Introduction
Eine kürzlich entwickelte Hochdurchsatz - Einzelzellen - Assay - Technik ermöglicht neue Enzyme aus einer großen Genbank auf ihre funktionellen Aktivitäten 1 basierend gescreent werden. Auf Einzelzellebene, Transkriptionsproteinen regulieren eingesetzt Expression auszulösen Reportergens durch Abfühlen kleine Moleküle, die als Ergebnis eines Zielenzymaktivität erzeugt werden. Ein früher Ansatz involviert die Isolierung eines Phenol abbau Operon aus Ralstonia eutropha E2 unter Verwendung des substratinduzierte Genexpression Screening (SIGEX) Verfahren, bei dem das Substrat , die Expression eines Reporterproteins 2 induziert. NHAr von Pseudomonas putida wurde verwendet , um Benzaldehyd - Dehydrogenase 3 und lysG aus Corynebacterium glutamicum ausgewählt wurde für die Hochdurchsatz - Screening eines neuen L-Lysin-produzierender Stamm von unterschiedlichen Mutantenbibliotheken 4 verwendet.
Zuvor eine genetische Enzym screening - System (GESS) wurde als allgemein anwendbare Screening - Plattform 5 vorgeschlagen. Dieses System verwendet das Phenol-Erkennung Dimethylphenol Regler, DmpR, von P. putida. DmpR (E135K) und eine Mutante von DmpR, können auch in GESS (pNP-GESS) zum Nachweis von p - Nitrophenol (pNP) eingesetzt werden. In Gegenwart von Zielenzymen Herstellung phenolische Verbindungen, GESS in E. coli - Zellen emittiert ein Fluoreszenzsignal, das eine schnelle Trennung von Einzelzellen ermöglicht , eine Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierer verwenden (FACS). Aber die Expression des Enzyms metagenomic erscheint als schwächer zu sein, daß der herkömmliche rekombinante Enzyme; Daher wurde GESS ausgelegt phenolische Verbindungen mit maximaler Empfindlichkeit zu erfassen , indem die Kombination der ribosomalen Bindungsstelle (RBS) und Terminatorsequenzen zusammen mit optimalen Betriebszustand 5 untersuchen.
Einer der wesentlichen Vorteile von GESS ist, dass diese einzelne Methode ermöglicht es theoretisch das Screening von over als 200 verschiedene Arten von Enzymen in der BRENDA - Datenbank (Tabelle 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013,7) , indem einfach verschiedene Substrate verwendet. Es zeigte sich, dass Cellulase, Lipase gezeigt, und Methyl - Parathion Hydrolase (MPH) kann mit geeigneten Substraten von p - Nitrophenyl- Butyrat, p - Nitrophenyl-cellotrioside und Methyl - Parathion jeweils 5 unter Verwendung von pNP-GESS nachgewiesen werden. Vor kurzem wurde nachgewiesen , daß eine alkalische Phosphatase (AP), die eine der neuen Enzyme ist pNP-GESS identifiziert verwendet wird , ist das erste thermolabilen AP in kälteangepassten marine Metagenomen gefunden 6.
Hier Details des Screening - Prozesses präsentiert mit pNP-GESS die Aktivitäten von drei verschiedenen Arten von enzymes- Lipase Nachweis, Cellulase und alkalische Phosphatase -und schnell neue Kandidaten Enzyme aus einer metagenomic Bibliothek 5,6 identifizieren. Die Verfahren umfassen die Vorverarbeitung Metagenom mit pNP-GESS und Betrieb eines flow-Zytometrie Sortierer. Während die erhaltenen Treffer müssen zur weiteren Identifizierung sequenziert werden, erstreckt sich dieses Protokoll, das Verfahren auf eine Bestätigung zu den Schritten der Enzymaktivität unter Verwendung von Durchflusszytometrie.
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Protocol
1. Vorbereiten der Metagenom-Bibliothek mit pNP-GESS
- Konstruieren Sie eine Metagenom - Bibliothek in E. coli mit einem Vektor , der eine Fosmid Fosmid Bibliothek Produktions Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers 5.
- 100 ul Aliquots der Bibliothek zur Lagerung bei -70 ° C, die eine Quelle der metagenomic Bibliothekszellen ist.
Anmerkung: Die optische Dichte eines bei einer Wellenlänge von 600 nm (OD 600) dieser Bibliothek stock gemessenen Probe ist etwa 100. - Auftauen 100 ul der Vorrats metagenomic Bibliothek auf Eis und Beimpfen für 2 h mit 37 ° C inkubiert in einem 500 ml-Kolben, enthaltend 50 ml Luria-Bertani (LB) und 12,5 & mgr; g / ml Chloramphenicol.
- Ernte der Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen durch Zentrifugation bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C.
- Das Pellet schnell in 50 ml eiskaltem destilliertem Wasser (DW) und Zentrifuge bei 1000 × g für 20 min bei 4 ° C wieder.
- Resuspend das Pellet in 50 ul eiskaltem DW mit 10% (v / v) Glycerin. Verwenden Sie 50 ul dieser Zelle aliquoten für die Elektroporation.
- Legen Sie die Mischung aus elektro Zellen 50 & mgr; l und pGESS (E135K) 5 DNA (100 ng) in einer eiskalten Elektroporationsküvette und elektroporieren (1,8 kV / cm, 25 & mgr; F) die Mischung.
- Schnell 1 ml SOB-Medium mit Katabolitenrepression (SOC) Medium und die Zellen vorsichtig resuspendieren.
- Übertragen Sie die Zellen in 14 ml Rundbodenrohr mit einer Pipette und Inkubation bei 37 ° C für 1 Stunde.
- Verbreiten 500 ul der gewonnenen Zellen auf LB 20 x 20 cm quadratische Platte, die 12,5 & mgr; g / ml Chloramphenicol und 50 ug / ml Ampicillin. Inkubieren Platte bei 30 ° C für 12 Stunden.
- Schaben die Kolonien eine Zellschaber und sammeln Zellen in einem 50 ml konischen Röhrchen mit eiskalten Zelle Speichermedien.
- Zentrifuge bei 1.000 xg für 20 min bei 4 ° C. Das Pellet in 10 ml eiskaltem Zelle Speichermedieneiner OD 600 von 100 zu erreichen.
- 20 ul Aliquot der Zellen für die Lagerung bei -70 ° C.
2. Entfernen Fehlalarme aus der Metagenom-Bibliothek
- Auftauen Lager metagenomic Bibliothekszellen (aus Schritt 1.13), die Metagenom-DNA Fosmid und pGESS (E135K) auf Eis.
- Beimpfen von 10 & mgr; l der Zellen in 2 ml LB, enthaltend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol in einem 14-ml-Rundbodenröhrchen. bei 37 ° C inkubieren, bei 200 rpm für 4 Stunden unter Schütteln.
- Inzwischen schalten Sie die FACS-Maschine und öffnen Sie die Standard-FACS-Software. Verwenden Sie die folgenden Einstellungen: Düsenspitze Durchmesser, 70 & mgr; m; Forward Scatter Area (FSC-A) Empfindlichkeit, 300 V-logarithmische Verstärkung; Side Scatter Area (SSC-A) Empfindlichkeit, 350 V-logarithmische Verstärkung; Fluoresceinisothiocyanat Area (FITC-A) Empfindlichkeit, 450 V-logarithmische Verstärkung; Schwellenparameter, FSC-A-Wert 5.
Hinweis: Typische Einstellungen gegeben sindfür die FACS - Gerät in der Tabelle der Materialien erwähnt. Passen Sie die Einstellungen für andere FACS-Geräte. - Verdünne die metagenomic Bibliothekszellen aus Schritt 2.2 durch Zugabe von 5 ul der Probe auf eine 5-ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS.
- Legen Sie die verdünnte Bibliothek Probe auf die Ladeöffnung des FACS Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf dem Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software.
- Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 1.500 Veranstaltungen / sec durch Klicken und die Durchflussrate auf dem Armaturenbrett zu steuern.
- Erstellen Sie log skaliert FSC-A vs. Protokoll auf einem globalen Arbeitsblatt SSC-Streudiagramm skaliert durch Klicken auf die Dot Plot - Schaltfläche in der Werkzeugleiste. Stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett-Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon-Tor-Taste in der Werkzeugleiste zu umfassen.
- Plot ein Histogramm mit Zellzahl gegen log auf dem Arbeitsblatt FITC-A skaliert durch einen Klick auf Histogramm - Taste. Dann stellen Sie die FITC Spannung von der Cytometer Register Einstellungen auf Inspektorfenster steuern, dass die Spitze der glockenförmigen Verteilung von weniger als 10 2 von FITC-A ist.
- Erstellen Sie ein Protokoll skaliert FSC-A vs. das Protokoll FITC-A Plot, indem Sie auf dem globalen Arbeitsblatt auf dem Dot Plot-Schaltfläche klicken. Stellen Sie eine Sortier Tor R2 auf dem Grundstück das Polygon-Gate-Button in der Werkzeugleiste, so dass das Tor zwischen + 5% und -5% Zellen, die aus der Mitte der Verteilung (insgesamt 10% der Zellen rund um den Gipfel des glocken befindet förmige Kurve).
- Legen Sie eine Sammelröhrchen , das 1,2 ml LB sowohl die R1 und R2 Tore befriedigend 50 ug / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol am Ausgang des FACS Instrument und sortieren 10 6 Zellen enthält.
- Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel.
3. metagenomische Enzymscreening
- Inkubieren der sortierten Zellen (aus Schritt 2.11) bei 37 ° C mit 200 Umdrehungen pro Minute , bis die OD 600 0,5 Schütteln erreicht.
- 1 & mgr; l Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm.
- Zur Herstellung von Zellen für die Sortierung, 0,5 ml der kultivierten Zellen hinzuzufügen und ein geeignetes Substrat (p - Nitrophenyl Acetat, p - Nitrophenyl-β-D-cellobiosid oder Phenylphosphat) in einen 14-ml - Rundbodenrohr in einer Endkonzentration von 100 uM.
- Für eine Kontrollprobe mit 0,5 ml der kultivierten Zellen aus Schritt 3.2 in einen 14-ml-Rundbodenrohr. Füge das gleiche Volumen an PBS als das Substratvolumen in Schritt 3.3.
- Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln.
- Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3.
- Zugabe von 5 & mgr; l der Zellen (für die Sortierung) und Kontrollzellen zu zwei 5 ml-Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively.
- Das Röhrchen enthält Kontrollzellen auf ter Verladehafen der FACS, und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / sec durch auf dem Armaturenbrett Flow Rate Tasten steuern.
- Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log SSC-A skaliert Streudiagramm mit einem Klick auf Dot Plot - Taste auf dem globalen Arbeitsblatt der Software und stellen Sie die Streu Gate R1 die Singulett - Ereignisse (Bakterienpopulation) mit dem Polygon - Tor - Taste auf das zu umfassen Werkzeugleiste.
- Erstellen Sie log skaliert FSC-A gegen log FITC-A skaliert Streudiagramm , indem Sie auf dem Arbeitsblatt auf dem Dot Plot Schaltfläche klicken und stellen Sie eine Sortier Gate R2 auf dem Grundstück mit dem Polygon - Tor - Taste auf der Werkzeugleiste , so dass weniger als 0,1% negative Zellen sind innerhalb des R2-Gatter erkannt.
- Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Sortierprobenröhrchen und stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s durch die Strömungsgeschwindigkeit Tasten am Armaturenbrett steuern.
- Legen Sie eine Sammelröhrchen, das 0,5ml LB am Auslass des FACS - Instrument und aussortieren 10 4 Zellen erfüllt sowohl die R1 und R2 Gattern.
Hinweis: Das Sortierkriterium von oben 0,1% bis 5% des FITC-A in der R2 Gate reichen kann. In diesem Protokoll wurden obersten 1% Zellen als positive gesammelt. - Entfernen Sie die Sammelröhrchen, Kappe und sanft Wirbel.
- Verbreiten Sie die 0,5 ml gesammelten Proben auf zwei Agarplatten (90 mm Petrischalen) mit LB, 50 ug / ml Ampicillin, 12,5 ug / ml Chloramphenicol und Inkubation über Nacht die Platte bei 37 ° C.
- Falls erforderlich, zusätzliche Runden der Sortierung für FITC-A-Anreicherung durch Wiederholen der Schritte 3,1-3,14.
4. Hit Auswahl und Enzymaktivität Bestätigung
- Durchflusszytometrie-Analyse
- Von der Platte inkubiert bei Schritt 3.14, wählen Sie eine Kolonie zeigen keine Fluoreszenz eine Kolonie-Picker unter der Beobachtung von 488 nm Wellenlänge einer LED-Beleuchtung verwendet wird.
- Impfen der ausgewählten Kolonie in einem 14-ml-round Boden - Röhrchen mit 2 ml LB unter Schütteln bei 200 rpm 50 & mgr; g / ml Ampicillin und 12,5 ug / ml Chloramphenicol bei 37 ° C , enthaltend bis zu dessen OD 600 0,5 erreicht.
- In 2 ul Induktions Lösung Kopieren Sie die intrazelluläre Fosmid Kopienzahl zu verstärken. Inkubieren der Zellen für weitere 3 h bei 37 ° C mit Schütteln bei 250 Upm.
- Bereiten Sie eine 14 ml-Rundbodenrohr und 1 ml der kultivierten Zellen (Schritt 4.1.3). Hinzufügen eines geeigneten Substrats (p - Nitrophenyl Acetat, p -nitrophenyl- β -D-cellobiosid, oder Phenyl phosphat) in einer Endkonzentration von 100 uM.
- Zur Kontrolle, fügen Sie die 1 ml kultivierten Zellen aus Schritt 4.1.3 in einem 14 ml-Rundbodenrohr und das gleiche Volumen an PBS als Substrat Volumen in Schritt 4.1.4 hinzuzufügen.
- Inkubieren der zwei Proben bei 37 ° C mit bei 200 Upm für 3 h schütteln.
- Inzwischen bereiten die FACS-Maschine mit den gleichen Konfigurationen wie Schritt 2.3.
- Werden 5 ul der Kontrolle und Substrat behandelten Zellen zu 5 ml Rundbodenröhrchen mit 1 ml PBS, respectively.
- Legen Sie die Röhrchen mit Kontrollzellen auf dem Ladeanschluss des FACS-Gerät und klicken Sie auf die Schaltfläche Laden auf Acquisition Armaturenbrett des FACS-Software. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett.
- Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen.
- Bringen Sie die Steuerprobenröhrchen mit dem Substrat behandelt Probenröhrchen. Stellen Sie die Ereignisrate auf 1.000 - 3.000 Veranstaltungen / s unter Verwendung von Flow Rate Tasten auf dem Armaturenbrett.
- Klicken Sie auf Acquisition Taste FITC-A zu messen.
- Vergleichen der Fluoreszenz der beiden Gruppen von Zellen durch ein Histogramm der Zellzahl aufgetragen gegen den log FITC-A skaliert.
- Andere Tests Enzymaktivität zu bestätigen
- Zur weiteren Identifizierung der Enzymkandidaten ausgewählt, extrahieren Fosmid DNA-Standard Extraktion Pro mitverfahren aus den handelsüblichen Extraktions Kits und die Nukleotidsequenz zu analysieren, oder das Enzym in vitro Aktivität getestet 6,7.
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Representative Results
Die drei phenolischen Substrate wurden untersucht, um neue metagenomic Enzyme aus einer Metagenom Bibliothek von Ozean-Wattsedimente in Taean, Südkorea identifizieren durch das vorgeschlagene Protokoll folgen. Für die Bibliothekskonstruktion, durchschnittlich 30 bis 40 kb Metagenoms Sequenzen wurden in Fosmide eingeführt, die auf dem E. beruhen coli F - Faktor Replikon und als eine einzige Kopie in einer Zelle dargestellt. Beachten Sie, dass Fosmide haben zur Konstruktion komplexer genomischer Bibliotheken aufgrund ihrer stabilen Ausbreitungs 8 weit verbreitet.
Figur 1 zeigt ein kurzes Flußdiagramm der Screening - Protokoll , einschließlich der Entfernung von Fehlalarmen mit negativen Sortieranlage (Figur 1 A) , gefolgt von positive Trefferauswahl mit R1 und R2 Gattern (Figur 1 B) sortiert wird . Die Treffer wurden durch Vergleichen der Fluoreszenz der Proben mit und ohne Substrate bewertet(Figur 1 C). Im Falle von p - Nitrophenyl Acetat vermittelte Screening, fünf Kandidaten der Lipase wurde bestätigt , wo die Fluoreszenz des Substrats behandelten Zellen , dass höher waren als der Kontrollzellen (Abbildung 2 A). Trotz der breiten Verteilungen der drei Kandidaten von Cellulase in Abbildung 2 B, sie zeigten auch deutliche Unterschiede der durchschnittlichen FITC Intensität der Bevölkerung. Vier Phosphatase Kandidaten zeigten auch eine hohe Fluoreszenzniveau im Vergleich zu den Kontrollzellen (Abbildung 2 C). Je mehr Fluoreszenz Unterschied zwischen negativen und der Kandidatenzellen kann die stärkere Enzymaktivität von pNP-GESS seit dem Fluoreszenzreporter ableiten zeigt quantitative Antworten auf die Phenolkonzentrationen 5.
In diesem Protokoll wurden nur die Fluoreszenz Unterschiede bestätigt eine Durchflusszytometrie sondern verschiedene Identifizierungsassays unter Verwendung von a angewendet werden4,2 s in Schritt erwähnt. Abbildung 3 zeigt das Beispiel der AP Identifikation 6. Ein ausgewählter Klon unter siebenundvierzig stark fluoreszierende Kolonien aus dem Screening wurde sequenziert und ein ORF des Kandidaten AP identifiziert. Das ORF in einen Plasmidvektor inseriert wurde bestätigt Zytometrie mit Strömungs AP-Aktivität zu haben. In Abbildung 3 zeigt die Treffer stärkere Fluoreszenzsignal als die Zellen leer Plasmid tragen (negativ). Eine weitere Analyse der Sequenz und in vitro enzymatische Aktivität entdeckt , dass diese AP zu anderen bekannten APs in seiner enzymatischen Eigenschaften außer hohe katalytische Aktivität bei niedrigeren Temperaturen sehr ähnlich war (35 ° C) und eine bemerkenswerte thermische Instabilität (65 ° C) innerhalb von 15 min 6 . Darüber hinaus wurde das gesiebte AP vergleichbar Terminal Phosphaten aus bindigen und stumpfen Enden linearisierter Plasmid - DNA 6 zu kommerziell APs verfügbar zu entfernen.
Abb . 1: Multi - Enzym - Screening - Verfahren (A) Entfernung von falsch-positiven Zellen zeigt Fluoreszenz ohne Substrat. Die Sortierweiche ist in der Mitte der Zellpopulationsdichte liegt, so daß das Gatter 10% der gesamten Zellen enthält. (B) Sortieren hohe fluoreszierend (FITC-A) Zellen (positive) erfüllt , R1 und R2 Gattern in Gegenwart eines geeigneten Substrats. (C) Nach der Auswahl und der Einzelzellisolierung, die Aktivität der Kandidaten - Enzyme mit und ohne das Substrat untersucht wurde (bezeichnet als W / und W / O - Substrate, respectively). Die klare Signaldifferenz zwischen den beiden Proben impliziert der Fosmid Vektor der Ziel genetische Information von Interesse Zellen enthält. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Enzymaktivität Bewertung unter Verwendung von Durchflusszytometrie metagenomische Enzymkandidaten gescreent von pNP-GESS mit drei verschiedenen Substraten (A) p - Nitrophenyl Acetat (pNPA), (B) p - Nitrophenyl-β-D-cellobioside (pNPG2), und. (C) phenylphosphat. Alle Kandidaten zeigen deutliche Signaldifferenz zwischen den Zellen mit und ohne Substrat. Die Kontrollen sind die Zellen ohne ihre entsprechenden Substratbehandlung. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Alkaline Phosphatase Identification. Linke Tafel zeigt klar Fluoreszenz Unterschied zwischen den Zellen , die das Enzym enthält , getroffen und ein leeres Plasmid - Vektor (negativ). Auf der rechten Seite Phosphatase-Assays von Zellen, die Phosphatase Kandidatengens in einem Plasmidvektor auf LB-Agar, der 5-Brom-4-chlor-3-indolyl phosphat als kolorimetrische Substrat beherbergt gezeigt. Blaue Kolonien zeigen, dass die ausgewählten Zellen die metagenomic Gen, codierend ein Phosphatase enthalten. Siehe 6 für weitere Details. Bitte hier klicken , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| EG - Nummer | Beschreibung | Anzahl der p-nitrophenol Herstellung Enzyme | Anzahl der Phenol produziert Enzyme | |
| EG 1 </ Td> | 1.3 | Wirkung auf die CH-CH-Gruppe von Spendern | - | 1 |
| Oxidoreduktasen | 1.11 | Peroxygenase | 2 | - |
| 1.14 | Acting auf gepaart Spendern, unter Einbeziehung oder | - | 2 | |
| Reduktion von molekularem Sauerstoff | ||||
| EC 2 | 2.3 | Acyltransferasen | 1 | - |
| Transferasen | 2.4 | Glycosyltransferasen | 8 | - |
| 2.5 | Transferieren Alkyl- oder Arylgruppen, andere als Methylgruppen, | 1 | 1 | |
| 2.7 | Übertragen von phosphorhaltigen Gruppen | 1 | 1 | |
| 2.8 | Übertragen von schwefelhaltigen Gruppen | 3 | 1 | |
| EC 3 | 3.1 | Gesetz über Esterbindungen | 67 | 16 |
| Hydrolases | 3.2 | Glycosylasen | 75 | 21 |
| 3.4 | Gesetz über Peptidbindungen - Peptidase | 26 | 4 | |
| 3.5 | Gesetz über die Kohlenstoff-Stickstoff-Bindungen, andere als Peptidbindungen | 5 | 3 | |
| 3.6 | Gesetz über die Säureanhydride | 4 | - | |
| 3.7 | Gesetz über die Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen | 2 | - | |
| EC 4 | 4.1 | Kohlenstoff-Kohlenstoff-Lyasen | - | 3 |
| Lyasen | 4.2 | Kohlenstoff-Sauerstoff-Lyasen | 1 | - |
| 4.3 | Kohlenstoff-Stickstoff-Lyasen | 1 | - | |
| Subtotal Anzahl von Enzymen | 197 | 53 | ||
| Gesamtzahl der Enzyme (ohne überlappte Enzyme) | 211 | |||
Tabelle 1: Die Anzahl der Enzyme , die p - Nitrophenol oder Phenol aus der BRENDA - Datenbank erzeugen.
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Discussion
Eine Erhöhung der Produktionseffizienz von Biokatalysatoren ist ein Schlüssel für den Erfolg von bio-chemischen Industrie Basis 9 und Metagenom gilt als einer der besten natürlichen Enzymquelle. In diesem Sinne ist es wichtig , neue Enzyme aus der Metagenoms Screening wo die Mehrheit der genetischen Ressourcen 10 nicht erforscht. Mehrere Screening - Verfahren entwickelt worden , die Enzymprodukte unter Verwendung von Transkriptionsaktivatoren 11, 12 , aber diese Techniken erfordern spezifische Metaboliten ansprechenden Transkriptionssystem direkt erfassen. Auf der anderen Seite ist GESS breit anwendbar in Abhängigkeit von der Verwendung von Phenol oder pNP markierten Substraten. Obwohl die meisten der berichteten Enzyme produzieren Phenol oder pNP Verbindungen in BRENDA - Datenbank (Tabelle 1), (einschließlich der drei Beispiele in dieser Arbeit) gehören zur Hydrolase (EC - Nummer 3) Klasse Enzyme, Erforschung vielfältiger phenolischen Substrate und Gestaltung auch eine künstliche Substrat unterworfen wirdZielenzymaktivität, als Alternativen der natürlichen Substrate, deutlich die Anwendbarkeit des Screening-System erstrecken. Beachten Sie, dass ein entsprechendes Phenol oder pNP getaggt Substrat der Wahl einer der entscheidenden Schritte, da die Membrandurchlässigkeit und zelluläre Wirkung des Substrats erheblich das Screening-Protokoll beeinflussen pNP-GESS-Anwendung ist. Hier zeigen wir, dass industriell wichtige drei verschiedene Typen von Enzymen können in einem Hochdurchsatz-Weise unter Verwendung des einzigen Screening-System identifiziert werden.
Der Ansatz von FACS, zusätzlich zu dem Hochdurchsatz-Screening von Metagenom-Enzyme können auch mit technischem Transkriptionsregulatoren (TRS) für veränderte TR Spezifität angewendet werden. Ein Beispiel ist eine Studie , in der eine AraC - Variante , die Mevalonat anstelle von Arabinose detektiert wurde mit FACS isoliert und dann in Rasterzellen verwendet Herstellung Mevalonat 13. Auch hat die Veränderung der Spezifität von TRs für furth erlaubter Technik der Enzymaktivität. Auto-regulierten TR, PcaU, konstruiert wurde 3,4-dihydroxybenzoat (34DHB) zu erfassen und dann Dehydroshikimat Dehydratase - Enzyme (AsbF) bei ihrer maximalen Aktivität der Umwandlung von endogenem Dehydroshikimat zu 34DHB 14 zu screenen aufgetragen. Das Grundkonzept dieser Studien ist ähnlich dem von pNP-GESS, da pNP-GESS eine DmpR Variante benutzt pNP und zeigt eine hohe Durchsatzleistung in Screening von einer großen genetischen Bibliothek zu detektieren. Jedoch kann die Spezifität Engineering verursachen unbeabsichtigte Fehlalarme zu den Hits, wie es möglich ist, Reporterexpression von anderen Induktoren als Folge der erweiterten Spezifität auszulösen. Daher wäre es wünschenswert, die Orthogonalität von TR Reaktion zu untersuchen, bevor der TR angelegt wird. Auf der anderen Seite könnte die Empfindlichkeit und Dynamikbereich des TR Erhöhung falsch positive Generation kompensieren. Zum Beispiel wurde die Empfindlichkeit von GESS verbessert durch optimierte RBS Einfügen und Terminator sequschiede in das System. Falsch positive Ergebnisse des Screening-System möglicherweise kommen aus Störung des genetischen Schaltung, unbeabsichtigte phenolische Chemikalien die TR, heterogene Zellwachstum und die freie Diffusion von Phenol oder pNP aktivieren. Die negativen Selektionsprozesse der Schritte 2,1-2,9 erwartet wurden falsch-positive Zellen ohne Substrat Ablösebehandlung Fluoreszenz zu entfernen. Diese falsch-positiven Zellen können auch durch Maximieren des Signal-Rausch-Verhältnis des genetischen Schaltung reduziert werden. Zusammen mit dem RBS und Terminator - Engineering, die Verwendung von M9-Glucosemedium signifikant verbessert das Signal (7-fach höher als LB - Medien) in pNP-GESS Leistung 5. Aber in diesem Protokoll LB wurde als Kompromiss zwischen dem unbekannten metagenomic Genexpression und GESS Signalintensität verwendet. Die Untersuchung empfindlicher Bedingungen von pNP-GESS Zellwachstum und Substrateffekt in M9-Glucose ermöglicht die Signalintensität zu verbessern. Enge Regulierung der Reaktionszeit der Substrate in Schritt 3.5, istauch wichtig, Fehlalarme durch Phenol oder pNP Diffusion ausgelöst zu verhindern.
GESS ermöglicht die Umwandlung von Enzymfunktion in Transkriptions-vermittelte Reporterproteinexpression in einer Einzelzellebene, aber die indirekte Identifizierung über Reporterprotein eine der inneren Begrenzungen sein könnte. So, in vitro Enzymassay und LC / GC-MS - Analyse eines Produkts muss zur eindeutigen Identifizierung eines mutmaßlichen Enzymkandidaten 6,7 folgen. Auch ist es möglich, GESS für teure FACS-Analyse ohne die Notwendigkeit zu verwenden, indem alternative Reporter, wie beispielsweise Antibiotikaresistenzgene oder chromogene Enzyme mit fluoreszierenden Reportern befestigen. Zur weiteren Verbesserung der GESS Anwendungen ist es notwendig, ein Verfahren zur Charakterisierung der Enzymaktivität und zu identifizieren, die Enzyme in einer Hochdurchsatz-Art und Weise herzustellen. Zusammen mit anderen Hochdurchsatz-Technologien, wie der nächsten Generation Sequenzierung, wird GESS sein eine weit verbreitete Strategie für Protein und Enzymir Katalysatortechnik in der Biologie-basierten Industrie.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
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