Introduction
En nyligen utvecklad hög genomströmning single-cellanalys teknik tillåter nya enzymer som skall screenas från en storskalig genetiska bibliotek baserat på deras funktionella aktiviteter 1. Vid den enda cellnivå, är proteiner som reglerar transkription som används för att utlösa reportergenuttryckning genom att avkänna små molekyler som produceras som ett resultat av en mål-enzymaktivitet. En tidig metod involverade isolering av en fenol-nedbrytande operonet från Ralstonia eutropha E2 användning av substratet-inducerade genetiskt uttryck screening metoden (SIGEX), i vilken substratet leder till uttryck av ett reporterprotein 2. NHAr av Pseudomonas putida användes för att välja bensaldehyd dehydrogenas 3, och LysG från Corynebacterium glutamicum användes för high-throughput screening av ett nytt L-lysin-producerande stam från olika mutantbibliotek 4.
Tidigare en genetisk enzym screening-systemet (GESS) föreslogs som en allmängiltig screening plattform 5. Detta system använder fenol igenkännande dimetylfenol regulator, DmpR, P. putida. DmpR (E135K), och en mutant av DmpR, kan också användas i GESS (pNP-GESS) för detektering av p-nitrofenol (PNP). I närvaro av målenzymer producerar fenolföreningar, GESS i E. coli-celler emitterar en fluorescenssignal, vilket möjliggör snabb isolering av enskilda celler med användning av en fluorescensaktiverad cellsorterare (FACS). Men uttrycket av metagenomic enzym verkar vara svagare än konventionella rekombinanta enzymer; Därför var GESS utformad för att upptäcka fenolföreningar med maximal känslighet genom att undersöka kombinationen av ribosomalt bindningsställe (RBS) och terminatorsekvenser tillsammans med optimal driftstillstånd 5.
En av de grundläggande fördelarna med GESS är att denna enda metod tillåter teoretiskt screening av over än 200 olika typer av enzymer i BRENDA databas (Tabell 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) genom att helt enkelt anställa olika substrat. Det visades att cellulas, lipas, och metylparation hydrolas (MPH) kan detekteras med användning pNP-GESS med lämpliga substrat av p-nitrofenyl butyrat, p-nitrofenyl-cellotrioside, och metylparation, respektive 5. Nyligen var det visat sig att ett alkaliskt fosfatas (AP), som är ett av de nya enzymerna identifierade med användning av pNP-GESS, är den första termolabila AP hittas i kall anpassad marina metagenomes 6.
Här, detaljer av genomgången presenteras med pNP-GESS upptäcka verksamheten i tre olika typer av enzymes- lipas, cellulas, och alkalisk fosfatas -och snabbt identifiera nya kandidat enzymer från en metagenomic bibliotek 5,6. Processerna omfattar metagenome förbehandling med pNP-GESS och driva en flow cytometry sorterare. Medan träffar som erhållits kommer att behöva sekvenseras för ytterligare identifiering, detta protokoll omfattar förfarandet fram till stegen enzymaktivitet bekräftelse med hjälp av flödescytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Förbereda metagenomic bibliotek med pNP-GESS
- Konstruera en metagenomic bibliotek i E. coli med en fosmid vektor med hjälp av en fosmid bibliotek produktion kit enligt tillverkarens protokoll 5.
- Alikvot 100 | il av bibliotek för lagring vid -70 ° C, vilket är en källa till metagenomic biblioteksceller.
Obs: Den optiska densiteten av ett prov mättes vid en våglängd av 600 nm (OD 600) av detta bibliotek lager är cirka 100. - Tina 100 pl av lager metagenomic biblioteket på is och inokulera i en 500 ml kolv innehållande 50 ml Luria-Bertani (LB) och 12,5 pg / ml kloramfenikol följt av 37 ° C inkubation under 2 h.
- Skörda cellerna i ett 50 ml koniskt rör genom centrifugering vid 1000 xg under 20 min vid 4 ° C.
- Återsuspendera pelleten snabbt i 50 ml iskallt destillerat vatten (DW) och centrifugera vid 1000 xg under 20 min vid 4 ° C igen.
- resuspend pelleten i 50 | j, l iskall DW med 10% (volym / volym) glycerol. Använd 50 pl av denna cell portion för elektroporering.
- Placera blandning av elektro celler 50 l och pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) i en iskall elektroporationskyvett och electroporate (1,8 kV / cm, 25 iF) blandningen.
- Snabbt tillsätt 1 ml super optimal buljong med katabolitrepression (SOC) medium och återsuspendera cellerna försiktigt.
- Överföra celler i 14 ml rundbottnad rör med hjälp av en pipett och inkubera vid 37 ° C under 1 timme.
- Sprid 500 pl av de utvunna cellerna på en LB 20 x 20 cm fyrkantig platta innehållande 12,5 | j, g / ml kloramfenikol och 50 | ig / ml ampicillin. Inkubera plattan vid 30 ° C under 12 h.
- Skrapa kolonier med användning av en cellskrapa och samla cellerna i ett 50 ml koniskt rör med användning av iskall cell lagringsmedia.
- Centrifugera vid 1000 xg under 20 min vid 4 ° C. Suspendera pelleten i 10 ml iskall cell lagringsmediaatt nå en OD 600 av 100.
- Alikvot 20 pl av cellerna för lagring vid -70 ° C.
2. Ta bort Falska positiva från metagenomic Library
- Tina aktie metagenomic biblioteksceller (från steg 1,13) innehållande metagenomic DNA fosmid och pGESS (E135K) på is.
- Inokulera 10 pl av cellerna i 2 ml LB innehållande 50 | j, g / ml ampicillin och 12,5 | ig / ml kloramfenikol i en 14-ml rundbottnad röret. Inkubera vid 37 ° C med skakning vid 200 varv per minut under 4 timmar.
- Samtidigt, slå på FACS maskinen och öppna standard FACS programvara. Använd följande inställningar: munstycksspetsen diameter 70 um; Forward Scatter Area (FSC-A) känslighet, 300 V-logaritmisk förstärkning; Side Scatter Area (SSC-A) känslighet, 350 V-logaritmisk förstärkning; Fluoresceinisotiocyanat Area (FITC-A) känslighet, 450 V-logaritmisk förstärkning; tröskel parametern FSC-A värdet 5.
Obs: Typiska inställningar gesför FACS anordning som nämns i tabellen of Materials. Justera inställningarna för andra FACS enheter. - Späd metagenomic biblioteks cellerna från steg 2,2 genom tillsats av 5 | il av provet till en 5-ml rundbottnad rör innehållande 1 ml PBS.
- Placera utspädda biblioteket provet på lastningshamnen av FACS instrumentet och klicka på knappen Ladda om förvärv instrumentbrädan i FACS programvara.
- Ställ in händelsefrekvens till 1000 - 1500 händelser / s genom att klicka och styra flödet knapparna på instrumentbrädan.
- Skapa log skalas FSC-A mot log skalas SSC-A spridningsdiagram på en global kalkylblad genom att klicka på Dot Plot knappen i verktygsfältet. Justera scatter gate R1 omfatta de sing händelser (bakteriell population) med hjälp av Polygon Gate-knappen i verktygsfältet.
- Rita ett histogram med celltal kontra log skalas FITC-A i kalkylbladet genom att klicka på Histogram knappen. Justera därefter FITC spänningen från CytomeFliken Ter Inställningar på inspektör Control-fönstret så att toppen av den klockformade distributionen är mindre än 10 två av FITC-A.
- Skapa en logg skalad FSC-A vs. log FITC-En kurva genom att klicka på Dot Plot-knappen på den globala kalkylblad. Ställ en sorteringsgrind R2 på tomten med hjälp av Polygon Gate-knappen i verktygsfältet så att porten ligger mellan + 5% och -5% celler från mitten av fördelningen (totalt 10% celler runt toppen av bell- formad kurva).
- Placera en samling rör som innehåller 1,2 ml LB innehållande 50 ug / ml ampicillin och 12,5 mikrogram / ml kloramfenikol vid utloppet av FACS instrument och sortera ut 10 6 celler som uppfyller både R1 och R2 grindar.
- Ta bort uppsamlingsröret, mössa, och försiktigt virvel.
3. metagenomic Enzyme Screening
- Inkubera de sorterade cellerna (från steg 2,11) vid 37 ° C med skakning vid 200 varv per minut till dess att OD 600 når 0,5.
- Tillsätt 1 l kopiera induktions lösning för att förstärka den intracellulära fosmid antal kopior. Inkubera cellerna under ytterligare 3 h vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm.
- För att framställa cellerna för sortering, tillsätt 0,5 ml av de odlade cellerna och ett lämpligt substrat (p-nitrofenyl-acetat, p-nitrofenyl-β-D-cellobiosid, eller fenyl fosfat) in i en 14-ml rundbottnad röret vid en slutlig koncentration av 100 ^ M.
- För ett kontrollprov, tillsätt 0,5 ml av de odlade cellerna från steg 3,2 i en 14-ml rundbottnad röret. Tillsätt samma volym PBS som substrat volymen i steg 3,3.
- Inkubera de båda proverna vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm under 3 h.
- Samtidigt förbereda FACS maskin med samma konfigurationer som steg 2,3.
- Tillsätt 5 | il av cellerna (för att sortera) och kontrollceller till två 5 ml rundbottnade rör innehållande 1 ml PBS, respektive.
- Placera röret med kontroll celler på tHan laddar port av FACS och klicka på knappen Ladda om förvärv instrumentbrädan i FACS programvara. Justera händelsen frekvensen till 1000 - 3000 händelser / sek genom att styra flödeshastighet knappar på instrumentbrädan.
- Skapa log skalas FSC-A mot log skalas SSC-A spridningsdiagram genom att klicka på Dot Plot knappen på den globala kalkylblad av programvaran och justera scatter gate R1 omfatta de sing händelser (bakteriepopulationen) med Polygon Gate-knappen på verktygsfältet.
- Skapa log skalas FSC-A vs log skalas FITC-A spridningsdiagram genom att klicka på Rita knappen Dot i kalkylbladet och ange en sorteringsgrind R2 på tomten med hjälp av Polygon Gate-knappen i verktygsfältet så att mindre än 0,1% av negativa celler detekteras i R2 gate.
- Byt ut kontrollprov rör med sorterings provrör, och justera händelsen hastigheten till 1000 - 3000 händelser / sek genom att styra flödet knapparna på instrumentbrädan.
- Placera ett uppsamlingsrör innehållande 0,5ml LB vid utloppet av FACS instrument och sortera ut 10 4 celler som uppfyller både R1 och R2 grindar.
Observera: sorteringskriterium kan variera från toppen 0,1% till 5% av FITC-A i R2-grind. I detta protokoll, var top 1% cellerna upp som positiva. - Ta bort uppsamlingsröret, mössa, och försiktigt virvel.
- Sprid 0,5 ml insamlade proven på två agarplattor (90 mm petriskålar) innehållande LB, 50 | ig / ml ampicillin, 12,5 pg / ml kloramfenikol och inkubera plattan vid 37 ° C över natten.
- Om det är nödvändigt, utföra ytterligare rundor av sortering för FITC-A anrikning genom att upprepa steg 3.1-3.14.
4. Hit Urval och enzymaktivitet Bekräftelse
- Flödescytometrianalys
- Från den inkuberade plattan vid steg 3,14 väljer en koloni som visar ingen fluorescens med hjälp av en koloni väljaren under observation av 488 nm våglängd av en LED-lampan.
- Inokulera valda kolonin i en 14-ml round bottnad rör innehållande 2 ml LB innehållande 50 | j, g / ml ampicillin och 12,5 | ag / ml kloramfenikol vid 37 ° C med skakning vid 200 varv per minut till dess att dess OD 600 når 0,5.
- Tillsätt 2 l kopiera induktions lösning för att förstärka den intracellulära fosmid antal kopior. Inkubera cellerna under ytterligare 3 h vid 37 ° C med skakning vid 250 rpm.
- Bered en 14 ml rundbottnad rör och tillsätt 1 ml av de odlade cellerna (steg 4.1.3). Tillsätta ett lämpligt substrat (p-nitrofenyl-acetat, p -nitrophenyl- β -D-cellobiosid, eller fenylfosfat) vid en slutkoncentration av 100 ^ M.
- För en kontroll, tillsätt 1 ml odlade celler från steg 4.1.3 till en 14 ml rundbottnad rör och tillsätt samma volym PBS som substrat volymen i steg 4.1.4.
- Inkubera de båda proverna vid 37 ° C med skakning vid 200 rpm under 3 h.
- Samtidigt förbereda FACS maskin med samma konfigurationer som steg 2,3.
- Tillsätt 5 | il av de kontroll- och substrat behandlade celler till 5 ml rundbottnade rör innehållande 1 ml PBS, respektive.
- Placera röret innehållande kontrollcellerna på lastningshamnen av FACS-enheten och klicka på knappen Ladda om förvärv instrumentbrädan i FACS programvara. Ställ in händelsefrekvens till 1000 - 3000 händelser / sek med hjälp av Flow Rate knappar på instrumentbrädan.
- Klicka på förvärv för att mäta FITC-A.
- Sätt tillbaka kontrollprovröret med substratet behandlade provröret. Ställ in händelsefrekvens till 1000 - 3000 händelser / sek med hjälp av Flow Rate knappar på instrumentbrädan.
- Klicka på förvärv för att mäta FITC-A.
- Jämföra fluorescensen hos de två grupperna av celler genom att plotta ett histogram över cellräkning vs. log skalas FITC-A.
- Andra analyser för att bekräfta enzymaktivitet
- För ytterligare identifiering av de utvalda enzymkandidater, extrahera fosmid DNA med användning av standard-extraktion proförfaranden från de kommersiella utvinning kit och analysera nukleotidsekvensen, eller testa in vitro enzymaktivitet 6,7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De tre fenol substraten undersöktes för att identifiera nya metagenomic enzymer från en metagenome bibliotek av ocean tidvatten plana sediment i Taean, Sydkorea genom att följa det föreslagna protokollet. För bibliotekskonstruktion genomsnittliga 30 - var 40 kb metagenome sekvenser in i fosmids, som bygger på E. coli F-faktorn repliken och presenteras som en enda kopia i en cell. Notera att fosmids har använts i stor utsträckning för konstruktion av komplexa genomiska bibliotek på grund av deras stabila förökning 8.
Figur 1 visar en kort flödesschema över screeningprotokollet innefattar undanröjandet av falska positiva med negativt sortering (Figur 1 A) följt av positiv hit val med R1 och R2 sorteringsgrindar (Figur 1 B). Träffarna utvärderades genom att jämföra fluorescensen för proven med och utan substrat(Figur 1 C). I fall av p-nitrofenyl-acetat medierad screening, valdes fem kandidater av lipas bekräftas där fluorescensen hos substrat behandlade celler var högre än den för kontrollceller (figur 2 A). Trots de breda fördelningar av de tre kandidater av cellulas i fig 2 B, de visade också tydliga skillnader i genomsnittlig FITC intensitet populationerna. Fyra fosfatas kandidater visade också hög fluorescens nivå jämfört med kontrollcellerna (Figur 2 C). Ju mer fluorescens skillnaden mellan negativa och kandidatceller starkare enzymaktiviteten kan härledas eftersom fluorescens reporter PNP-GESS visar kvantitativa svar på fenolkoncentrationer 5.
I detta protokoll, endast fluorescens skillnader bekräftades med hjälp av en flödescytometri men olika identifierings analyser kan appliceras ens nämns i steg 4,2. Figur 3 visar exempel på AP identifiering 6. En utvald klon bland fyrtiosju starkt fluorescerande kolonier från screeningen sekvenserades och en ORF av kandidaten AP identifierades. ORF sätts in i en plasmidvektor bekräftades ha AP-aktivitet med flödescytometri. I figur 3, visar träffen starkare fluorescenssignal än de celler som bär tomma plasmiden (negativ). Ytterligare analys av sekvensen och in vitro enzymatisk aktivitet upptäckte att denna AP var mycket lik andra kända AP i dess enzymatiska egenskaper utom hög katalytisk aktivitet vid lägre temperaturer (35 ° C) och en anmärkningsvärd termisk instabilitet (65 ° C) inom 15 min 6 . Dessutom skärmad AP var jämförbar med kommersiellt tillgängliga AP att avlägsna terminal fosfater från enhetliga och trubbiga ändarna av linjäriserad plasmid-DNA sex.
Figur 1:. Multi Enzyme screening process (A) Borttagning av falskt positiva celler visar fluorescens utan substrat. Sorterings grinden är belägen i mitten av cellpopulationen tätheten så att grinden innefattar 10% av de totala cellerna. (B) Sortering med hög fluorescerande (FITC-A) celler (positiva) som uppfyller R1 och R2 grindar i närvaro av ett lämpligt substrat. (C) Efter valet och enkelcellisolering, var aktiviteten av kandidatenzymer undersöktes med och utan substratet (betecknad som W / och W / O-substrat, respektive). Den tydlig signal skillnaden mellan de två proverna innebär fosmid vektor cellerna innehåller mål genetisk information av intresse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Enzymaktivitet Utvärdering med användning av flödescytometri metagenomic enzymkandidater screenas genom pNP-GESS med tre olika substrat (A) p-nitrofenyl-acetat (pNPA), (B) p-nitrofenyl-β-D-cellobiosid (pNPG2), och. (C) fenylfosfat. Samtliga kandidater visar tydlig signal skillnad mellan celler med och utan substrat. Kontroller är cellerna utan deras motsvarande substrat behandling. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Alkaline Phosphatase IDENTIFIERING. vänstra panelen visar tydlig fluorescens skillnad mellan de celler som innehåller enzymet hit och en tom plasmidvektor (negativ). Till höger är fosfatas analys av celler som hyser kandidatgen fosfataset i en plasmidvektor på LB-agar innehållande 5-bromo-4-klor-3-indolylfosfat som kolorimetriskt substrat visas. Blå kolonier indikerar att de markerade cellerna innehåller metagenomic gen som kodar för ett fosfatas. Se 6 för mer information. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
| EG-nummer | Beskrivning | Antal p-nitrofenol som producerar enzymer | Antal fenol producera enzymer | |
| EG 1 </ Td> | 1,3 | Verkar på CH-CH-grupp av donatorer | - | 1 |
| oxidoreduktaser | 1,11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1,14 | Agerar på parade givare med inkorporering eller | - | 2 | |
| reduktion av molekylärt syre | ||||
| EG 2 | 2,3 | acyltransferaser | 1 | - |
| transferaser | 2,4 | glykosyltransferaser | 8 | - |
| 2,5 | Överföra alkyl- eller arylgrupper, annat än metylgrupper | 1 | 1 | |
| 2,7 | Överföra fosforinnehållande grupper | 1 | 1 | |
| 2,8 | Överföra svavelinnehållande grupper | 3 | 1 | |
| EG 3 | 3,1 | Lagen om esterbindningar | 67 | 16 |
| hydrolaser | 3,2 | glykosylaser | 75 | 21 |
| 3,4 | Lagen om peptidbindningar - peptidas | 26 | 4 | |
| 3,5 | Lagen om kol-kvävebindningar, andra än peptidbindningar | 5 | 3 | |
| 3,6 | Lagen om syraanhydrider | 4 | - | |
| 3,7 | Lagen om kol-kolbindningar | 2 | - | |
| EG 4 | 4,1 | Kol-kol lyaser | - | 3 |
| lyaser | 4,2 | Kol-syre lyaser | 1 | - |
| 4,3 | Kol-kväve lyaser | 1 | - | |
| Delsumma antal enzymer | 197 | 53 | ||
| Totalt antal enzymer (exklusive överlappande enzymer) | 211 | |||
Tabell 1: Antal enzymer som producerar p-nitrofenol eller fenol från BRENDA databas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Ökad produktionseffektivitet av biokatalysatorer är en nyckel för att lyckas med biokemiska baserad industri 9 och metagenome anses vara en av de bästa naturliga enzymkälla. I denna mening är det viktigt att screening nya enzymer från metagenome där majoriteten av de genetiska resurserna inte har undersökts 10. Flera screeningmetoder har utvecklats, vilka direkt detekterar enzymprodukter med hjälp av transkriptionsaktivatorer 11, 12 men dessa tekniker kräver specifik metabolit-responsiv transkriptionssystemet. Å andra sidan, är GESS allmänt tillämpas beroende på användning av fenol eller PNP taggade substrat. Även om de flesta av de rapporterade enzymer som producerar fenol eller PNP föreningar i BRENDA databas (tabell 1), (inklusive de tre exemplen i detta arbete) hör till hydrolas (EC nummer 3) klass enzymer, utforska mer olika fenolsubstrat och även utforma en artificiell substrat utsätta tillrikta enzymaktivitet, som alternativ av naturliga substrat, avsevärt skulle kunna utvidga tillämpningen av screeningsystemet. Observera att välja en lämplig fenol eller PNP märkt substrat är ett av de viktigaste stegen PNP-GESS ansökan sedan membranpermeabilitet och cellulära effekten av substratet avsevärt påverka screeningprotokollet. Här visar vi att industriellt viktiga tre olika typer av enzymer kan identifieras i en hög genomströmning sätt med användning av den enda screeningssystem.
Tillvägagångssättet för att använda FACS, i tillägg till high-throughput screening av metagenomic enzymer, kan också tillämpas på ingenjörstranskriptionsregulatorer (TRS) för förändrad TR specificitet. Ett exempel är en studie i vilken en AraC-variant som detekteras mevalonat i stället för arabinos isolerades med användning av FACS, och användes sedan för att screena celler som producerar mevalonat 13. Dessutom har förändringen av den särskilda karaktären hos TR tillåtet för further engineering av enzymaktivitet. Auto-reglerad TR, PcaU, var konstruerad för att detektera 3,4-dihydroxibensoat (34DHB) och appliceras sedan för att screena för dehydroshikimate dehydratas enzymer (AsbF) vid sin maximala aktivitet att omvandla endogen dehydroshikimate till 34DHB 14. Grundtanken med dessa studier är liknar den PNP-GESS, eftersom pNP-GESS använder en DmpR variant för att upptäcka PNP och visar hög genomströmning prestanda vid screening av en storskalig genetisk bibliotek. Emellertid kan specificitet engineering orsaka oavsiktliga falska positiva bland de träffar, eftersom det är möjligt att utlösa reporterexpression av andra inducerare som ett resultat av breddat specificitet. Därför skulle det vara önskvärt att undersöka ortogonaliteten hos TR svar innan TR appliceras. Å andra sidan, kan öka känsligheten och det dynamiska omfånget av TR kompensera för falsk positiv generation. Till exempel, var känsligheten hos GESS förbättras genom att sätta in optimerade RBS och terminator SEQUrenser in i systemet. Falska positiva i screeningsystem eventuellt komma från fel på den genetiska kretsen, oavsiktliga fenol kemikalier aktiverar TR, heterogena celltillväxt, och fri spridning av fenol eller PNP. De negativa urvalsprocesser av steg 2,1 - 2,9 förväntades att avlägsna falska positiva celler frigör fluorescens utan substratbehandling. Dessa falska positiva celler kan också reduceras genom att maximera signal-brusförhållandet av den genetiska kretsen. Tillsammans med RBS och terminatorteknik, användningen av M9-glukos media förbättrats avsevärt signalen (7-faldigt högre än LB-medium) i pNP-GESS 5 prestanda. Men i detta protokoll, LB användes som en kompromiss mellan den okända metagenomic genuttryck och GESS signalintensitet. Undersöker mer ömtåliga förhållanden pNP-GESS celltillväxt och substrat effekt i M9-glukos gör det möjligt att förbättra signalintensitet. Tight reglering av reaktionstiden av substraten, i steg 3,5, ärockså viktigt att förhindra falska positiva utlöses av fenol eller PNP diffusion.
GESS möjliggör omvandlingen av enzymfunktion i transkriptionsmedierad reporterproteinuttryck vid en encelliga nivå men indirekt identifiering via rapportprotein kan vara en av de medfödda begränsningarna. Så, in vitro enzymanalys och LC / GC-MS-analys av en produkt måste följas för definitiv identifiering av en förmodad enzymkandidat 6,7. det är också möjligt att använda GESS utan behov av dyra FACS-analys genom att fästa alternativa reportrar såsom antibiotikaresistensgener eller kromogena enzymer med fluorescerande reportrar. För ytterligare förbättring av Gess applikationer, är det nödvändigt att fastställa en metod för att karaktärisera enzymaktivitet och identifiera de enzymer i en hög genomströmning sätt. Tillsammans med andra teknik med hög kapacitet, såsom nästa generations sekvensering, kommer GESS vara ett vanligt strategi för protein och ENZYmig katalysatorteknik i biologi baserad industri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
