ إلى 5٪ من FITC-A في بوابة R2. في هذا البروتوكول، جمعت أعلى خلايا 1٪ كما ايجابيات. - إزالة أنبوب جمع، وكأب، وبلطف دوامة.
- نشر 0.5 مل العينات التي تم جمعها على اثنين من لوحات أجار (90 ملم أطباق بتري) التي تحتوي على LB، 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين، 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول واحتضان لوحة عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
- إذا لزم الأمر، نفذ جولات إضافية من الفرز لFITC-A تخصيب بتكرار الخطوات 3،1-3،14.
4. هيت تأكيد اختيار ونشاط انزيم
- تحليل التدفق الخلوي
- من لوحة المحتضنة في الخطوة 3.14، حدد مستعمرة تظهر أي مضان باستخدام منتقي مستعمرة تحت المراقبة من 488 نانومتر الطول الموجي لإضاءة LED.
- تطعيم مستعمرة المحدد في 14 مل ريال عمانيالقاع اوند أنبوب يحتوي على 2 مل LB يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الأمبيسلين و 12.5 ميكروغرام / مل الكلورامفينيكول في 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة حتى OD في 600 تصل إلى 0.5.
- إضافة 2 ميكرولتر نسخة الحل تحريض لتضخيم الخلايا في عدد النسخ فوزميد. احتضان الخلايا ل3 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 250 دورة في الدقيقة.
- إعداد 14 مل أنبوب جولة القاع وإضافة 1 مل من الخلايا المستزرعة (الخطوة 4.1.3). إضافة الركيزة المناسبة (ص -nitrophenyl خلات، ص -nitrophenyl- β-D-cellobioside، أو الفوسفات فينيل) بتركيز نهائي من 100 ميكرومتر.
- لعنصر تحكم، إضافة 1 مل الخلايا المستزرعة من الخطوة 4.1.3 إلى 14 مل أنبوب جولة القاع وإضافة نفس الحجم من برنامج تلفزيوني، حيث بلغ حجم الركيزة في الخطوة 4.1.4.
- احتضان العينتين عند 37 درجة مئوية مع اهتزاز عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 3 ساعة.
- وفي الوقت نفسه، وإعداد الجهاز FACS مع نفس تكوينات كما الخطوة 2.3.
- إضافة 5 ميكرولتر من الخلايا السيطرة والركيزة المعالجة إلى 5 مل أنابيب جولة القاع التي تحتوي على 1 مل برنامج تلفزيوني، على التوالي.
- وضع أنبوب يحتوي على خلايا السيطرة على ميناء التحميل من الجهاز FACS وانقر على زر تحميل على اقتناء لوحة من البرنامج نظام مراقبة الأصول الميدانية. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية باستخدام أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
- انقر على زر شراء لقياس FITC-A.
- استبدال أنبوب العينة الضابطة مع الركيزة تعامل أنبوب العينة. ضبط معدل الحدث 1000 - 3000 أحداث / ثانية باستخدام أزرار معدل التدفق على لوحة القيادة.
- انقر على زر شراء لقياس FITC-A.
- مقارنة مضان من مجموعتي الخلايا عن طريق التآمر رسم بياني لعدد خلايا مقابل سجل تحجيم FITC-A.
- فحوصات أخرى لتأكيد نشاط انزيم
- لمزيد من التعرف على المرشحين الإنزيم المحدد، استخراج الحمض النووي فوزميد باستخدام معيار استخراج المواليةcedures من مجموعات استخراج التجارية وتحليل تسلسل النوكليوتيدات، أو اختبار في المختبر نشاط انزيم 6،7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم فحص ركائز الفينولية ثلاثة لتحديد الانزيمات metagenomic جديدة من مكتبة metagenome من رواسب مسطحة المحيط المد والجزر في تيآن، كوريا الجنوبية باتباع البروتوكول المقترح. لبناء مكتبة، ومتوسط 30 - تم إدراج تسلسل metagenome 40 كيلوبايت في fosmids، والتي تقوم على E. القولونية F عامل ريبليكون وكما عرضت نسخة واحدة في الخلية. لاحظ أن fosmids وقد استخدمت على نطاق واسع لبناء مكتبات الجينوم معقدة بسبب انتشار مستقر لها 8.
ويبين الشكل 1 مخططا موجزا للبروتوكول الفحص بما في ذلك إزالة ايجابيات كاذبة مع الفرز سلبي (الشكل 1)، يليه اختيار ضرب إيجابية مع R1 و R2 فرز بوابات (الشكل 1 ب). تم تقييم الفعالية من خلال مقارنة مضان من العينات مع وبدون ركائز(الشكل 1 C). في حالة ع -nitrophenyl خلات فحص بوساطة، وتأكدت خمسة مرشحين من الليباز حيث كان مضان من الخلايا الركيزة تعامل أعلى من الخلايا السيطرة (الشكل 2). وعلى الرغم من التوزيعات واسعة من المرشحين الثلاثة من السيلولوز في الشكل 2 B، فإنها أظهرت أيضا اختلافات واضحة في متوسط كثافة FITC من السكان. أظهر أربعة مرشحين الفوسفاتيز أيضا مستوى مضان عالية مقارنة مع الخلايا السيطرة (الشكل 2 C). الفرق أكثر مضان بين الخلايا السلبية والمرشح للنشاط انزيم أقوى يمكن استخلاصه منذ مراسل مضان من الحزب التقدمي الجديد، GESS يظهر استجابات الكمية لتركيزات الفينول 5.
في هذا البروتوكول، فقط تأكدت الخلافات مضان باستخدام التدفق الخلوي ولكن مختلف المقايسات ويمكن التعرف على أن تطبق ق المذكورة في الخطوة 4.2. يوضح الشكل (3) مثال AP تحديد 6. كان التسلسل استنساخ اختيار بين سبعة وأربعين المستعمرات الفلورسنت عالية من الفحص وتم التعرف على ORF المرشح AP. وأكد ORF إدراجها في ناقلات البلازميد أن يكون النشاط AP مع التدفق الخلوي. في الشكل 3، يظهر ضرب إشارة مضان أقوى من الخلايا التي تحمل البلازميد فارغة (سلبي). اكتشف المزيد من التحليل لتسلسل وفي النشاط الأنزيمي المختبر أن هذا AP كانت مشابهة جدا لنقاط وصول الأخرى المعروفة في خصائصه الإنزيمية باستثناء ارتفاع النشاط التحفيزي في درجات حرارة منخفضة (35 درجة مئوية)، وعدم الاستقرار الحراري ملحوظا (65 درجة مئوية) في غضون 15 دقيقة 6 . وبالإضافة إلى ذلك، كانت وكالة اسوشييتد برس فحص مقارنته المتاحة تجاريا الجزائرية في إزالة الفوسفات الطرفية من طرفي متماسكة وحادة من خطي DNA البلازميد 6.
رقيقة الصفحات = "1"> 
الشكل 1: موضوع أنزيم عملية الفرز (أ) إزالة الخلايا إيجابية كاذبة تظهر مضان دون الركيزة. وتقع البوابة الفرز في وسط الكثافة السكانية الخلية بحيث تتضمن البوابة 10٪ من مجموع الخلايا. (ب) الفرز الفلورسنت عالية (FITC-A) خلايا (إيجابية) تلبية R1 و R2 بوابات في وجود الركيزة المناسبة. (C) وبعد اختيار وعزل خلية واحدة، تم فحص نشاط الانزيمات مرشح مع وبدون الركيزة (كما تدل W / وW / O ركائز، على التوالي). الفرق إشارة واضحة بين العينتين يوحي ناقلات فوزميد من الخلايا تحتوي على المعلومات الوراثية الهدف من الفائدة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. 
الشكل 2: آخر تقييم الإنزيم باستخدام التدفق الخلوي المرشحين انزيم Metagenomic فحص من قبل الحزب الوطني التقدمي GESS مع ثلاث ركائز مختلفة (A) ص -nitrophenyl خلات (pNPA)، (ب) ص -nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2)، و. (C) فينيل الفوسفات. تظهر جميع المرشحين الفرق إشارة واضحة بين الخلايا مع وبدون الركيزة. الضوابط هي الخلايا من دون علاج الركيزة يناظرها. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل (3): الفوسفاتاز القلوية أناتلون العاج. اللوحة اليمنى يظهر الفرق واضحا بين مضان الخلايا التي تحتوي على انزيم ضرب وناقلات البلازميد فارغة (سلبي). على اليمين، يظهر الفوسفاتيز فحص الخلايا إيواء مرشح الجينات الفوسفاتيز في ناقلات البلازميد على LB أجار التي تحتوي على الفوسفات 5-برومو-4-كلورو-3-indolyl باعتبارها الركيزة اللونية. وتشير المستعمرات الزرقاء التي الخلايا المحددة تحتوي على الجين metagenomic ترميز الفوسفاتيز. الاطلاع على 6 لمزيد من التفاصيل. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| عدد EC | وصف | عدد المنتجة ف نيتروفينول الانزيمات | رقم لإنتاج الفينول الانزيمات | |
| EC 1 </ td> | 1.3 | بناء على مجموعة CH-CH المانحين | - | 1 |
| إنزيم أكسدة-اختزال | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | بناء على المانحين المقترنة، مع التأسيس أو | - | 2 | |
| الحد من الأوكسجين الجزيئي | ||||
| EC 2 | 2.3 | Acyltransferases | 1 | - |
| ترانسفيراز | 2.4 | Glycosyltransferases | 8 | - |
| 2.5 | نقل ألكيل أو أريل الجماعات، وغيرها من مجموعات الميثيل | 1 | 1 | |
| 2.7 | نقل المجموعات التي تحتوي على الفوسفور | 1 | 1 | |
| 2.8 | نقل المجموعات التي تحتوي على الكبريت | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | قانون السندات استر | 67 | 16 |
| هيدروليز | 3.2 | Glycosylases | 75 | 21 |
| 3.4 | قانون السندات الببتيد - ببتيداز | 26 | 4 | |
| 3.5 | قانون سندات الكربون النيتروجين، وغيرها من السندات الببتيد | 5 | 3 | |
| 3.6 | قانون أنهيدريدات الأحماض | 4 | - | |
| 3.7 | قانون سندات الكربون الكربون | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | lyases الكربون الكربون | - | 3 |
| Lyases | 4.2 | lyases الكربون والأوكسجين | 1 | - |
| 4.3 | lyases الكربون النيتروجين | 1 | - | |
| عدد الفرعي من الانزيمات | 197 | 53 | ||
| عدد من الأنزيمات (باستثناء الانزيمات تتداخل) | 211 | |||
الجدول 1: عدد من الإنزيمات التي تنتج ص -nitrophenol أو الفينول من قاعدة البيانات بريندا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
زيادة كفاءة إنتاج البيولوجية الحفازة هو المفتاح لنجاح الحيوية والكيميائية القائمة على الصناعة 9 و metagenome يعتبر واحدا من أفضل مصدر الانزيم الطبيعي. في هذا المعنى، لا بد من فحص أنزيمات جديدة من metagenome حيث لم تستكشف أغلبية الموارد الوراثية 10. وقد وضعت عدة طرق الفحص الذي كشف عن مباشرة انزيم المنتجات باستخدام منشطات النسخ 11 و 12 ولكن هذه التقنيات تتطلب نظام النسخي-الأيض استجابة محددة. من ناحية أخرى، GESS ينطبق على نطاق واسع اعتمادا على استخدام الفينول أو PNP الموسومة ركائز. على الرغم من أن معظم الإنزيمات ذكرت إنتاج الفينول أو PNP المركبات في قاعدة بيانات بريندا (الجدول 1)، (بما في ذلك ثلاثة أمثلة في هذا العمل) تنتمي إلى هيدرولاز (EC رقم 3) الإنزيمات الصف، استكشاف ركائز الفينول أكثر تنوعا وحتى تصميم اصطناعية الركيزة إخضاع لاستهداف نشاط انزيم، كبدائل من ركائز الطبيعية، يمكن أن تمتد إلى حد كبير من تطبيق نظام الفرز. لاحظ أن اختيار الفينول المناسب أو PNP الموسومة الركيزة هي واحدة من الخطوات الحاسمة لتطبيق PNP-GESS منذ نفاذية الغشاء الخلوي وتأثير الركيزة كبير التأثير على بروتوكول الفرز. هنا، وتبين لنا أن مهمة صناعيا ثلاثة أنواع مختلفة من الانزيمات يمكن تحديدها بطريقة عالية الإنتاجية باستخدام نظام الفرز واحد.
نهج استخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، بالإضافة إلى فحص عالية الإنتاجية من الانزيمات metagenomic، يمكن أن تطبق أيضا على هندسة المنظمين النسخي (TRS) لخصوصية TR المتغيرة. ومن الأمثلة على ذلك الدراسة التي تم عزل والبديل أراك أن الكشف عن ميفالونات بدلا من أرابينوز باستخدام نظام مراقبة الأصول الميدانية، ومن ثم يعمل على الخلايا شاشة إنتاج ميفالونات 13. أيضا، قد سمحت لتغيير خصوصية TRS لفورثالهندسة إيه من نشاط انزيم. ينظم السيارات-TR، PcaU، تم هندستها لكشف 3،4-dihydroxybenzoate (34DHB) ومن ثم تطبيقها للكشف عن الانزيمات نازعة الماء dehydroshikimate (AsbF) في أقصى نشاط لها تحويل dehydroshikimate الذاتية ل34DHB 14. المفهوم الأساسي من هذه الدراسات هو مماثلة لتلك التي PNP-GESS، منذ PNP-GESS يستخدم دي إم بي آر البديل للكشف عن الحزب التقدمي الجديد ويظهر أداء الإنتاجية العالية في فحص من مكتبة الوراثية على نطاق واسع. ومع ذلك، قد يسبب الهندسة خصوصية ايجابيات كاذبة غير مقصودة بين الزيارات، كما أنه من الممكن أن يطلق تعبير مراسل بواسطة محرضات أخرى نتيجة لخصوصية توسيع. ولذلك، سيكون من المرغوب فيه للتحقيق في التعامد الاستجابة TR قبل تطبيق TR. من ناحية أخرى، وزيادة حساسية ومجموعة ديناميكية من TR يمكن أن يعوض عن الجيل ايجابية كاذبة. على سبيل المثال، تم تحسين حساسية GESS عن طريق إدراج RBS الأمثل وsequ فاصلبسبب الخلافات في النظام. ايجابيات كاذبة من نظام الفرز ربما يأتي من خلل في الدائرة الوراثية، والمواد الكيميائية الفينولية غير مقصودة تفعيل TR، نمو الخلايا غير متجانسة، ونشر خالية من الفينول أو PNP. وكان من المتوقع 2.9 لإزالة الخلايا إيجابية كاذبة الإفراج عن مضان دون علاج الركيزة - عمليات الاختيار السلبية للخطوات 2.1. هذه الخلايا إيجابية كاذبة يمكن أن تخفض أيضا من خلال تعظيم إشارة إلى نسبة الضوضاء من الدائرة الوراثية. جنبا إلى جنب مع رويال بنك أوف سكوتلاند والهندسة فاصل، واستخدام وسائل الإعلام M9-الجلوكوز تحسن كبير في إشارة (7 أضعاف أعلى من وسائل الاعلام LB) في أداء الحزب التقدمي الجديد، GESS 5. ولكن، في هذا البروتوكول، وكان يستخدم LB كحل وسط بين التعبير الجيني metagenomic غير معروف وGESS كثافة الإشارة. التحقيق ظروف أكثر حساسية من نمو الخلايا PNP-GESS وتأثير الركيزة في M9-الجلوكوز تمكن من تحسين كثافة إشارة. تنظيم ضيق الوقت رد فعل من ركائز، في الخطوة 3.5، هومن المهم أيضا لمنع ايجابيات كاذبة الناجمة عن الفينول أو PNP نشرها.
GESS يمكن تحويل وظيفة الانزيم في التعبير البروتين مراسل بوساطة النسخ على مستوى وحيدة الخلية ولكن تحديد غير المباشر عن طريق البروتين مراسل يمكن أن يكون واحدا من القيود الفطرية. لذلك، في المختبر انزيم فحص وتحليل LC / GC-MS منتج يحتاج الواجب اتباعها لتحديد واضح للمرشح انزيم المفترض 6،7. كما أنه من الممكن استخدام GESS دون الحاجة لتحليل FACS مكلفة عن طريق ربط للصحفيين بديل مثل الجينات المقاومة للمضادات الحيوية أو الانزيمات اللونية مع الصحفيين الفلورسنت. لمزيد من التحسين من التطبيقات GESS، فمن الضروري وضع طريقة لتميز نشاط الإنزيم وتحديد الانزيمات بطريقة الإنتاجية العالية. جنبا إلى جنب مع تقنيات عالية الإنتاجية الأخرى، مثل الجيل المقبل من التسلسل، وGESS تكون الإستراتيجية المستخدمة على نطاق واسع للبروتين وenzyلي الهندسة المحفز في الصناعة القائمة على البيولوجيا.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
